Summary
Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.
Abstract
Le poisson-zèbre forme deux structures rénales au cours de sa vie. Le pronephros (rein embryonnaire) se forme au cours du développement embryonnaire et commence à fonctionner 2 jours après la fécondation. Composé de seulement deux néphrons, le pronephros sert de seul rein pendant la vie larvaire jusqu’à ce que plus de fonction rénale soit nécessaire en raison de l’augmentation de la masse corporelle. Pour faire face à cette demande plus élevée, le mésonéphros (rein adulte) commence à se former pendant la métamorphose. Les nouveaux néphrons primaires fusionnent avec les pronéphros et forment des lumens connectés. Ensuite, les néphrons secondaires fusionnent avec les néphrons primaires (et ainsi de suite) pour créer un réseau de branchement dans les mésonéphros. La grande majorité de la recherche est axée sur les pronéphros en raison de la facilité d’utilisation des embryons. Ainsi, il est nécessaire de développer des techniques pour étudier les larves et les poissons juvéniles plus âgés et plus gros afin de mieux comprendre le développement des mésonéphros. Ici, un protocole d’hybridation in situ pour l’analyse de l’expression génique est optimisé pour la pénétration de la sonde, le lavage des sondes et des anticorps, et le blanchiment des pigments pour mieux visualiser le mésonéphros. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée pour marquer les cellules progénitrices et les tubules distaux des néphrons naissants. Ce protocole comble une lacune dans la recherche sur les mésonéphros. Il s’agit d’un modèle crucial pour comprendre comment les nouveaux tissus rénaux se forment et s’intègrent aux néphrons existants et fournir des informations sur les thérapies régénératives.
Introduction
L’embryon de poisson-zèbre est un modèle important pour étudier le développement tissulaire en raison de sa petite taille, de sa transparence, des outils disponibles et de sa survie sans se nourrir jusqu’à cinq jours1,2. Il a grandement contribué à la compréhension du développement des reins et à la conservation entre le poisson-zèbre et les mammifères3,4,5. Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des fluides, la filtration du sang et l’excrétion des déchets6. Le néphron, l’unité fonctionnelle du rein, comprend un filtre sanguin relié à un long tubule. Chez le poisson-zèbre, deux structures rénales se forment tout au long de sa vie. Le pronephros (le rein embryonnaire temporaire) se forme d’abord au cours du développement précoce. Il se compose de deux néphrons courant le long de l’axe antérieur-postérieur et devient fonctionnel environ 2 jours après la fécondation (dpf). L’utilité du pronephros réside dans sa simplicité, n’ayant que deux néphrons qui sont pour la plupart linéaires et faciles à visualiser (bien que le tubule alambiqué proximal commence à s’enrouler à trois dpf)3. Cela a facilité non seulement l’étude de son développement précoce à partir du mésoderme intermédiaire, mais aussi le modèle de segmentation et la réparation des tubules7,8.
L’utilité du poisson-zèbre devient limitée après cinq dpf, lorsque le jaune est diminué et que les larves dépendent de l’alimentation du système aquatique9. Vers l’âge de 2 semaines, les larves subissent une métamorphose en juvéniles, où de nouveaux tissus se forment et d’anciens tissus sont perdus et/ou réorganisés9. C’est aussi à ce moment-là que le mésonéphros (le rein adulte permanent) se forme10,11,12. Le premier néphron adulte se forme près de la sixième somite et fusionne avec le tubule distal précoce du pronephros. Des néphrons supplémentaires sont ajoutés postérieurs à cette position dans un premier temps, mais aussi vers l’avant plus tard. Les néphrons primaires de cette première onde fusionnent avec les tubules des pronephros et partagent une lumière commune pour déposer leurs déchets. Les néphrons secondaires se forment dans l’onde suivante et fusionnent avec les néphrons primaires. Ce processus répétitif crée un mésonéphros ramifié, un peu semblable au rein de mammifère. Vraisemblablement, le pronephros finit par perdre son identité de tubule et devient deux canaux collecteurs majeurs où tous les néphrons drainent leurs déchets13.
Avant la formation du premier néphron adulte, des cellules progénitrices uniques commencent à apparaître chez les larves d’environ 4 mm (longueur totale) (~ 10 dpf). Ces cellules, qui sont marquées dans la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), adhèrent aux pronéphros et semblent migrer vers de futurs sites de néphrogenèse. Les cellules individuelles fusionnent en grappes, qui se différencient en nouveaux néphrons12. On ne sait pas où résident ces cellules ou quels gènes elles expriment avant le début de la mésonéphrogenèse.
Comprendre le développement des mésonéphros fournit des informations sur le rein des mammifères d’une manière que les pronéphros ne peuvent pas. Ceux-ci incluent la formation d’agrégats néphrogéniques à partir de cellules progénitrices uniques, l’intégration fonctionnelle de nouveaux néphrons avec les cellules existantes et la morphogenèse ramifiée. Cependant, il y a des limites à l’étude du développement postmbryonique. Les larves sont moins transparentes en raison de leur plus grande taille et de leur pigmentation. La chronologie du développement n’est pas synchrone entre les animaux individuels et dépend fortement de facteurs environnementaux, tels que l’alimentation et l’encombrement9,14. Bien qu’il existe des réactifs knockdown, ils sont moins efficaces chez les larves que chez les embryons15. Dans ce protocole, une méthode d’hybridation in situ pour déterminer l’expression des gènes au cours du développement du mésonephros du poisson-zèbre est décrite. Plusieurs étapes sont optimisées pour augmenter la visualisation des mésonéphros et la pénétration et le lavage de la sonde et de l’anticorps. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée avec une sonde pour l’EGFP pour marquer les cellules progénitrices uniques, les agrégats néphrogéniques et les tubules distaux des néphrons naissants. Cette méthode fournira une compréhension plus approfondie du développement des mésonéphros et un aperçu des thérapies régénératives.
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Protocol
L’utilisation de larves et de juvéniles de poisson zèbre est approuvée par l’IUP IACUC (protocole #02-1920, #08-1920). Les détails du contenu de la solution sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Élever des larves
REMARQUE: Il faudra jusqu’à 21 jours ou plus pour élever les larves et les juvéniles au stade d’intérêt.
- Installez le poisson-zèbre adulte pour qu’il s’accouple en ajoutant 1 poisson mâle et 1 poisson femelle dans un aquarium d’accouplement en fin d’après-midi après leur dernier repas.
REMARQUE: Tous les couples de poissons ne s’accouplent pas. Commencez par mettre en place 20 paires pour déterminer le taux d’accouplement et ajustez-le en conséquence dans les expériences futures. - Le lendemain, après la fin de l’accouplement des poissons (vers 13 heures), collectez les embryons avec un milieu E3 dans des plaques de Pétri.
- Assurez-vous qu’il n’y a pas plus de 30 embryons par plaque.
- Enlevez les débris (comme les matières fécales) des plaques de Petri et ajoutez 20 mL de milieu E3.
- Incuber à 28,5 °C pendant 1 jour.
- Remettez le poisson-zèbre adulte dans le système aquatique.
- À 1 dpf, remplacez le support E3 par du E3 frais.
- Incuber à 28,5 °C pendant 4 jours supplémentaires jusqu’à 5 dpf.
- Mettez un écran de 400 μm dans un réservoir de 2,8 L et remplissez-le de 2 cm d’eau système.
- Ajouter les 5 larves dpf de 1 plaque (jusqu’à 30 larves au total).
- Mettez le réservoir dans le système aquatique, mais ne démarrez pas le débit d’eau.
- Nourrissez les larves avec 4 mL de poudre deux fois par jour jusqu’à 14 dpf.
- À 6 dpf, commencez le débit d’eau à 1 goutte à goutte par seconde.
REMARQUE: Vérifiez le débit d’eau quotidiennement et ajustez-le en conséquence. - À 8 dpf, augmentez le débit d’eau à un flux lent et régulier.
- À 14 dpf, nourrissez des crevettes en saumure vivantes en plus de la nourriture en poudre.
2. Jour 1 - 2: Fixation des larves
- Retirez un réservoir de larves au moment souhaité.
- Remplissez une plaque de Petri avec 20 mL d’eau système.
- Utilisez un filet à mailles fines pour ramasser doucement les larves et les amener à la surface de l’eau.
- Coupez l’extrémité d’une pipette de transfert pour donner une ouverture plus large et transférez les larves sur la plaque de Pétri. La plus grande bouche de pipette permet le transfert de plusieurs petites larves ou de quelques plus grosses à la fois.
- Ajouter 2 mL de tricaïne (2%, pH 7 stock) pour immobiliser les larves.
- Une fois que les larves ont cessé de bouger, retirez la majeure partie de l’eau et ajoutez 10 ml de tricaïne. Attendez 15 min pour que les larves soient euthanasiées.
- Facultatif: Pour les juvéniles de plus de 8 mm, coupez la tête et la queue avec une lame de rasoir (après euthanasie) sous un microscope à dissection pour améliorer la pénétration de la solution de fixation. Assurez-vous d’enregistrer la longueur totale de chaque animal avant de couper la tête et la queue et d’isoler chacun dans sa propre plaque de Pétri. Reportez-vous à l’étape 3 pour savoir comment mesurer les animaux.
- Remplacer la tricaïne par 20 mL de solution fixatrice (4% de paraformaldéhyde, 1% de DMSO). Remettez le couvercle sur la plaque de Petri et basculez lentement dans une hotte.
REMARQUE: Il est important d’utiliser une plate-forme à bascule. Une plate-forme tremblante avec un mouvement circulaire entraînera la courbure de l’axe de l’animal. Utilisez uniquement une solution de fixation fraîche (non congelée préfabriquée).
ATTENTION: La solution de fixation contient du paraformaldéhyde, qui est un cancérogène probable. Utilisez une hotte (ou un masque) et des gants pour mesurer la poudre. - Après 30 min, remplacez la solution de fixation par une nouvelle solution de fixation.
- Recueillir la solution de fixation utilisée dans un conteneur à déchets séparé pour une élimination appropriée.
- Transférer les larves dans un tube de 50 mL contenant 25 mL de solution de fixation fraîche.
- Assurez-vous que le bouchon est serré et basculez lentement à 4 °C pendant 2 jours. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.
3. Jour 3 : Mesure des larves
- Dans une hotte, remplacer la solution de fixation par 20 mL de PBST.
- Transférer les larves dans une plaque de Pétri.
- Placez une règle plate sur un microscope à dissection et placez la plaque de Petri sur la règle.
- Utilisez un manipulateur de cils pour déplacer chaque larve sur la règle afin de mesurer sa longueur totale (du museau à l’extrémité de la nageoire caudale) (Figure 1).
- Combiner plusieurs larves de longueurs similaires (p. ex. 5,0 mm et 5,1 mm) en un flacon en verre de 5,5 mL, jusqu’à 10 larves par flacon.
4. Jour 3 - 4: Déshydratation
- Remplacez le PBST par 4 mL de méthanol à 100 %. Faire basculer le flacon pendant 5 min à température ambiante.
- Remplacer le méthanol par du méthanol frais et de la roche pendant 5 min. Répétez une fois de plus.
- Conserver le flacon à -20 °C pendant 2 jours. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.
5. Jour 5 : Réhydratation
- Réchauffer le flacon à température ambiante.
- Remplacer le méthanol par 4 mL de 75 % de méthanol/25 % de PBST. Rocher pendant 5 min à température ambiante.
- Remplacer la solution à l’étape 5.2 par 4 mL de méthanol à 50 % /50 % de PBST et de la roche pendant 5 min.
- Remplacer la solution à l’étape 5.3 par 4 mL de méthanol à 25 % /75 % de PBST et de la roche pendant 5 min.
- Remplacez la solution à l’étape 5.4 par 4 mL de PBST et de la roche pendant 10 min.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
6. Jour 5 : Digestion de la protéinase K
- Remplacer le PBST par 2 mL de la solution de protéinase K (20 μg/mL, concentration finale de DMSO à 1 % dans le PBST) et la roche à température ambiante pendant 30 min.
REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm auront besoin d’un temps d’incubation plus long et / ou d’une concentration plus élevée de protéinase K. Le temps exact et la concentration devront être déterminés empiriquement. Commencez par une augmentation de 10 minutes du temps d’incubation pour chaque 0,5 mm de plus de 6 mm. - Remplacer la solution de protéinase K par 4 mL de PBST et de roche pendant 10 min.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Remplacer le PBST par 4 mL de solution de fixation fraîche et de la roche pendant 1 h. Il est possible d’incuber plus longtemps à 4 °C pour plus de commodité.
7. Jour 5 : Blanchiment
- Remplacer la solution de fixation par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Transférer les larves dans une plaque de 6 puits (jusqu’à 10 larves par puits).
- Remplacez le PBST par 3 mL de solution de blanchiment fraîche.
- Rock à température ambiante et surveillez la pigmentation sous un microscope à dissection toutes les 5 minutes. Recherchez la disparition de la pigmentation le long du mésonéphros (dorsale à la vessie natatoire et à l’intestin).
REMARQUE: Pour les larves jusqu’à 6 mm de long, il faudra jusqu’à 20 minutes pour blanchir la pigmentation entourant les mésonéphros. Ne blanchissez pas plus longtemps que nécessaire pour préserver l’intégrité des larves. - Transférez les larves dans un flacon en verre.
- Remplacer la solution de blanchiment par 4 mL de PBST. Rock pendant 10 min.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Remplacer le PBST par 4 mL de solution de fixation fraîche et de la roche pendant 1 h. Il est possible d’incuber plus longtemps à 4 °C pour plus de commodité.
8. Jour 5 : Préhybridisation
REMARQUE: Pour les étapes effectuées à 70 ° C, il est important de travailler rapidement pour minimiser le refroidissement du flacon.
- Remplacer la solution de fixation par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Remplacer le PBST par 4 mL de la solution Hyb- et la roche à température ambiante pendant 10 min.
ATTENTION: Les solutions Hyb-, Hyb+ et sonde contiennent du formamide, qui peut irriter la peau. Utilisez des gants pour manipuler ces solutions. - Remplacez l’Hyb- par 4 mL d’Hyb- frais et de roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Collectez les solutions Hyb-, Hyb+ et sonde usagées dans un conteneur à déchets séparé pour une élimination appropriée.
- Remplacez le Hyb- par 4 mL de la solution Hyb+.
- Incuber le flacon à 70 °C pendant la nuit.
- Diluer la sonde EGFP-fluorescéine 1:100 dans 500 μL d’Hyb+ et l’incuber O/N à 70 °C.
REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour la synthèse de la sonde.
9. Jour 6 : Hybridation de sonde
- Remplacer la solution Hyb+ dans le flacon par la sonde préchauffée et incuber à 70 °C pendant la nuit.
REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm ont besoin de 2 jours d’incubation. - Préchauffez le tampon de lavage, 2x SSCT et 0,2x SSCT solutions à 70 °C pendant la nuit.
10. Jour 7 : Lavage de la sonde
- Remplacer la sonde par 4 mL de tampon de lavage préchauffé et incuber à 70 °C pendant 30 min.
- Recueillir la sonde usagée dans un conteneur à déchets séparé pour une élimination appropriée.
- Remplacer le tampon de lavage par 4 mL de tampon de lavage frais et incuber à 70 °C pendant 30 min.
- Remplacez le tampon de lavage par 4 mL de la solution préchauffée 2x SSCT et incubez-le à 70 °C pendant 15 min.
- Ajouter 50 mL de SSCT 0,2x préchauffé dans un tube de 50 mL.
- Insérez une passoire à cellules (100 μm) dans le haut du tube. Assurez-vous que la passoire cellulaire est poussée jusqu’à ce qu’elle s’arrête.
- Transférez les larves du flacon en verre dans la passoire cellulaire. Assurez-vous que les larves sont immergées dans le tampon et incubent à 70 °C pendant 2 h.
- Préparez un nouveau tube contenant 50 mL de SSCT 0,2x préchauffé.
- Transférer la crépine de l’étape 10.4.2 dans le nouveau tube de 0,2x SSCT et incuber à 70 °C pendant 2 h.
- Répétez l’étape 10.5 une fois de plus.
11. Jour 7 : Blocage
- Transférer les larves dans un nouveau flacon en verre et les refroidir à température ambiante.
- Remplacez le SSCT 0,2x par 4 mL de 67% 0,2x SSCT /33% MABT et de la roche à température ambiante pendant 10 min.
- Remplacer la solution à l’étape 11.2 par 4 mL de 33% 0.2x SSCT/67% MABT et roche pendant 10 min.
- Remplacer la solution de l’étape 11.3 par 4 mL de MABT et de roche pendant 10 min.
- Remplacer le MABT par 4 mL de MABT frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Remplacer le MABT par 4 mL de la solution bloquante et incuber à 4 °C pendant la nuit. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.
12. Jour 8 - 9: Incubation d’anticorps
- Diluer l’anticorps anti-fluorescéine 1:5 000 dans une solution bloquante de 500 μL.
- Remplacer la solution bloquante par la solution d’anticorps et incuber à 4 °C pendant 2 jours. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.
- Faire tourbillonner le flacon deux fois par jour pour agiter les larves.
REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm ont besoin de 1 à 2 jours d’incubation supplémentaires.
- Faire tourbillonner le flacon deux fois par jour pour agiter les larves.
13. Jour 10 - 11: Lavage des anticorps
- Remplacer la solution d’anticorps par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Transférer les larves dans un tube de 50 mL.
- Ajouter 40 mL de PBST2. Posez le tube sur le côté et basculez à 4 °C pendant la nuit.
- Remplacez le PBST2 par 40 mL de PBST2 frais et faites basculer à 4 °C pendant la nuit. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.
REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm ont besoin de 1 à 2 jours de lavage supplémentaires.
14. Jour 12 : Coloration
- Transférer les larves dans une assiette de 6 puits.
- Remplacez le PBST2 par 3 mL de tampon de coloration et de roche à température ambiante pendant 5 min.
- Remplacez le tampon de coloration par 3 mL de tampon de coloration frais et de roche pendant 5 min. Répétez une fois de plus.
- Remplacez le tampon de coloration par 3 mL de la solution de coloration. Couvrez avec du papier d’aluminium et surveillez la coloration au cours des prochaines heures.
- Pour les sondes à signal faible, incuber à 4 °C pendant la nuit et remplacer la solution de coloration par une solution de coloration fraîche une fois entre les deux.
- Lorsque l’intensité de coloration souhaitée est atteinte, remplacez la solution de coloration par 3 mL de la solution d’arrêt et de la roche pendant 30 min.
- Remplacer la solution d’arrêt par 3 mL de solution d’arrêt fraîche et de roche pendant 30 min. Répétez une fois de plus.
- Transférer les larves dans un nouveau flacon en verre et remplacer la solution d’arrêt par 4 mL de solution de fixation fraîche et incuber pendant 1 h à température ambiante. Il est possible d’incuber plus longtemps à 4 °C pour plus de commodité.
- Conservez les larves dans la solution fixatrice dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à un an.
15. Jour 12 : Imagerie
- Remplacer la solution de fixation par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.
- Transférer les larves dans une assiette de 6 puits.
- Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.
- Remplacer le PBST par 3 mL de glycérol à 50 % (dans le PBST) et de la roche pendant 10 min.
- Remplacer la solution à l’étape 15.4 par 3 mL de glycérol à 100% sans bascule pendant 10 min.
- Utilisez un microscope à dissection pour imager les larves directement dans la plaque à 6 puits ou transférez les larves dans une lame de dépression à l’image sous un microscope composé. Utilisez un manipulateur de cils pour orienter les larves.
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Representative Results
En utilisant la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), il a été démontré que ce protocole d’hybridation in situ est efficace pour marquer les cellules progénitrices rénales et diverses structures néphroniques au cours du développement du mésonéphros. Comme prévu, le système nerveux central est également étiqueté dans cette lignée transgénique (non montré). Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 mm, dorsal au pronéphros (figure 2A), et le tubule distal de ce néphron est marqué par EGFP10,12. Des amas de progéniteurs sont présents à ce stade et plus tard (Figure 2A-B, pointes de flèche), et les cellules progénitrices uniques sont également marquées (Figure 2C). Cette méthode fournit un outil supplémentaire dans l’étude du développement rénal et aide à faire la lumière sur la compréhension du rein humain.
Figure 1 : Mesure des larves. Les larves fixes dans une plaque de Pétri sont placées sur une règle plate. Sous un microscope à dissection, les larves sont mesurées et séparées par des groupes de tailles similaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Développement du mésonéphros. À environ 5,2 mm dans la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), le premier néphron mésonéphrique est formé dorsalement à pronephros et à la vessie natatoire (SB) (A). Des amas de cellules progénitrices sont présents au cours du développement du mésonéphros (A-B, pointes de flèche) en plus des cellules progénitrices uniques (C, support). Chez les juvéniles plus grands, une coloration de fond peut se produire dans les somites (C, flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode d’hybridation in situ décrite ici vise à étudier le développement du mésonéphros. Cependant, il peut être appliqué pour étudier le développement d’autres tissus et organes pendant la métamorphose, tels que l’intestin, le système nerveux, les écailles et la pigmentation14. Des sondes peuvent être générées pour des gènes endogènes ou des marqueurs fluorescents dans des lignées transgéniques.
Il est essentiel que les larves restent intactes afin d’observer les organes et les tissus dans leur contexte d’origine. Pour conserver l’intégrité des tissus, il est important de minimiser le temps de traitement par la protéinase K. Il est important de déterminer le meilleur temps de traitement pour chaque nouveau lot d’enzyme. Alternativement, l’acétone peut être utilisée à la place de la protéinase K pour améliorer l’intégrité des tissus16. Un blanchiment excessif réduit également l’intégrité des tissus. Un blanchiment minimal et le fait de permettre aux yeux de conserver une certaine pigmentation aident à visualiser les larves pendant les lavages. Il est fréquent que les yeux tombent pendant l’étape d’hybridation, ce qui est un indicateur de fragilité tissulaire. L’utilisation de DMSO avec la solution de fixation et de protéinase K est cruciale pour la pénétration tissulaire17.
Une limitation de cette méthode est la mauvaise pénétration des réactifs chez les gros animaux. Pour améliorer la pénétration, la tête et la queue peuvent être enlevées avec une lame de rasoir avant la fixation17. L’intestin peut être retiré avec une pince à épiler fine et des aiguilles en tungstène après fixation pour permettre un accès direct des réactifs au mésonéphros. Les sondes longues (supérieures à 1 Ko) peuvent avoir une mauvaise pénétration du tissu, mais elles peuvent être hydrolysées en fragments courts (environ 0,3 Ko) pour améliorer la pénétration18. Pour les sondes à signaux faibles, des sondes de contrôle avec la séquence de détection peuvent être utilisées pour différencier le signal d’arrière-plan du signal de la sonde. Les animaux plus gros auront une coloration de fond plus élevée des somites (Figure 2C, flèches). Cependant, cela peut être minimisé avec des lavages plus longs de la sonde et des anticorps.
Le protocole ici peut également être appliqué à des tissus et organes disséqués et isolés, tels que le rein de poisson zèbre adulte12,19. Bien qu’il existe des descriptions publiées de protocoles similaires9,16, aucun d’entre eux ne décrit l’ensemble du processus, de l’élevage des larves à l’hybridation in situ, avec ce niveau de détail. Par conséquent, cette méthode fournit un outil supplémentaire pour déchiffrer le développement du rein des vertébrés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Le financement a été fourni par la Pennsylvania Academy of Science, le Commonwealth of Pennsylvania Biologists et l’Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology et Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) a été fournie par le Dr Neil Hukriede (Université de Pittsburgh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
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