Summary
ここでは、ショウ ジョウバエのメラノガスターの 腸内酸性化を最適な出力でモニタリングするための標準化されたプロトコルを提示する。我々はまず、ショウジョウバエ のメラノガスター における腸内酸性化モニタリングにこのプロトコルを使用し、次に非モデル ショウジョウバエ 種におけるその使用を実証する。
Abstract
ショウジョウバエの中腸は複数の領域からなり、それぞれが腸の適切な機能に必要なユニークな生理学的機能を実行する細胞で構成されています。そのような領域の1つである銅細胞領域(CCR)は、中腸中部に局在し、部分的には銅細胞として知られる細胞群からなる。銅細胞は胃酸分泌に関与しており、進化的に保存されたプロセスであり、その正確な役割はほとんど理解されていない。この論文は、成体の ショウジョウバエのメラノガスター 腸の酸性化をアッセイするために使用される現在のプロトコルの改善を説明し、それが他の種のハエに使用できることを実証する。特に、この論文は、腸内酸性化がハエの栄養状態に依存していることを実証し、この新しい知見に基づくプロトコルを提示する。全体として、このプロトコルは、腸内酸性化のメカニズムの根底にある一般原則を明らかにするために ショウジョウバエ の銅細胞を研究することの潜在的な有用性を示しています。
Introduction
昆虫の腸では、銅細胞は哺乳類の胃の酸産生胃頭頂細胞(オキシンティックとしても知られる)と細胞的および機能的な類似性を共有する。この細胞群は腸管腔に酸を放出する。酸分泌と解剖学の機能は進化的に保存されている。排出される酸の主な成分は塩酸と塩化カリウムです。細胞内の酸形成の化学的メカニズムは、炭酸脱水酵素に依存する。この酵素は、CO2と水から重炭酸イオンを生成し、それがヒドロキシルイオンを遊離させ、カリウムと引き換えにプロトンポンプを介して内腔に排出される。塩化物およびカリウムイオンは、コンダクタンスチャネルによって内腔に輸送され、胃液の主成分である塩酸および塩化カリウムの形成をもたらす1,2,3,4。
酸形成のメカニズムはよく理解されているが、酸分泌を調節する生理学的メカニズムについては、あまり知られていない。この方法を開発する目的は、酸の形成と分泌を調整する細胞経路をよりよく描写し、腸の生理学と恒常性を媒介する酸の役割を決定するのを助けることです。この技術の開発と使用の背後にある理論的根拠は、ショウジョウバエおよび非モデル生物における腸内酸性化のプロセスを研究するための一貫した信頼できる方法を提供することである。ショウジョウバエの中腸酸性化を決定するための標準的なプロトコルが現在存在するが2,5,6、このプロトコルを銅細胞機能の研究に使用しながら、野生型(WT)ハエにおける酸性化の程度に有意な変動性が観察された。この観察された変動性の基礎を理解し、一貫した結果を得るために、標準プロトコルのいくつかの側面が以下に説明するように最適化されました。
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Protocol
注:標準的な実験室ラインオレゴンRは、WTコントロールとして使用されました。すべてのハエは、標準的なコーンミール - 糖蜜培地(糖蜜、寒天、酵母、コーンミール、テゴセプト、プロピオン酸、および水を含む)上で、室温で12/12時間の明暗概日リズムで飼育した。
アッセイの準備
- CO2麻酔下で雌のハエ(生後0〜2 日、非処女)を収集し、実験前に少なくとも3日間、標準的なコーンミール食品で回復させる。
- 室温(〜23°C)で約24時間、実験室で拭き取り組織を含むバイアル中で、約2mLの脱イオン水でハエを飢えさせる。
- ブロモフェノールブルー(BPB)でフライフードを次のように準備します:
- フライ食品を電子レンジで溶かし、ぬるま湯になるまで冷まします。
- 1mLのぬるま湯に1mLの4%BPBを加え、よく混ぜる。
- ピペットを使用して、BPBを含むフライ食品をペトリ皿の中央にある単一の点(〜200μL)に加える。
腸内酸性化モニタリングアッセイ
- 飢えたハエを、2%ブロモフェノールブルー(BPB)を添加した単一ドット(200μL)のハエ食品を含むペトリ皿に移す。ハエが光にさらされながら室温で4時間餌を採餌するのを許します。
- 4時間後、ハエを集めて氷の上で麻酔をかけます。外科的に彼らの腸を隔離する。
- 実体顕微鏡下で鉗子で1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で手術を行います( 材料表を参照)。一対の鉗子で胸部を保持し、腸のCCRが見えるまで2対目の対で腹部を引き下げ、腸が両端に取り付けられたままになるように注意して、腸を隔離する。
- 腸のCCRの色を調べることによって腸の酸性化を決定する(図1C;黄色は酸性を示し、青は酸性化していないことを示す)。
- 腸内で堅牢なBPB染色を示すハエだけを数えます。
- 次の式を使用してパーセンテージを計算します。
酸性化されたガットを持つハエの割合=酸性化されたハエの数×100 /(酸性化されたハエの数+酸性化されていないハエの数)
注: 0 の割合は、腸を酸性にしたハエがいないことを示し、100 の割合は、すべてのハエが腸を酸性にしたことを示します。
3. 取り付けと画像取得
注:このステップは、サンプルを長期間保存できないため、さらなる分析のためにそれぞれの条件の画像を取得して処理するための追加です。これらの画像は、腸内酸度の定量には使用されていません。
- 解剖後、PBS中のサンプルをスライドガラスに取り付けます。
- cellSens Entryソフトウェアを使用して顕微鏡下で画像を取得します( 材料表を参照)。
- 準備したスライドを顕微鏡下に置き、接眼レンズを使用してサンプルを調整します。
- 接眼レンズをシャットオフして、カメラのシャッターを開きます。
- 接続されているコンピューターでソフトウェアを開きます。
- 正しい対物レンズを選択し、 ライブ ボタンをクリックして、エクスポーザー時間調整付きの標準設定を選択します。
- CCR 領域に焦点を合わせ、スナップショットを作成します。
- スナップショットイメージウィンドウを右クリックし、.tifファイルとして保存します。
- フィジーのソフトウェアを使用して、画像をさらに整列させて処理します。
- フィジーのソフトウェアで.tifファイルをインポートし、無関係な背景をクリアします。
- 強度とコントラストを調整して、CCRと他の腸領域を最適化します。
- スケール バーを追加し、.tif ファイルとして保存します。
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Representative Results
オレゴンRの雌のハエを20時間以上飢えさせ、BPB(2%)を補給した食物を約12時間食べさせた7,8,9,10,11。ブロモフェノールブルー(BPB)はpH検出色素です。pH 3.0 の黄色から pH 4.6 以上の青色に変わります。腸郭清後、以前に報告したように、いくつかのハエは腸のCCRにおいて黄色で示されるように酸を産生することが判明した(図1B)。驚くべきことに、公表された結果とは対照的に、いくつかのハエの腸は青く、腸を酸性化できなかったことを示唆している。これらの一貫性のない結果は、一貫性のある解釈可能な結果を得るためにプロトコルを変更する必要があることを示しました。
BPBプロトコルを最適化するために、2つの新しい変更が組み込まれました。まず、摂食の開始をよりよく制御するために、ハエを飢えさせ、次にプレートの中央にBPBを有する食物の斑点に置いた(図1A)。第二に、摂食開始に近い時点での腸内酸性化のアッセイを開始した。雌のハエは>20時間飢えさせ、小さなペトリプレートアリーナでBPBを含むハエの餌を提供し( 図1A参照)、1時間間隔で腸を解剖しながら4時間まで様々な時点まで餌をやった。酸性化腸(黄色)と非酸性化腸(青色)の数を求め、腸内酸性化を示すハエの割合を各時点について算出した(図1B)。30分以内に、ハエの約20%が腸を酸性化しました。1時間後、腸の〜40%が酸性化の証拠を示し、一方、摂食の2時間後および3時間後には、酸性化された腸の割合はそれぞれ〜60%および〜70%に増加した(図1B)。これは、時間の経過とともに腸内酸性化を示すハエの割合が増加していることを示している。ハエを4時間給餌すると、腸のほぼ90〜95%が酸性化されました(図1B)。我々は、その後の実験のために4時間給餌のこの最適化されたプロトコルを使用した。
摂食の効果に加えて、ハエが上昇した温度が腸内酸性化に及ぼす影響を調べた。ハエは23°Cと30°Cで飼育され、雌のハエは約20時間飢えていました。次いで、ハエにBPBを添加したハエの餌を4時間給餌し、腸内酸性化の割合を上記のように決定した。これら2つの温度について腸内酸性化に差は見られず(図1C)、摂食とは異なり、温度が腸内酸性化に影響を及ぼさないことが示唆された。
非モデル生物のための腸酸性化プロトコルのデモンストレーション
ショウジョウバエ の種は何百万年もかけて系統学的に分離されています( 図2A参照)。この広大な期間にわたって、彼らは異なる生息地や食事に適応し12、いくつかの種が D.メラノガスターと同じ方法で腸を酸性化しない可能性を高めました。 我々は、D. melanogaster (果実)、D. sechecllia (モリンダ果実)、D. erecta (パンダナス果実)、D. pseudoosubcura & D. virilis (植物樹液)、および D. mojavensis (サボテン果実)を使用した(図2B)。このプロトコルが他の ショウジョウバ エ種に使用できることを実証するために、これらの種にBPBを添加したハエ食品を4時間給餌し、腸内酸性化の割合を上記のように決定した。試験した全ての種について堅牢な腸内酸性化が観察された(図2B)。この結果は、腸の酸性化が多様な ショウジョウバエ 種の間で進化的に保存されており、このプロトコルが他の生物にも容易に実施できることを示唆している。
図1:腸内酸性化モニタリング(A)給餌場の模式図。青い点はブロモフェノールブルー(pHを示す色素)のフライフードを表しています。他の斑点はフルーツハエを表しています。(B)4時間以上の異なる期間にわたって給餌された腸内酸性化を示すハエの割合のグラフ表示。酸性化腸と非酸性化腸の代表的な腸内像。赤い矢印は、中腸の銅細胞領域における酸性放出を示す。n=4回の実験、1回の実験につき25〜30匹の雌ハエ。スケールバー = 500 μm それぞれ。アスタリスクは対照群との有意差を示す(一元配置分散分析、その後にボンフェローニ検定が続く) *P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.0001.(c)ハエにBPBとともにハエ食品を23°Cまたは30°Cで4時間給餌した。 腸内酸性化を示すハエの割合(%)。n=4回の実験、1回の実験につき25〜30匹の雌ハエ(不対t検定、続いてノンパラメトリックマン・ホイットニーU検定およびウィルコクソン順位和検定。省略形: ns = 重要ではありません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腸内酸性化現象の 系統発生(A) ショウジョウバエ の系統発生的関係と、その摂食習慣・生息環境1 mmの棒は100万年を示します。(b)腸内酸性化を示すハエ(ショウジョウバ エ種)の割合は、BPBを餌にしたハエを4時間にわたって餌付けした n =4回の実験、1回の実験につき25〜30匹の雌ハエ(一元配置分散分析、続いてボンフェローニ試験)である。省略形: ns = 重要ではありません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの重要なステップは、酸性化表現型のCCRを視覚化するための腸の適切な解剖です。銅細胞から放出された酸は、腸が無傷のときにCCRに閉じ込められる。しかし、解剖中、腸の破裂によって引き起こされる漏出は、CCRからの酸の拡散につながり、酸性化のために誤って負とスコア付けされた腸をもたらす可能性がある。さらに、酸性化を示す黄色は解剖後5〜10分以内に退色し、単離後すぐに酸性化表現型について腸をスコアリングすることの重要性を強調する。最後に、ハエの腸内の酸性化の状態をアッセイする現在のプロトコル7,8,9,10,11は、動物の摂食状態を考慮することなく、BPBによるハエの食物の補給に依存している。しかし、私たちの研究の間に、腸の酸性化は構成的ではなく、むしろ以前の飢餓後の摂食に依存することがわかりました。そのため、BPBを腸内pHの指標として用いて腸の酸状態を正確に評価するには、ハエの栄養状態と、考慮される他の変数を考慮する必要があります。
腸の酸性化は、より低い多細胞生物からより高い生物まで保存される。しかし、ほとんどの動物におけるその機能と、それを調節する分子および細胞経路の全範囲についてはほとんど知られていない。ヒトでは、腸内酸性化の欠如は栄養素の吸収不良と関連していますが、腸内の過剰な酸は腸潰瘍を引き起こす可能性があります13。したがって、腸内酸性化に関する研究から得られた知見は、酸分泌の調節の欠陥によって引き起こされる腸疾患の治療と治癒に関する新たな洞察を提供する可能性が高い。
ショウジョウバエは最近、腸内酸性化の研究のための強力なモデルとして浮上しています2,5,6。遺伝学的研究は、酸分泌細胞の樹立に必要な遺伝子と酸の産生に関与する機構を同定した。薬物研究も行われている。例えば、ハエに炭酸脱水酵素(CAH)阻害剤であるアセタゾラミド7を給餌すると腸の酸性化が防止され、酸産生に必要なプロトンの産生においてCAHが果たす中心的な役割と一致します。このプロトコルは、研究者が迅速かつ費用対効果の高い方法で腸内酸性度の薬物阻害剤または活性化剤を発見するのに役立つと期待しています。さらに、この方法を遺伝的および生化学的アプローチと組み合わせて適用することは、酸分泌に関与する細胞経路を明らかにし、腸および生物の恒常性における腸内酸性化の役割を特定するのに役立つであろう。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、著者の研究室での仕事への支援は、HHMI教員奨学生賞とUTサウスウェスタンメディカルセンターの児童研究所からのスタートアップ資金によって提供されていることを認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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