Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In situ Hybridisering i sebrafisk larver og ungdommer under Mesonephros Utvikling

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62930
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Summary

Sebrafisken er en viktig modell for å forstå nyreutvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll optimalisert for å oppdage genuttrykk i sebrafisk larver og ungdommer under mesonephros utvikling.

Abstract

Sebrafisken danner to nyrestrukturer i sin levetid. Pronephros (embryonal nyre) dannes under embryonal utvikling og begynner å fungere ved 2 dager etter befruktning. Bestående av bare to nephrons, fungerer pronephros som den eneste nyre under larvallivet til mer nyrefunksjon er nødvendig på grunn av den økende kroppsmassen. For å takle denne høyere etterspørselen begynner mesonephros (voksen nyre) å danne seg under metamorfose. Den nye primære nephrons sikringen til pronephros og danner tilkoblede lumen. Deretter smelter sekundære nephrons til primære (og så videre) for å skape et forgreningsnettverk i mesonephros. Det store flertallet av forskningen er fokusert på pronephros på grunn av den enkle å bruke embryoer. Dermed er det behov for å utvikle teknikker for å studere eldre og større larver og juvenil fisk for bedre å forstå mesonephros utvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll for genuttrykksanalyse optimalisert for sondeinntrengning, vasking av sonder og antistoffer, og bleking av pigmenter for bedre å visualisere mesonephros. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes til å merke stamceller og distale tubuli av nascent nephrons. Denne protokollen fyller et gap i mesonephros forskning. Det er en avgjørende modell for å forstå hvordan nye nyrevev dannes og integreres med eksisterende nefroner og gir innsikt i regenerative terapier.

Introduction

Sebrafiskembryoet er en viktig modell for å studere vevsutvikling på grunn av sin lille størrelse, gjennomsiktighet, tilgjengelige verktøy og overlevelse uten fôring i opptil fem dager1,2. Det har i stor grad bidratt til forståelsen av nyreutvikling og bevaring mellom sebrafisk og pattedyr3,4,5. Nyrene spiller en viktig rolle i å opprettholde væske homeostase, filtrere blodet og skille ut avfall6. Nephron, den funksjonelle enheten av nyrene, består av et blodfilter koblet til en lang tubule. I sebrafisk dannes to nyrestrukturer gjennom hele livet. Pronephros (den midlertidige embryonale nyren) dannes først under tidlig utvikling. Den består av to nephrons som løper langs den fremre bakre aksen og blir funksjonell på rundt 2 dager etter befruktning (dpf). Nytten av pronephros ligger i sin enkelhet, og har bare to nephrons som for det meste er lineære og enkle å visualisere (selv om den proksimale konvoluterte tubule begynner å spole på tre dpf)3. Dette har lagt til rette for ikke bare studier av den tidlige utviklingen fra mellomliggende mesoderm, men også segmenteringsmønsteret og tubule reparasjon7,8.

Nytten av sebrafisk blir begrenset etter fem dpf, når eggeplommen er redusert og larvene er avhengige av fôring i vannsystemet9. Rundt 2 uker gammel gjennomgår larvene metamorfose til ungdommer, hvor nye vev dannes og gamle vev går tapt og / eller omorganiseres9. Dette er også når mesonephros (den permanente voksne nyre) danner10,11,12. Den første voksne nephron dannes nær den sjette somite, og smelter sammen med den distale tidlige tubule av pronephros. Ytterligere nephrons legges til bakre til denne posisjonen i utgangspunktet, men også mot fremre senere. De primære nephrons i denne første bølgesikringen til tubuliene til pronephros og deler en felles lumen for å deponere avfallet. Sekundære nephrons dannes i neste bølge og smelter til primære nephrons. Denne gjentakende prosessen skaper en mesonephros som er forgrenet, noe som ligner pattedyrets nyre. Antagelig mister de utsattephros til slutt sin tubule identitet og blir to store samlekanaler der alle nephrons drenerer avfallet13.

Før dannelsen av den første voksne nephron begynner enkle stamceller å vises i ~ 4 mm (total lengde) larver (~ 10 dpf). Disse cellene, som er merket i Tg (lhx1a-EGFP) transgene linjen, holder seg til pronephros og ser ut til å migrere til fremtidige steder av nefogenese. Enkeltcellene samles i klynger, som skiller seg ut i nye nephrons12. Det er uklart hvor disse cellene ligger eller hvilke gener de uttrykker før mesonephrogenesis.

Å forstå mesonephros utvikling gir innsikt i pattedyr nyre på måter som pronephros ikke kan. Disse inkluderer dannelsen av nephrogenic aggregater fra enkelt forfedre celler, funksjonell integrasjon av nye nephrons med eksisterende, og forgrening morphogenesis. Det er imidlertid begrensninger for å studere postembryonisk utvikling. Larvene er mindre gjennomsiktige på grunn av deres større størrelse og har pigmentering. Utviklingstidslinjen er ikke synkron blant enkeltdyr og er svært avhengig av miljøfaktorer som fôring og trengsel9,14. Selv om knockdown reagenser eksisterer, er de mindre effektive i larver sammenlignet med embryoer15. I denne protokollen beskrives en in situ hybridiseringsmetode for å bestemme genuttrykk under sebrafisk mesonephros utvikling. Flere trinn er optimalisert for å øke visualiseringen av mesonephros og penetrasjon og vasking av sonden og antistoffet. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes sammen med en sonde for EGFP for å merke enkle stamceller, nefrogene aggregater og de distale tubuliene av nascent nephrons. Denne metoden vil gi en dypere forståelse av mesonephros utvikling og innsikt i regenerative terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av sebrafisk larver og juveniler er godkjent av IUP IACUC (protokoll #02-1920, #08-1920). Detaljer om løsningsinnholdet er oppført i materialfortegnelser.

1. Heve larver

MERK: Det vil ta opptil 21 dager eller mer å heve larver og ungdommer til interessestadiet.

  1. Sett opp voksen sebrafisk for å mate ved å legge til 1 mannlig og 1 kvinnelig fisk i en parringstank sent på ettermiddagen etter deres siste måltid.
    MERK: Ikke alle fiskepar vil parre seg. Begynn med å sette opp 20 par for å bestemme paringshastigheten og juster deretter i fremtidige eksperimenter.
  2. Neste dag etter at fisken er ferdig parring (rundt 13:00), samle embryoene med E3 medium i Petri plater.
    1. Forsikre deg om at det ikke er mer enn 30 embryoer per plate.
    2. Fjern rusk (som avføring) fra Petri-platene og tilsett 20 ml E3-medium.
    3. Inkuber ved 28,5 °C i 1 dag.
  3. Sett den voksne sebrafisken tilbake i vannsystemet.
  4. Ved 1 dpf erstatter du E3-mediet med frisk E3.
    1. Inkuber ved 28,5 °C i 4 dager til 5 dpf.
  5. Sett en 400 μm skjerm i en 2,8 L tank og fyll den med 2 cm systemvann.
    1. Tilsett 5 dpf larver fra 1 tallerken (opptil 30 totale larver).
    2. Sett tanken i vannsystemet, men ikke start vannstrømmen.
  6. Fôr larver 4 ml pulvermat to ganger om dagen til 14 dpf.
  7. Ved 6 dpf starter du vannstrømmen ved 1 drypp per sekund.
    MERK: Kontroller vannstrømmen daglig og juster deretter.
  8. Ved 8 dpf, øk vannstrømmen til en langsom, jevn strøm.
  9. Ved 14 dpf, mate levende saltlake reker i tillegg til pulvermat.

2. Dag 1 - 2: Feste larver

  1. Fjern en tank med larver på ønsket tidspunkt.
  2. Fyll en Petri plate med 20 ml systemvann.
  3. Bruk et fint nett for å forsiktig øse larver og bringe dem til vannoverflaten.
    1. Klipp av spissen av en overføringspipette for å gi en bredere åpning og overføre larver til Petri-platen. Den større pipettemunnen tillater overføring av flere små larver eller noen større på en gang.
  4. Tilsett 2 ml trikain (2%, pH 7 lager) for å immobilisere larver.
    1. Etter at larvene slutter å bevege seg, fjern det meste av vannet og tilsett 10 ml trikain. Vent i 15 min for at larvene skal avlives.
    2. Valgfritt: For ungdommer som er lengre enn 8 mm, klipp av hodene og halene med et barberblad (etter eutanasi) under et dissekeringsmikroskop for å forbedre penetrasjonen av festeløsningen. Pass på å registrere den totale lengden på hvert dyr før du kutter av hodet og halen og isolerer hver enkelt i sin egen Petri-tallerken. Se trinn 3 for hvordan du måler dyrene.
  5. Bytt ut trikainen med 20 ml festeløsning (4% paraformaldehyd, 1% DMSO). Sett lokket tilbake på Petri-platen og gyng sakte i en avtrekkshette.
    MERK: Det er viktig å bruke en gyngeplattform. En risteplattform med sirkulær bevegelse vil føre til at dyreaksen blir buet. Bruk kun fersk (ikke ferdiglaget frossen) festeløsning.
    FORSIKTIG: Festeløsningen inneholder paraformaldehyd, som er et sannsynlig kreftfremkallende middel. Bruk avtrekkshette (eller maske) og hansker for å måle pulveret.
  6. Etter 30 min, bytt ut festeløsningen med en ny festeløsning.
    1. Samle den brukte festeløsningen i en separat avfallsbeholder for riktig avhending.
    2. Overfør larvene til et 50 ml rør som inneholder 25 ml fersk festeløsning.
    3. Pass på at hetten er stram og gyng sakte ved 4 °C i 2 dager. Det er mulig å inkubere lenger for enkelhets skyld.

3. Dag 3: Måling av larver

  1. I en avtrekkshette må festeløsningen skiftes ut med 20 ml PBST.
  2. Overfør larvene til en Petri-plate.
  3. Sett en flat linjal på et dissekerende mikroskop og legg Petri-platen på toppen av linjalen.
  4. Bruk en øyenvippemanipulator til å flytte hver larve til linjalen for å måle den totale lengden (fra snuten til spissen av kaudalfinen) (figur 1).
  5. Kombiner flere larver av lignende lengder (f.eks. 5,0 mm og 5,1 mm) i ett 5,5 ml hetteglass, opptil 10 larver per hetteglass.

4. Dag 3 - 4: Dehydrering

  1. Bytt ut PBST med 4 ml 100 % metanol. Rock hetteglasset i 5 min ved romtemperatur.
  2. Bytt ut metanol med frisk metanol og stein i 5 min. Gjenta en gang til.
  3. Oppbevar hetteglasset ved -20 °C i 2 dager. Det er mulig å inkubere lenger for enkelhets skyld.

5. Dag 5: Rehydrering

  1. Varm hetteglasset til romtemperatur.
  2. Bytt ut metanol med 4 ml 75 % metanol/25 % PBST. Stein i 5 min ved romtemperatur.
  3. Bytt ut oppløsningen i trinn 5.2 med 4 ml 50% metanol / 50% PBST og stein i 5 min.
  4. Bytt ut oppløsningen i trinn 5.3 med 4 ml 25% metanol / 75% PBST og stein i 5 min.
  5. Bytt ut oppløsningen i trinn 5.4 med 4 ml PBST og berg i 10 min.
  6. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.

6. Dag 5: Proteinase K fordøye

  1. Bytt ut PBST med 2 ml proteinase K-oppløsning (20 μg/ml, 1 % DMSO-sluttkonsentrasjon i PBST) og berg ved romtemperatur i 30 minutter.
    MERK: Larver som er lengre enn 6 mm trenger lengre inkubasjonstid og/eller høyere proteinase K-konsentrasjon. Den nøyaktige tiden og konsentrasjonen må bestemmes empirisk. Start med en 10 min økning i inkubasjonstid for hver 0,5 mm lengre enn 6 mm.
  2. Bytt ut proteinase K-oppløsningen med 4 ml PBST og stein i 10 min.
  3. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  4. Bytt ut PBST med 4 ml fersk festeløsning og stein i 1 time. Det er mulig å inkubere lenger ved 4 °C for enkelhets skyld.

7. Dag 5: Bleking

  1. Bytt ut festeløsningen med 4 ml PBST og stein ved romtemperatur i 10 min.
  2. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  3. Overfør larvene til en 6-brønns plate (opptil 10 larver per brønn).
  4. Bytt ut PBST med 3 ml fersk blekemiddelløsning.
  5. Rock ved romtemperatur og overvåke pigmentering under et dissekering mikroskop hver 5 min. Se etter forsvinningen av pigmentering langs mesonephros (dorsal til svømmeblæren og tarmen).
    MERK: For larver som er opptil 6 mm lange, vil det ta opptil 20 minutter å bleke pigmenteringen rundt mesonephros. Ikke bleke lenger enn nødvendig for å bevare larvens integritet.
  6. Overfør larvene tilbake til et hetteglass av glass.
  7. Skift ut blekeløsningen med 4 ml PBST. Rock i 10 min.
  8. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  9. Bytt ut PBST med 4 ml fersk festeløsning og stein i 1 time. Det er mulig å inkubere lenger ved 4 °C for enkelhets skyld.

8. Dag 5: Prehybridization

MERK: For trinn som gjøres ved 70 °C, er det viktig å arbeide raskt for å minimere nedkjølingen av hetteglasset.

  1. Bytt ut festeløsningen med 4 ml PBST og stein ved romtemperatur i 10 min.
  2. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  3. Bytt ut PBST med 4 ml hyb-oppløsning, og berg ved romtemperatur i 10 min.
    FORSIKTIG: Hyb-, Hyb+- og sondeløsningene inneholder formamid, som kan irritere huden. Bruk hansker til å håndtere disse løsningene.
  4. Bytt hyb- med 4 ml frisk hyb- og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
    1. Samle de brukte Hyb-, Hyb+- og sondeløsningene i en separat avfallsbeholder for riktig avhending.
  5. Skift ut Hyb- med 4 ml hyb+-oppløsning.
  6. Inkuber hetteglasset ved 70 °C over natten.
  7. Fortynn EGFP-fluoresceinsonden 1:100 i 500 μL Hyb+ og inkuber den O/N ved 70 °C.
    MERK: Følg produsentens instruksjoner for sondesyntese.

9. Dag 6: Probe hybridisering

  1. Skift ut Hyb+-oppløsningen i hetteglasset med den forvarmede sonden og inkuber ved 70 °C over natten.
    MERK: Larver som er lengre enn 6 mm trenger 2 dager med inkubasjon.
  2. Forvarm vaskebufferen, 2x SSCT og 0,2x SSCT-oppløsninger ved 70 °C over natten.

10. Dag 7: Sondevask

  1. Bytt ut sonden med 4 ml av den forvarmede vaskebufferen og inkuber ved 70 °C i 30 minutter.
    1. Samle den brukte sonden i en separat avfallsbeholder for riktig avhending.
  2. Bytt ut vaskebufferen med 4 ml fersk vaskebuffer og inkuber ved 70 °C i 30 minutter.
  3. Bytt ut vaskebufferen med 4 ml av den forvarmede 2x SSCT-oppløsningen og inkuber den ved 70 °C i 15 minutter.
  4. Tilsett 50 ml forvarmet 0,2x SSCT i et 50 ml rør.
    1. Sett en cellesil (100 μm) inn i toppen av røret. Påse at cellesilen skyves helt ned til den stopper.
    2. Overfør larvene fra hetteglasset i glasset til cellesilen. Forsikre deg om at larvene er nedsenket i bufferen og inkuberer ved 70 °C i 2 timer.
  5. Forbered et nytt rør som inneholder 50 ml forvarmet 0,2x SSCT.
    1. Overfør cellesilen fra trinn 10.4.2 til det nye røret på 0,2x SSCT og inkuber ved 70 °C i 2 timer.
    2. Gjenta trinn 10.5 en gang til.

11. Dag 7: Blokkering

  1. Overfør larvene til et nytt hetteglass og avkjøl til romtemperatur.
  2. Bytt ut 0,2x SSCT med 4 ml 67 % 0,2x SSCT/33 % MABT og stein ved romtemperatur i 10 minutter.
  3. Bytt ut oppløsningen i trinn 11,2 med 4 ml 33 % 0,2x SSCT/67 % MABT og stein i 10 minutter.
  4. Bytt ut oppløsningen i trinn 11.3 med 4 ml MABT og berg i 10 min.
  5. Bytt ut MABT med 4 ml fersk MABT og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  6. Bytt ut MABT med 4 ml blokkeringsløsning og inkuber ved 4 °C over natten. Det er mulig å inkubere lenger for enkelhets skyld.

12. Dag 8 - 9: Antistoff inkubasjon

  1. Fortynn anti-fluorescein antistoffet 1:5,000 i 500 μL blokkeringsløsning.
  2. Bytt ut blokkeringsløsningen med antistoffoppløsningen og inkuber ved 4 °C i 2 dager. Det er mulig å inkubere lenger for enkelhets skyld.
    1. Virvle hetteglasset to ganger om dagen for å agitere larver.
      MERK: Larver lenger enn 6 mm trenger 1-2 dager til inkubasjon.

13. Dag 10 - 11: Antistoff vasking

  1. Bytt ut antistoffløsningen med 4 ml PBST og stein ved romtemperatur i 10 min.
  2. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  3. Overfør larvene til et 50 ml rør.
  4. Tilsett 40 ml PBST2. Legg røret på siden og stein ved 4 °C over natten.
  5. Bytt ut PBST2 med 40 ml fersk PBST2 og berg ved 4 °C over natten. Det er mulig å inkubere lenger for enkelhets skyld.
    MERK: Larver som er lengre enn 6 mm trenger 1-2 dager til med vasking.

14. Dag 12: Farging

  1. Overfør larvene til en 6-brønns plate.
  2. Bytt ut PBST2 med 3 ml fargebuffer og stein ved romtemperatur i 5 minutter.
  3. Bytt ut fargebufferen med 3 ml fersk fargebuffer og stein i 5 min. Gjenta en gang til.
  4. Bytt ut fargebufferen med 3 ml av fargeløsningen. Dekk med aluminiumsfolie og overvåk fargingen i løpet av de neste timene.
    1. For sonder med et svakt signal, inkuber ved 4 °C over natten og bytt ut fargingsløsningen med frisk fargingsoppløsning en gang i mellom.
  5. Når ønsket fargingsintensitet er nådd, bytt ut fargingsløsningen med 3 ml stoppløsning og stein i 30 min.
  6. Bytt ut stoppløsningen med 3 ml fersk stoppløsning og stein i 30 min. Gjenta en gang til.
  7. Overfør larvene til et nytt hetteglass og erstatt stoppløsningen med 4 ml fersk festeløsning og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Det er mulig å inkubere lenger ved 4 °C for enkelhets skyld.
  8. Oppbevar larvene i festeløsningen i mørket ved 4 °C i opptil ett år.

15. Dag 12: Bildebehandling

  1. Bytt ut festeløsningen med 4 ml PBST og stein ved romtemperatur i 10 min.
  2. Overfør larvene til en 6-brønns plate.
  3. Bytt ut PBST med 4 ml frisk PBST og stein i 10 min. Gjenta en gang til.
  4. Bytt ut PBST med 3 ml 50% glyserol (i PBST) og stein i 10 min.
  5. Bytt ut oppløsningen i trinn 15.4 med 3 ml 100% glyserol uten gynging i 10 min.
  6. Bruk et dissekerende mikroskop for å avbilde larvene direkte i 6-brønnsplaten eller overfør larvene til et depresjonsskred til bilde under et sammensatt mikroskop. Bruk en øyenvippemanipulator for å orientere larver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) ble det demonstrert at denne in situ hybridiseringsprotokollen er effektiv i merking av nyreforfederceller og ulike nephronstrukturer under mesonephros utvikling. Som forventet er sentralnervesystemet også merket i denne transgene linjen (ikke vist). Den første mesonephric nephron dannes på ca 5,2 mm, dorsal til pronephros (figur 2A), og distal tubule av denne nephron er merket av EGFP10,12. Stamcelleklynger er til stede på dette stadiet og senere (figur 2A-B, pilspisser) og enkelt stamceller er også merket (figur 2C). Denne metoden gir et ekstra verktøy for å studere nyreutvikling og bidrar til å belyse forståelsen av den menneskelige nyre.

Figure 1
Figur 1: Måle larver. Faste larver i en Petri-plate er plassert på toppen av en flat linjal. Under et dissekerende mikroskop måles larvene og separeres av grupper av lignende størrelser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mesonephros utvikling. Ved rundt 5,2 mm i Tg(lhx1a-EGFP) transgen linje, dannes den første mesonefriske nefroen dorsal til pronephros og svømmeblære (SB) (A). Klynger av stamceller er til stede under mesonephros utvikling (A-B, pilspisser) i tillegg til enkle stamceller (C, brakett). I større ungdommer kan bakgrunnsfarging forekomme i somittene (C, piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In situ hybridiseringsmetoden beskrevet her er rettet mot å studere mesonephros utvikling. Det kan imidlertid brukes til å studere utviklingen av andre vev og organer under metamorfose, som tarm, nervesystem, skalaer og pigmentering14. Sonder kan genereres for endogene gener eller fluorescerende markører i transgene linjer.

Det er viktig for larvene å forbli intakte for å observere organer og vev i sin opprinnelige sammenheng. For å beholde vevsintegriteten er det viktig å minimere tiden for proteinase K-behandling. Det er viktig å bestemme den beste behandlingstiden for hver ny gruppe enzym. Alternativt kan aceton brukes i stedet for proteinase K for forbedret vevsintegritet16. Overdreven bleking reduserer også vevsintegriteten. Minimal bleking og la øynene beholde litt pigmentering hjelper til med å visualisere larver under vask. Det er vanlig at øynene faller av under hybridiseringstrinnet, som er en indikator på vevsskjørhet. Bruk av DMSO med feste og proteinase K-løsning er avgjørende for vevsinntrengning17.

En begrensning av denne metoden er dårlig penetrasjon av reagenser hos større dyr. For å forbedre penetrasjonen kan hodet og halen fjernes med et barberblad før fiksering17. Tarmen kan fjernes med fine pinsett og wolfram nåler etter fiksering for å tillate direkte tilgang av reagensene til mesonephros. Lange sonder (større enn 1 KB) kan ha dårlig penetrasjon av vevet, men de kan hydrolyseres i korte fragmenter (rundt 0,3 KB) for å forbedre penetrasjonen18. For sonder med svake signaler kan kontrollsonder med sansesekvensen brukes til å skille mellom bakgrunnen og sondesignalet. Større dyr vil ha en høyere bakgrunnsfarging av somittene (figur 2C, piler). Dette kan imidlertid minimeres med lengre vasker av sonden og antistoffer.

Protokollen her kan også brukes på dissekert og isolert vev og organer, for eksempel den voksne sebrafisk nyre12,19. Selv om det er publiserte beskrivelser av lignende protokoller9,16, beskriver ingen av dem hele prosessen fra oppdrett av larver til in situ hybridisering med dette detaljnivået. Derfor gir denne metoden et ekstra verktøy for å dechiffrere utviklingen av virveldyr nyre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Finansieringen ble gitt av Pennsylvania Academy of Science, og Commonwealth of Pennsylvania Biologists, og Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, og Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) ble levert av Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-fluorescein antibody Roche/Sigma-Aldrich 11426338910
Bleaching solution 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent Roche/Sigma-Aldrich 11096176001 Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer Fisher Scientific  22-363-549 100 μm
E3 medium 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator Fisher Scientific NC1083208 Use to manipulate larvae
Fixing solution 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis Roche/Sigma-Aldrich 11685619910
Glass vial Fisher Scientific 03-338B
Hatchfry encapsulation Argent
Hyb- solution 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X) 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT 1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
PBS (10X) 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST 1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2 1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K Sigma-Aldrich P5568 Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution 20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder Argent
SSC (20X) 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA Sigma-Aldrich R6625
Tricaine Sigma Aldrich E10521 2%, pH 7
Wash buffer 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
  2. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
  3. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
  5. Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
  6. Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
  7. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
  8. Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
  9. McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
  10. Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
  11. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  12. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  13. Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
  14. Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  15. Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
  16. Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
  17. Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
  18. Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
  19. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 174 sebrafisk nyre pronephros mesonephros lhx1a larve juvenile
<em>In situ</em> Hybridisering i sebrafisk larver og ungdommer under Mesonephros Utvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kasar, S. N., Grandinette, S. A.,… More

Kasar, S. N., Grandinette, S. A., Semelsberger, S. D., Diep, C. Q. In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development. J. Vis. Exp. (174), e62930, doi:10.3791/62930 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter