Summary
제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.
Abstract
제브라피쉬는 일생에 두 개의 신장 구조를 형성합니다. 배아 발달 중 경향이 있는 (배아 신장)은 형성되고 2 일 후에 수정 후에 작동하기 시작합니다. 단지 두 개의 신전으로 이루어짐에 따라, 수성 세포는 증가하는 바디 질량 때문에 더 많은 신장 기능이 요구될 때까지 애벌레 생활 도중 유일한 신장 역할을 합니다. 이 높은 수요에 대처하기 위하여는, 메소네프로스 (성인 신장)는 변태 도중 형성하기 시작합니다. 새로운 기본 nephrons 는 경향이 있는 알 로에 융합 하 고 연결 된 lumens 형성. 그런 다음 보조 nephrons는 메소네프로스(mesonephros)에 분기 네트워크를 만들기 위해 기본 nephrons에 융합됩니다. 연구의 대다수는 배아를 사용 의 용이성 때문에 경향이 있는 phros에 집중됩니다. 따라서 메소네프로스의 발달을 더 잘 이해하기 위해 더 오래되고 더 큰 애벌레와 청소년 물고기를 연구하는 기술을 개발할 필요가 있습니다. 여기서, 유전자 발현 분석을 위한 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스를 더 잘 시각화하기 위해 프로브 침투, 프로브 및 항체의 세척 및 표백에 최적화되어 있다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 전구 세포와 초기 신장의 말단 튜블러를 라벨에 사용됩니다. 이 프로토콜은 메손프로스 연구의 격차를 메손프로스(mesonephros) 연구의 격차를 메웁니다. 새로운 신장 조직이 어떻게 형성되고 기존 신장론과 통합되고 재생 치료에 대한 통찰력을 제공하는지 이해하는 중요한 모델입니다.
Introduction
Zebrafish 배아는 최대 5 일 1,2에 대한 먹이없이 작은 크기, 투명성, 사용 가능한 도구 및 생존으로 인해 조직 발달을 연구하기위한 중요한 모델입니다. 그것은 크게 신장 발달의 이해와 제브라피시와 포유류 사이의 보존에 기여하고있다3,4,5. 신장은 유체 항상성을 유지하고 혈액을 필터링하고 폐기물을 배설하는 데 필수적인 역할을합니다. 신장의 기능성 단위인 네프론은 긴 튜블러에 연결된 혈액 필터를 포함한다. 제브라피시에서는 두 개의 신장 구조가 평생 동안 형성됩니다. 수경향 (임시 배아 신장) 초기 발달 도중 첫번째 양식. 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 네프론으로 구성되어 있으며 약 2일 후에 발효됩니다(dpf). 경향이 있는 소염의 유용성은 단순성에 있으며, 대부분 선형적이고 시각화하기 쉬운 두 개의 네프론을 가지고 있습니다 (근위 복잡한 튜블러는 3 dpf에서 코일되기 시작하지만). 이것은 중간 중음에서 초기 발달의 연구뿐만 아니라 세분화 패턴 및 tubule 수리7,8을 촉진했습니다.
노른자가 감소하고 유충이 수생 계통9에서 먹이에 의존할 때 제브라피시의 유용성은 5dpf 후에 제한됩니다. 약 2 주 에서, 애벌레는 새로운 조직 양식 및 오래된 조직이 분실되고/또는 개편되는 청소년으로 변태를 겪습니다9. 이것은 또한 메소네프로스 (영구 성인 신장)가 10,11,12를 형성 할 때입니다. 첫 번째 성인 nephron 여섯 번째 소밋 근처 형성, 그리고 경향이 있는 phros의 탈경 초기 tubule와 융합. 추가 nephrons는 처음에이 위치에 후방을 추가, 뿐만 아니라 나중에 전방으로. 이 첫 번째 파도의 기본 네프론은 경향이있는 사람의 튜블러에 융합하고 폐기물을 입금하기 위해 일반적인 루멘을 공유합니다. 보조 nephrons다음 파도에서 형성 하 고 기본 nephrons에 융합. 이 반복적인 과정은 포유류 신장에 다소 유사한 분기되는 메손프로스를 만듭니다. 아마도, 경향이 있는 것은 결국 그것의 관 정체성을 잃고 모든 nephrons그들의 낭비를 배수하는 두 개의 중요한 수집 덕트가 됩니다13.
첫 번째 성인 nephron의 형성 전에, 단 하나 전구 세포는 ~4 mm (총 길이) 애벌레 (~10 dpf)에서 나타나기 시작합니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선에 표시된 이 세포는, 경향이 있는 phros를 고착하고 신뢰의 미래 사이트로 이동하는 것처럼 보입니다. 단일 세포는 새로운 nephrons12로 분화하는 클러스터로 결합합니다. 이 세포가 어디에 상주하는지 또는 메소네프로 발생의 발병 전에 어떤 유전자를 표현하는지 불분명합니다.
메손프로스 개발을 이해하면 포유류 신장에 대한 통찰력을 수성세포증이 할 수 없는 방식으로 얻을 수 있습니다. 이들은 단 하나 전구 세포에서 nephrogenic 골체의 형성, 기존 세포와 새로운 nephrons의 기능적인 통합, 및 분진 형태를 포함합니다. 그러나, 태아 발달을 공부하는 한계가 있습니다. 유충은 그들의 더 큰 크기와 색소 침착을 가지고 있기 때문에 덜 투명합니다. 개발 타임 라인은 개별 동물 중 동기가 아니며 먹이 주기 및 혼잡9,14와 같은 환경 요인에 크게 의존합니다. 녹다운 시약이 존재하지만, 배아15에 비해 애벌레에서 덜 효과적입니다. 본 프로토콜에서, 제브라피시 메소네프로스 개발 중 유전자 발현을 결정하는 시투 혼성화 방법이 기재된다. 몇 가지 단계는 메손프로스의 시각화와 프로브 및 항체의 침투 및 세척을 증가시키기 위해 최적화된다. Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선은 EGFP가 단일 전구 세포, 신장 골체 및 초기 신장의 단면 튜블러를 라벨에 부착하기 위한 프로브와 함께 사용됩니다. 이 방법은 메소네프로스 발달에 대한 깊은 이해와 재생 치료에 대한 통찰력을 제공합니다.
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Protocol
제브라피시 애벌레와 청소년의 사용은 IUP IACUC (프로토콜 #02-1920, #08-1920)에 의해 승인됩니다. 솔루션 콘텐츠에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열됩니다.
1. 애벌레 를 기르다
참고: 애벌레와 청소년을 관심 있는 단계로 올리는 데는 최대 21일 이상이 소요됩니다.
- 마지막 식사 후 늦은 오후에 짝짓기 탱크에 남성 1 마리와 암컷 물고기 1 마리를 추가하여 짝짓기 성인 얼룩말 물고기를 설정합니다.
참고 : 모든 물고기 쌍이 짝짓기않습니다. 먼저 20쌍을 설정하여 짝짓기 속도를 결정하고 향후 실험에서 그에 따라 조정합니다. - 물고기가 짝짓기를 마친 다음 날 (오후 1시경) 페트리 플레이트에 E3 배지로 배아를 수집합니다.
- 플레이트당 30배 이하의 배아가 없는지 확인하십시오.
- 페트리 플레이트에서 이물질(예: 대변)을 제거하고 20mL의 E3 배지를 추가합니다.
- 1 일 동안 28.5 °C에서 배양하십시오.
- 수생 시스템에 다시 성인 얼룩말 물고기를 넣어.
- 1dpf에서 E3 배지를 신선한 E3로 교체하십시오.
- 5 dpf까지 4 일 동안 28.5 °C에서 배양하십시오.
- 2.8 L 탱크에 400 μm 화면을 넣고 2cm의 시스템 물로 채웁니다.
- 1 접시 (총 30 개까지)에서 5 dpf 애벌레를 추가합니다.
- 수생 시스템에 탱크를 넣어,하지만 물 흐름을 시작하지 않습니다.
- 14 dpf까지 하루에 두 번 분말 식품의 애벌레 4 mL을 공급합니다.
- 6dpf에서, 초당 1 드립에서 물 흐름을 시작합니다.
참고: 매일 수류를 확인하고 그에 따라 조정하십시오. - 8dpf에서, 천천히, 꾸준한 스트림으로 물 흐름을 증가.
- 14 dpf에서, 분말 식품 이외에 살아있는 소금물 새우를 먹이십시오.
2. 1 일 - 2 : 애벌레 수정
- 원하는 시점에서 애벌레 탱크를 제거합니다.
- 페트리 플레이트에 20mL의 시스템 워터를 채웁니다.
- 미세한 메쉬 그물을 사용하여 애벌레를 부드럽게 떠서 수면으로 가져옵니다.
- 더 넓은 개구부를 제공하고 페트리 플레이트에 애벌레를 전송하기 위해 전송 파이펫의 끝을 잘라. 더 큰 파이펫 입은 한 번에 여러 개의 작은 애벌레 또는 몇 가지 큰 애벌레의 전송을 허용합니다.
- 트리카인 2mL(2%, pH 7 스톡)를 추가하여 애벌레를 고정시합니다.
- 애벌레가 움직이지 않는 후 대부분의 물을 제거하고 10mL의 트리카인을 추가합니다. 애벌레가 안락사될 때까지 15분 기다립니다.
- 선택 사항: 8mm 이상의 청소년의 경우, 해부 현미경으로 면도날(안락사 후)으로 머리와 꼬리를 잘라 고정 용액의 침투를 개선합니다. 머리와 꼬리를 잘라내고 각 동물의 총 길이를 자신의 페트리 플레이트에 분리하십시오. 동물을 측정하는 방법에 대한 3 단계를 참조하십시오.
- 트리카인을 20mL의 고정 용액(4% 파라포름알데히드, 1% DMSO)으로 교체하십시오. 페트리 플레이트에 뚜껑을 다시 놓고 연기 후드에 천천히 흔들어 놓습니다.
참고: 흔들 플랫폼을 사용하는 것이 중요합니다. 원형 동작이 있는 흔들리는 플랫폼은 동물 축을 구부러집니다. 신선한 (미리 만들어진 냉동되지 않음) 고정 용액만 사용하십시오.
주의: 고정 용액에는 발암 물질인 파라포름알데히드가 포함되어 있습니다. 연기 후드(또는 마스크)와 장갑을 사용하여 분말을 측정합니다. - 30분 후 고정 솔루션을 신선한 고정 솔루션으로 교체합니다.
- 적절한 처리를 위해 별도의 폐기물 용기에 사용된 고정 솔루션을 수집합니다.
- 애벌레를 신선한 고정 용액 25mL가 들어 있는 50mL 튜브로 옮기습니다.
- 캡이 단단하고 2 일 동안 4 °C에서 천천히 흔들는지 확인하십시오. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
3. 3일차: 애벌레 측정
- 연기 후드에서 고정 용액을 20mL의 PBST로 교체하십시오.
- 애벌레를 페트리 플레이트로 옮킨다.
- 해부 현미경에 평평한 통치자를 넣고 페트리 플레이트를 통치자 위에 놓습니다.
- 속눈썹 조작기를 사용하여 각 애벌레를 통치자로 이동하여 총 길이(주아웃에서 카달 지느러미 의 끝까지)를 측정합니다(그림 1).
- 유사한 길이(예: 5.0mm 및 5.1 mm)의 여러 애벌레를 5.5mL 유리 유리 바이알 1개, 유리병 당 최대 10개의 애벌레에 결합합니다.
4. 3 일 - 4 : 탈수
- PBST를 100% 메탄올의 4mL로 교체하십시오. 실온에서 5 분 동안 유리병을 흔들어.
- 메탄올을 신선한 메탄올과 바위로 5분 간 교체하십시오. 한 번 더 반복합니다.
- 바이알을 -20°C에서 2일 동안 보관합니다. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
5. 5일차: 수화
- 유리병을 실온으로 데우습니다.
- 메탄올을 75% 메탄올/25% PBST로 4mL로 교체하십시오. 실온에서 5분 간 바위를 흔들수 있습니다.
- 5.2 단계의 솔루션을 50 % 메탄올 / 50 % PBST의 4 mL로 교체하고 5 분 동안 바위를 교체하십시오.
- 5.3 단계에서 25% 메탄올/75% PBST의 4mL로 솔루션을 교체하고 5분 동안 바위를 흔들어 보세요.
- 5.4 단계의 솔루션을 4mL PBST로 교체하고 10 분 동안 바위를 대체하십시오.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
6. 5일차: 프로틴타제 K 다이제스트
- PBST를 단백질Ae K 용액(20 μg/mL, PBST의 1% DMSO 최종 농도)으로 교체하고 실온에서 30분 간 바위를 휘두른다.
참고: 6mm 이상의 애벌레는 더 긴 잠복기 및/또는 더 높은 단백질제 K 농도가 필요합니다. 정확한 시간과 농도는 경험적으로 결정되어야 합니다. 6mm보다 0.5mm 더 긴 배양 시간이 10분 증가하여 시작합니다. - 단백질Ae K 용액을 PBST 의 4mL로 교체하고 바위를 10 분 동안 교체하십시오.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
- PBST를 4mL의 신선한 고정 용액으로 교체하고 1h의 바위를 흔들어 보입니다. 편의를 위해 4°C에서 더 오래 배양할 수 있습니다.
7. 5일차: 표백
- 고정 용액을 4mL의 PBST로 교체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 흔들어보십시오.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
- 애벌레를 6웰 플레이트(우물당 최대 10개)로 옮기습니다.
- PBST를 3mL의 신선한 표백 용액으로 교체하십시오.
- 실온에서 바위와 해부 현미경에서 색소 침착을 모니터링 5 분마다. 메소네프로스(수영 방광과 창자에 대한 등살)를 따라 색소침착이 사라지는 것을 찾아본다.
참고: 최대 6mm 길이의 애벌레의 경우 메소네프로를 둘러싼 색소 침착을 표백하는 데 최대 20분이 소요됩니다. 애벌레의 무결성을 보존하기 위해 필요한 것보다 더 오래 표백하지 마십시오. - 유충을 유리 유리 병으로 다시 옮기.
- 표백 용액을 PBST의 4mL로 교체하십시오. 10 분 동안 바위.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
- PBST를 4mL의 신선한 고정 용액으로 교체하고 1h의 바위를 흔들어 보입니다. 편의를 위해 4°C에서 더 오래 배양할 수 있습니다.
8. 5일차: 사전혼성화
참고: 70°C에서 수행되는 단계의 경우 유리병 냉각을 최소화하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.
- 고정 용액을 4mL의 PBST로 교체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 흔들어보십시오.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
- PBST를 Hyb-솔루션의 4mL로 교체하고 실온에서 10분 간 바위를 흔들어 보실 수 있습니다.
주의: Hyb-, Hyb+및 프로브 솔루션에는 피부를 자극할 수 있는 폼아미드가 포함되어 있습니다. 장갑을 사용하여 이러한 솔루션을 처리합니다. - Hyb-를 신선한 Hyb와 바위 4mL로 10분 간 교체하십시오. 한 번 더 반복합니다.
- 사용 된 Hyb- Hyb +를 수집하고 적절한 처리를 위해 별도의 폐기물 용기에 솔루션을 프로브하십시오.
- Hyb-를 Hyb+ 솔루션의 4mL로 교체합니다.
- 하룻밤 사이에 70°C에서 바이알을 배양합니다.
- HYb+의 500 μL에서 EGFP-플루오레세인 프로브를 1:100으로 희석하고 70°C에서 O/N을 배양합니다.
참고: 프로브 합성에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
9. 6일차: 프로브 혼성화
- 유리병의 Hyb+ 용액을 예열된 프로브로 교체하고 하룻밤 사이에 70°C에서 배양합니다.
참고: 6mm 이상의 애벌레는 2일 간 배양을 필요로 합니다. - 세척 버퍼, 2x SSCT 및 0.2x SSCT 용액을 70°C에서 밤새 예열합니다.
10. 7 일 : 프로브 세척
- 프로브를 예열된 세척 버퍼의 4mL로 교체하고 70°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 적절한 처리를 위해 별도의 폐기물 용기에서 사용된 프로브를 수집합니다.
- 워시 버퍼를 4mL의 신선한 세척 버퍼로 교체하고 70 °C에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 세척 버퍼를 예열된 2x SSCT 용액의 4mL로 교체하고 70°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 50mL의 예열된 0.2x SSCT를 50mL 튜브에 넣습니다.
- 튜브 의 상단에 셀 스트레이너 (100 μm)를 삽입합니다. 세포 스트레이너가 멈출 때까지 끝까지 밀어내도록 하십시오.
- 유리 유리 병에서 유충을 세포 여과기로 옮기습니다. 애벌레가 완충액에 잠겨 있는지 확인하고 70°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 예열된 0.2x SSCT의 50mL를 포함하는 새로운 튜브를 준비합니다.
- 세포 스트레이너를 10.4.2단계로부터 0.2x SSCT의 새로운 튜브로 옮기고 70°C에서 2시간 동안 배양한다.
- 10.5 단계를 한 번 더 반복합니다.
11. 7일차: 차단
- 애벌레를 새로운 유리 유리 유리 병으로 옮기고 실온으로 식힙니다.
- 0.2x SSCT를 67%의 4mL로 교체하고 실온에서 0.2x SSCT/33% MABT및 바위를 10분 간 교체하십시오.
- 11.2단계에서 솔루션을 33% 0.2x SSCT/67% MABT및 록으로 10분 간 교체하십시오.
- 11.3 단계에서 솔루션을 MABT의 4mL로 교체하고 10 분 동안 바위를 흔들어 보세요.
- MABT를 신선한 MABT와 바위4mL로 10분 간 교체하십시오. 한 번 더 반복합니다.
- MABT를 블로킹 용액의 4mL로 교체하고 하룻밤 사이에 4°C에서 배양한다. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
12. 8일차 - 9일: 항체 배양
- 500 μL 차단 용액에서 항 형광 항체 1:5,000을 희석시.
- 차단 용액을 항체 용액으로 교체하고 2 일 동안 4 °C에서 배양하십시오. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
- 유충을 동요하기 위해 하루에 두 번 유리병을 소용돌이.
참고: 6mm 보다 긴 애벌레는 1-2일 더 많은 배양이 필요합니다.
- 유충을 동요하기 위해 하루에 두 번 유리병을 소용돌이.
13. 10 일 - 11 : 항체 세척
- 항체 용액을 4mL의 PBST로 대체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 하십시오.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
- 애벌레를 50mL 튜브로 옮킨다.
- PBST2의 40mL를 추가합니다. 튜브를 측면에 놓고 하룻밤 사이에 4 °C에서 바위를 놓습니다.
- PBST2를 40mL의 신선한 PBST2로 교체하고 하룻밤 사이에 4°C의 바위를 보입니다. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
참고: 6mm 보다 긴 애벌레는 1-2일 의 세탁이 더 필요합니다.
14. 12일차: 염색
- 애벌레를 6웰 플레이트로 옮기습니다.
- PBST2를 실온에서 3mL의 염색 버퍼와 바위로 5분 간 교체하십시오.
- 염색 버퍼를 3mL의 신선한 염색 버퍼로 교체하고 바위를 5분 간 교체합니다. 한 번 더 반복합니다.
- 염색 버퍼를 염색 용액의 3mL로 교체합니다. 알루미늄 호일로 덮고 다음 몇 시간 동안 얼룩을 모니터링하십시오.
- 약한 신호가 있는 프로브의 경우 하룻밤 사이에 4°C에서 배양하고 염색 용액을 신선한 염색 용액으로 교체합니다.
- 원하는 염색 강도에 도달하면 염색 용액을 정지 용액의 3mL로 교체하고 30분 동안 바위를 흔들어 주세요.
- 정지 용액을 3mL의 신선한 정지 용액으로 교체하고 30 분 동안 바위를 흔들어 보입니다. 한 번 더 반복합니다.
- 애벌레를 새로운 유리 유리 유리 병으로 옮기고 정지 용액을 4mL의 신선한 고정 용액으로 대체하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 편의를 위해 4°C에서 더 오래 배양할 수 있습니다.
- 애벌레를 4°C의 어둠 속에서 고정용액에 최대 1년 동안 보관하십시오.
15. 12일차: 이미징
- 고정 용액을 4mL의 PBST로 교체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 흔들어보십시오.
- 애벌레를 6웰 플레이트로 옮기습니다.
- PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
- PBST를 50% 글리세롤(PBST)의 3mL로 교체하고 10분 동안 바위를 흔들어 보시면 됩니다.
- 15.4 단계에서 100% 글리세롤의 3mL로 10분 동안 흔들림 없이 용액을 교체하십시오.
- 해부 현미경을 사용하여 6웰 플레이트에서 애벌레를 직접 이미지화하거나 애벌레를 복합 현미경으로 이미지로 우울증 슬라이드로 옮기는다. 속눈썹 조작기를 사용하여 애벌레의 방향을 지정합니다.
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Representative Results
Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선을 이용하여, 이러한 좌식 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 신장 전구 세포 및 다양한 네프론 구조를 라벨링하는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 예상대로, 중추 신경계는 또한이 형질 전환선에 표시되어 있습니다 (표시되지 않음). 초기 메소네프릭 네프론은 약 5.2mm, 등쪽에서 발생하기 쉬운(그림 2A)을 형성하며, 이 네프론의 말단 튜블러는 EGFP10,12에 의해 표지된다. 전구체 클러스터는 이 단계에서 나중에 존재하며(그림 2A-B, 화살촉), 및 단일 전구 세포도 표지된다(그림 2C). 이 방법은 신장 발달을 공부하는 추가 공구를 제공하고 인간 신장을 이해하는 데 빛을 비추는 데 도움이됩니다.
그림 1: 유충 측정. 페트리 플레이트에 고정 된 애벌레는 평평한 통치자 위에 배치됩니다. 해부 현미경의 밑에, 애벌레는 유사한 크기의 단에 의해 측정되고 분리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 메손프로스 개발. Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선에서 약 5.2mm에서 최초의 메소네프릭 신장론이 배후와 수영 방광(SB)(A)에 대한 등쪽형성된다. 전구 세포의 클러스터는 단일 전구 세포 (C, 브래킷)이외에 메소네프로스 개발 (A-B, 화살촉) 중에 존재한다. 더 큰 청소년에서는, 배경 얼룩은 소암 (C, 화살표)에서 발생할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 시투 혼성화 방법은 메소네프로스 개발을 연구하는 것을 목표로 합니다. 그러나, 그것은 창 자, 신경계, 비늘 및 색소 침착14와 같은 변태 도중 그밖 조직 및 기관의 발달을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 프로브는 형질 전환선에서 내인성 유전자 또는 형광 마커를 위해 생성될 수 있다.
애벌레는 그들의 네이티브 맥락에서 장기와 조직을 관찰하기 위하여 그대로 남아 있는 것이 중요합니다. 조직의 무결성을 유지하기 위해 단백질 AE K 치료의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 효소의 각 새로운 배치에 대 한 최고의 치료 시간을 결정 하는 것이 중요 하다. 대안적으로, 아세톤은 단백질제 K 대신에 조직 무결성향상을 위해 사용될 수 있다16. 과도한 표백은 또한 조직의 무결성을 감소시킵니다. 표백을 최소화하고 눈이 세차 중에 애벌레를 시각화하는 데 약간의 색소 침착 도움을 유지하도록 허용합니다. 그것은 조직이 취약성의 표시인 혼성화 단계 도중 눈이 떨어지는 것이 일반적입니다. 고정 및 단백질Ae K 용액과 DMSO의 사용은 조직 침투에 매우 중요합니다17.
이 방법의 한계는 큰 동물에서 시약의 가난한 침투입니다. 침투를 개선하기 위해 헤드와 꼬리를 고정하기 전에 면도날로 제거할 수 있습니다17. 내장은 메손프로에 시약의 직접 액세스를 허용하기 위해 고정 후 미세 핀셋과 텅스텐 바늘로 제거 할 수 있습니다. 긴 프로브(1KB 이상)는 조직의 침투가 좋지 만, 침투력을 향상시키기 위해 짧은 단편(약 0.3 KB)으로 가수분해될 수 있다. 신호가 약한 프로브의 경우 감지 시퀀스를 사용한 제어 프로브를 사용하여 배경과 프로브 신호를 구분할 수 있습니다. 큰 동물은 소미트의 더 높은 배경 얼룩이있을 것이다 (그림 2C, 화살표). 그러나, 이것은 프로브 및 항체의 더 긴 세공으로 최소화될 수 있다.
여기에 프로토콜은 또한 해부 및 고립 된 조직 및 장기에 적용 될 수있다, 성인 제브라피시 신장 등12,19. 유사한 프로토콜9,16에 대한 설명이 게시되어 있지만, 그 중 어느 것도 이 수준의 세부 사항으로 애벌레 를 양육하는 것에서 시투 혼성화에 이르는 전체 프로세스를 설명하지 않습니다. 따라서, 이 방법은 척추동물 신장의 발달을 해독하는 추가 공구를 제공한다.
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Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
기금은 펜실베니아 과학 아카데미, 펜실베니아 생물학자의 연방, 펜실베니아 인디애나 대학 (대학원 연구 및 연구, 생물학부 및 신시아 수삭 학부 생물학 기금)에 의해 제공되었습니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 박사 닐 Hukriede에 의해 제공되었다 (피츠버그 대학).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
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