Summary
Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.
Abstract
Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros'a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros'ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.
Introduction
Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşur. Zebra balıklarında, yaşamı boyunca iki böbrek yapısı oluşur. Pronephros (geçici embriyonik böbrek) ilk olarak erken gelişim sırasında oluşur. Ön-arka eksen boyunca çalışan iki nefrondan oluşur ve döllenmeden (dpf) yaklaşık 2 gün sonra işlevsel hale gelir. Pronephros'un faydası basitliğinde yatmaktadır, çoğunlukla doğrusal ve görselleştirilmesi kolay sadece iki nefrona sahiptir (proksimal dolambaçlı tübül üç dpf'de sarmal yapmaya başlasa da)3. Bu sadece ara mezodermden erken gelişiminin çalışmalarını değil, aynı zamanda segmentasyon deseni ve tübül onarımını da kolaylaştırmıştır7,8.
Zebra balıklarının kullanışlılığı, yumurta sarısı azaldığında ve larvalar su sisteminde beslenmeye dayandığında beş dpf'den sonra sınırlı hale gelir9. Yaklaşık 2 haftalıkken larvalar, yeni dokuların oluştuğu ve eski dokuların kaybolduğu ve / veya yeniden düzenlendiği gençlere metamorfoz geçirir9. Bu aynı zamanda mezonephros (kalıcı yetişkin böbreği) 10,11,12 oluşturur. İlk yetişkin nefron altıncı somit yakınında oluşur ve pronephros distal erken tübül ile kaynaşır. Ek nefronlar başlangıçta bu konuma arka olarak eklenir, ancak daha sonra ön konuma da eklenir. Bu ilk dalgadaki birincil nefronlar pronephros tübüllerine kaynaşır ve atıklarını biriktirmek için ortak bir lümeni paylaşırlar. İkincil nefronlar bir sonraki dalgada oluşur ve birincil nefronlara kaynaşır. Bu tekrarlayıcı süreç, memeli böbreği gibi dallı bir mezonephros oluşturur. Muhtemelen, pronephros sonunda tübüle kimliğini kaybeder ve tüm nefronların atıklarını boşalttığı iki büyük toplama kanalı haline gelir13.
İlk yetişkin nefron oluşumundan önce, tek ata hücreleri ~4 mm (toplam uzunluk) larvalarda (~10 dpf) görünmeye başlar. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik çizgisinde işaretlenen bu hücreler, proneforolara yapışır ve gelecekteki nefrogenez bölgelerine göç eder gibi görünmektedir. Tek hücreler kümeler halinde birleşir ve bu da yeni nefronlara dönüşür12. Bu hücrelerin nerede yaşadığı veya mezonephrogenez başlangıcından önce hangi genleri ifade ettikleri belirsizdir.
Mezoneforos gelişimini anlamak, memeli böbreği hakkında pronephros'un yapamayacağı şekilde içgörüler sağlar. Bunlar arasında tek progenitör hücrelerden nefrojenik agregaların oluşumu, yeni nefronların mevcutlarla fonksiyonel entegrasyonu ve dallanma morfogenezi saydır. Bununla birlikte, postembriyonik gelişimi incelemek için sınırlamalar vardır. Larvalar daha büyük boyutları ve pigmentasyonları nedeniyle daha az şeffaftır. Gelişimsel zaman çizelgesi bireysel hayvanlar arasında senkronize değildir ve beslenme ve kalabalık oluşturma9,14 gibi çevresel faktörlere oldukça bağlıdır. Nakavt reaktifleri mevcut olmasına rağmen, larvalarda embriyolara kıyasla daha az etkilidirler15. Bu protokolde zebra balığı mezoteforos gelişimi sırasında gen ekspresyonunu belirlemek için yerinde melezleme yöntemi tanımlanmıştır. Mezomreforoların görselleştirilmesini ve prob ve antikorun penetrasyonunu ve yıkanmasını artırmak için çeşitli adımlar optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, EGFP'nin tek progenitör hücreleri, nefrojenik agregaları ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemesi için bir prob ile birlikte kullanılır. Bu yöntem, mezometroların gelişiminin daha derin anlaşılmasını ve rejeneratif tedaviler hakkında fikir verilmesini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı larvalarının ve yavrularının kullanımı IUP IACUC (protokol #02-1920, #08-1920) tarafından onaylanmıştır. Çözüm içeriğinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Larvaların yükseltilmesi
NOT: Larvaları ve gençleri ilgi alanına yükseltmek 21 gün veya daha fazla sürecektir.
- Son yemeklerinden sonra öğleden sonra bir çiftleşme tankına 1 erkek ve 1 dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun.
NOT: Tüm balık çiftleri çiftleşmez. Çiftleşme oranını belirlemek için 20 çift ayarlayarak başlayın ve gelecekteki denemelerde buna göre ayarlayın. - Ertesi gün balık çiftleşmeyi bitirdikten sonra (yaklaşık 1 pm), embriyoları Petri plakalarında E3 orta ile toplayın.
- Plaka başına en fazla 30 embriyo olduğundan emin olun.
- Petri plakalarından kalıntıları (dışkı gibi) çıkarın ve 20 mL E3 ortamı ekleyin.
- 1 gün boyunca 28,5 °C'de kuluçkaya yatır.
- Yetişkin zebra balığını su sistemine geri koyun.
- 1 dpf'de, E3 ortamını taze E3 ile değiştirin.
- 5 dpf'ye kadar 4 gün daha 28,5 °C'de kuluçkaya yatır.
- 2,8 L'lik bir tanka 400 μm ekran koyun ve 2 cm sistem suyu ile doldurun.
- 1 plakadan 5 dpf larva ekleyin (toplam larva sayısı 30'a kadar).
- Tankı su sistemine koyun, ancak su akışını başlatmayın.
- Larvaları günde iki kez 14 dpf'ye kadar 4 mL toz gıda ile besleyin.
- 6 dpf'de, su akışını saniyede 1 damlada başlatın.
NOT: Günlük su akışını kontrol edin ve buna göre ayarlayın. - 8 dpf'de, su akışını yavaş ve sabit bir akışa yükseltin.
- 14 dpf'de, toz yiyeceklere ek olarak canlı salamura karides besleyin.
2. Gün 1 - 2: Larvaların sabitlenerek
- İstenilen zaman noktasında bir larva tankını çıkarın.
- Bir Petri plakasını 20 mL sistem suyu ile doldurun.
- Larvaları hafifçe kepçelamak ve su yüzeyine getirmek için ince bir ağ kullanın.
- Daha geniş bir açıklık sağlamak ve larvaları Petri plakasına aktarmak için bir transfer pipetinin ucunu kesin. Daha büyük pipet ağzı, aynı anda birkaç küçük larva veya birkaç büyük larvanın aktarılmasına izin verir.
- Larvaları hareketsiz hale getirmek için 2 mL trikain (%2, pH 7 stok) ekleyin.
- Larvalar hareket etmeyi bıraktıktan sonra, suyun çoğunu çıkarın ve 10 mL trikain ekleyin. Larvaların ötenazi için 15 dakika bekleyin.
- İsteğe bağlı: 8 mm'den uzun gençler için, sabitleme çözeltisinin penetrasyonunu iyileştirmek için bir kesme mikroskobu altında kafaları ve kuyrukları bir jiletle (ötanaziden sonra) kesin. Başı ve kuyruğu kesmeden önce her hayvanın toplam uzunluğunu kaydettiğinizden ve her birini kendi Petri plakasında izole ettiğinizden emin olun. Hayvanların nasıl ölçülecekleri için 3.
- Trikaini 20 mL sabitleme çözeltisi (%4 paraformaldehit, %1 DMSO) ile değiştirin. Kapağı petri plakasına geri koyun ve duman kaputunda yavaşça sallayın.
NOT: Sallanan bir platform kullanmak önemlidir. Dairesel hareketle sallanan bir platform, hayvan ekseninin kavisli olmasına neden olacaktır. Sadece taze (önceden yapılmamış dondurulmuş değil) sabitleme sosu kullanın.
DİkKAT: Sabitleme çözeltisi, muhtemel bir kanserojen olan paraformaldehit içerir. Tozu ölçmek için duman davlumbaz (veya maske) ve eldiven kullanın. - 30 dakika sonra, sabitleme çözümünü yeni bir sabitleme çözümü ile değiştirin.
- Kullanılmış sabitleme sokicisini uygun bertaraf için ayrı bir atık konteynerinde toplayın.
- Larvaları 25 mL taze sabitleme çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Kapağın sıkı olduğundan ve 2 gün boyunca 4 °C'de yavaşça sallanarak olduğundan emin olun. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
3. Gün 3: Larvaların ölçülmesi
- Duman kaputunda, sabitleme solüsyonunu 20 mL PBST ile değiştirin.
- Larvaları bir Petri plakasına aktarın.
- Bir diseksiyon mikroskobuna düz bir cetvel koyun ve Petri plakasını cetvelin üzerine koyun.
- Toplam uzunluğunu ölçmek için her larvayı cetvele taşımak için bir kirpik manipülatörü kullanın (snout'tan kaudal yüzgecin ucuna kadar) (Şekil 1).
- Benzer uzunluklarda (örneğin, 5,0 mm ve 5,1 mm) çeşitli larvaları, şişe başına 10 larvaya kadar bir 5,5 mL cam şişede birleştirin.
4. Gün 3 - 4: Dehidrasyon
- PBST'i %100 metanolden oluşan 4 mL ile değiştirin. Şişeyi oda sıcaklığında 5 dakika sallayın.
- Metanol'i 5 dakika boyunca taze metanol ve kaya ile değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- Şişeyi -20 °C'de 2 gün saklayın. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
5. Gün 5: Rehidrasyon
- Şişeyi oda sıcaklığına ısıtın.
- Metanolünü %75 metanol/%25 PBST'nin 4 mL'si ile değiştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika kaya.
- 5.2 adımdaki çözeltiyi 4 mL%50 metanol/%50 PBST ile değiştirin ve 5 dakika boyunca kayan.
- 5.3 adımdaki çözeltiyi% 25 metanol / % 75 PBST'nin 4 mL'si ve 5 dakika boyunca kaya ile değiştirin.
- 5.4 adımdaki çözümü 4 mL PBST ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
6. Gün 5: Proteinaz K sindirim
- PBST'yi 2 mL proteinaz K çözeltisi (20 μg/mL, PBST'de% 1 DMSO son konsantrasyon) ile değiştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kayan.
NOT: 6 mm'den uzun larvalar daha uzun bir kuluçka süresine ve /veya daha yüksek bir proteinaz K konsantrasyonuna ihtiyaç duyacaktır. Kesin zaman ve konsantrasyonun ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. 6 mm'den uzun her 0,5 mm için kuluçka süresinde 10 dakikalık bir artışla başlayın. - Proteinaz K çözeltisini 4 mL PBST ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- PBST'yi 4 mL taze sabitleme çözeltisi ve 1 saat boyunca kaya ile değiştirin. Kolaylık sağlamak için 4 °C'de daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
7. Gün 5: Beyazlatma
- Sabitleme solüsyonunun yerine 4 mL PBST ve oda sıcaklığında 10 dakika kaya kullanın.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- Larvaları 6 kuyulu bir tabağa aktarın (kuyu başına 10 larvaya kadar).
- PBST'yi 3 mL taze ağartma çözeltisi ile değiştirin.
- Oda sıcaklığında kaya ve her 5 dakikada bir diseksiyon mikroskobu altında pigmentasyonu izleyin. Mezonephros boyunca pigmentasyonun kayboluşunu arayın (yüzme mesanesine ve bağırsasına dorsal).
NOT: 6 mm uzunlukta larvalar için, mezonephroları çevreleyen pigmentasyonun ağartması 20 dakika kadar sürecektir. Larvaların bütünlüğünü korumak için gerekenden daha uzun süre ağartmayın. - Larvaları tekrar bir cam şişeye aktarın.
- Beyazlatma solüsyonunun yerine 4 mL PBST kullanın. 10 dakika boyunca kaya.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- PBST'yi 4 mL taze sabitleme çözeltisi ve 1 saat boyunca kaya ile değiştirin. Kolaylık sağlamak için 4 °C'de daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
8. 5. Gün: Prehidrizasyon
NOT: 70 °C'de yapılan adımlar için şişe soğutmasını en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir.
- Sabitleme solüsyonunun yerine 4 mL PBST ve oda sıcaklığında 10 dakika kaya kullanın.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- PBST'yi 4 mL Hyb çözeltisi ile değiştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kayan.
DİkKAT: Hyb-, Hyb+ ve prob çözeltileri cildi tahriş edebilecek formamid içerir. Bu çözümleri kullanmak için eldiven kullanın. - Hyb-'i 4 mL taze Hyb ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kaya. Bir kez daha tekrarla.
- Kullanılmış Hyb-, Hyb+ ve prob çözeltilerini uygun bertaraf için ayrı bir atık konteynerinde toplayın.
- Hyb- yerine Hyb+ çözümünün 4 mL'si kullanın.
- Şişeyi gece boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.
- EGFP-floresan prob 1:100 hyb+ 500 μL seyreltin ve 70 °C'de O/N kuluçkaya yatırın.
NOT: Prob sentezi için üreticinin yönergelerini izleyin.
9. Gün 6: Prob hibridizasyonu
- Şişedeki Hyb+ çözeltisini önceden ısıtılmış probla değiştirin ve gece boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: 6 mm'den uzun larvalar 2 günlük inkübasyona ihtiyaç duyar. - Yıkama tamponu, 2x SSCT ve 0,2x SSCT çözümlerini 70 °C'de gece boyunca önceden ısıtın.
10. Gün 7: Prob yıkama
- Probu önceden ısıtılmış yıkama tamponunun 4 mL'si ile değiştirin ve 70 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kullanılmış probu uygun bertaraf için ayrı bir atık konteynerinde toplayın.
- Yıkama tamponu 4 mL taze yıkama tamponu ile değiştirin ve 70 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Yıkama tamponu önceden ısıtılmış 2x SSCT çözeltisinin 4 mL'si ile değiştirin ve 70 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 50 mL'lik bir tüpe önceden ısıtılmış 0,2x SSCT 50 mL ekleyin.
- Tüpün üstüne bir hücre süzgeci (100 μm) yerleştirin. Hücre süzgecinin durana kadar aşağı itilmesini sağlayın.
- Larvaları cam şişeden hücre süzgecine aktarın. Larvaların tampona batırılmış olduğundan emin olun ve 2 saat boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT'nin 50 mL'lik yeni bir tüpünü hazırlayın.
- Hücre süzgecini adım 10.4.2'den 0.2x SSCT'nin yeni tüpüne aktarın ve 2 saat boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 10.5. adımı bir kez daha tekrarlayın.
11. Gün 7: Engelleme
- Larvaları yeni bir cam şişeye aktarın ve oda sıcaklığına soğutun.
- 0,2x SSCT'yi 4 mL%67 0,2x SSCT/%33 MABT ile değiştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kayan.
- 11.2 adımındaki çözeltiyi 4 mL%33 0.2x SSCT/%67 MABT ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.
- 11.3 adımdaki çözeltiyi 4 mL MABT ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.
- MABT'yi 4 mL taze MABT ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- MABT'yi 4 mL engelleme çözeltisi ile değiştirin ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
12. Gün 8 - 9: Antikor inkübasyonu
- Anti-floresan antikoru 1:5.000 500 μL blokaj çözeltisinde seyreltin.
- Blokaj çözeltisini antikor çözeltisi ile değiştirin ve 2 gün boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
- Larvaları çalkalamak için şişeyi günde iki kez döndürün.
NOT: 6 mm'den uzun larvalar 1-2 gün daha kuluçkaya ihtiyaç duyar.
- Larvaları çalkalamak için şişeyi günde iki kez döndürün.
13. Gün 10 - 11: Antikor yıkama
- Antikor çözeltisini 4 mL PBST ile değiştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kaya.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- Larvaları 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 40 mL PBST2 ekleyin. Tüpü yan yatırın ve bir gecede 4 °C'de sallanın.
- PBST2'yi 40 mL taze PBST2 ile değiştirin ve gece boyunca 4 °C'de kaya. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
NOT: 6 mm'den uzun larvaların 1-2 gün daha yıkanması gerekir.
14. Gün 12: Boyama
- Larvaları 6 kuyulu bir tabağa aktarın.
- PBST2'yi 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3 mL boyama tamponu ve kaya ile değiştirin.
- Boyama tamponu 3 mL taze boyama tamponu ve kaya ile 5 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- Boyama tamponu 3 mL boyama çözeltisi ile değiştirin. Alüminyum folyo ile örtün ve önümüzdeki birkaç saat boyunca lekeleri izleyin.
- Zayıf sinyalli problar için, bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın ve arada bir kez boyama çözeltisini taze boyama çözeltisi ile değiştirin.
- İstenilen boyama yoğunluğuna ulaşıldığında, boyama çözeltisini 3 mL durdurma çözeltisi ve 30 dakika kaya ile değiştirin.
- Durdurma solüsyonunun yerine 3 mL taze durdurma çözeltisi ve 30 dakika boyunca kaya kullanın. Bir kez daha tekrarla.
- Larvaları yeni bir cam şişeye aktarın ve durdurma çözeltisini 4 mL taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Kolaylık sağlamak için 4 °C'de daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.
- Larvaları bir yıla kadar 4 ° C'de karanlıkta sabitleme çözeltisinde saklayın.
15. Gün 12: Görüntüleme
- Sabitleme solüsyonunun yerine 4 mL PBST ve oda sıcaklığında 10 dakika kaya kullanın.
- Larvaları 6 kuyulu bir tabağa aktarın.
- PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.
- PBST'yi %50 gliserol (PBST'de) 3 mL ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.
- 15.4 adımdaki çözeltiyi 10 dakika boyunca sallanmadan 3 mL% 100 gliserol ile değiştirin.
- Larvaları doğrudan 6 kuyu plakasında görüntülemek veya larvaları bileşik bir mikroskop altında görüntüye bir çöküntü slaydına aktarmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Larvaları yönlendirmek için bir kirpik manipülatörü kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı kullanılarak, bu in situ hibridizasyon protokolünün mezonephros gelişimi sırasında böbrek progenitör hücrelerinin ve çeşitli nefron yapıların etiketlenmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Beklendiği gibi, merkezi sinir sistemi de bu transgenik çizgide etiketlenmiştir (gösterilmez). İlk mezofrerik nefron yaklaşık 5,2 mm'de oluşur, pronephros'a dorsal (Şekil 2A) ve bu nefron distal tübül EGFP10,12 ile etiketlenmiştir. Bu aşamada ve daha sonra progenitör kümeler mevcuttur (Şekil 2A-B, ok uçları) ve tek progenitör hücreler de etiketlenmiştir (Şekil 2C). Bu yöntem böbrek gelişimini çalışmada ek bir araç sağlar ve insan böbreğinin anlaşılmasına ışık tutmaya yardımcı olur.
Şekil 1: Larvaların ölçülmesi. Petri plakasındaki sabit larvalar düz bir cetvelin üzerine yerleştirilir. Bir diseksiyon mikroskobu altında larvalar ölçülür ve benzer boyutlardaki gruplarla ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mesonephros gelişimi. Tg (lhx1a-EGFP) transgenik hattında yaklaşık 5,2 mm'de, ilk mezofrerik nefron pronephros ve yüzme mesanesine (SB) (A) dorsal olarak oluşur. Mezoneforos gelişimi sırasında (A-B, ok uçları) tek progenitör hücrelere (C, braket) ek olarak progenitör hücre kümeleri mevcuttur. Daha büyük yavrularda, somitlerde (C, oklar) arka plan boyama oluşabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için uygulanabilir14. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.
Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmaları önemlidir. Doku bütünlüğünü korumak için proteinaz K tedavisinin süresini en aza indirmek önemlidir. Her yeni enzim grubu için en iyi tedavi süresini belirlemek önemlidir. Alternatif olarak, gelişmiş doku bütünlüğü için proteinaz K yerine aseton kullanılabilir16. Aşırı ağartma doku bütünlüğünü de azaltır. Minimal ağartma ve gözlerin bazı pigmentasyonları tutmasına izin vermek, yıkamalar sırasında larvaların görselleştirilmesine yardımcı olun. Doku kırılganlığının bir göstergesi olan hibridizasyon adımı sırasında gözlerin düşmesi yaygındır. DMSO'nun sabitleme ve proteinaz K çözeltisi ile kullanımı doku penetrasyonu için çok önemlidir17.
Bu yöntemin bir sınırlaması, reaktiflerin daha büyük hayvanlarda zayıf penetrasyonudur. Penetrasyonu iyileştirmek için, kafa ve kuyruk sabitlemeden önce bir jiletle çıkarılabilir17. Bağırsak, reaktiflerin mezonifrosa doğrudan erişmesine izin vermek için sabitlemeden sonra ince cımbız ve tungsten iğneleri ile çıkarılabilir. Uzun problar (1 KB'den büyük) dokunun zayıf penetrasyonuna sahip olabilir, ancak penetrasyonu iyileştirmek için kısa parçalara (yaklaşık 0,3 KB) hidrolizlenebilirler18. Zayıf sinyallere sahip problar için, arka plan ve prob sinyali arasında ayrım yapmak için duyu dizisine sahip kontrol probları kullanılabilir. Daha büyük hayvanlar, somitlerin daha yüksek bir arka plan boyanması olacaktır (Şekil 2C, oklar). Bununla birlikte, bu probun ve antikorların daha uzun yıkamaları ile en aza indirilebilir.
Buradaki protokol, yetişkin zebra balığı böbreği12,19 gibi parçalanmış ve izole edilmiş doku ve organlara da uygulanabilir. Benzer protokollerin yayınlanmış açıklamaları olmasına rağmen9,16, hiçbiri larva yetiştirmeden in situ melezleme kadar tüm süreci bu ayrıntı seviyesiyle açıklamamaktadır. Bu nedenle, bu yöntem omurgalı böbreğin gelişimini deşifre etmek için ek bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Pensilvanya Bilim Akademisi ve Pennsylvania Biyologlar Topluluğu ve Indiana University of Pennsylvania (Lisansüstü Çalışmalar ve Araştırma Okulu, Biyoloji Bölümü ve Cynthia Sushak Lisans BiyolojiSi Mükemmellik Fonu) tarafından finanse edildi. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı Dr. Neil Hukriede (Pittsburgh Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al.
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
