Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نموذج ثقب الأوعية الدموية الداخلية للنزيف تحت العنكبوتية جنبا إلى جنب مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3, 2,3, 1, 1
1Department of Neurosurgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, and Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Department of Experimental Neurology and Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3NeuroCure Cluster of Excellence and Charité Core Facility 7T Experimental MRIs, Charité - Universitätsmedizin Berlin
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا نموذجا موحدا للفأر SAH ، الناجم عن ثقب خيوط الأوعية الدموية ، جنبا إلى جنب مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) بعد 24 ساعة من العملية لضمان موقع النزيف الصحيح واستبعاد الأمراض الأخرى ذات الصلة داخل الجمجمة.

Abstract

نموذج ثقب الخيوط داخل الأوعية الدموية لتقليد النزيف تحت العنكبوتية (SAH) هو نموذج شائع الاستخدام - ومع ذلك ، يمكن أن تسبب هذه التقنية معدل وفيات مرتفعا بالإضافة إلى حجم لا يمكن السيطرة عليه من SAH والمضاعفات الأخرى داخل الجمجمة مثل السكتة الدماغية أو النزيف داخل الجمجمة. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم نموذج فأر SAH موحد ، مستحث عن ثقب خيوط داخل الأوعية الدموية ، جنبا إلى جنب مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) بعد 24 ساعة من العملية لضمان موقع النزيف الصحيح واستبعاد الأمراض الأخرى ذات الصلة داخل الجمجمة. باختصار ، يتم تخدير الفئران C57BL / 6J بحقن الكيتامين / الزيلازين داخل الصفاق (70 ملغ / 16 ملغ / كغ من وزن الجسم) ووضعها في وضع ضعيف. بعد شق الرقبة في خط الوسط ، يتم الكشف عن الشريان السباتي المشترك (CCA) والتشعب السباتي ، ويتم إدخال خياطة البولي بروبيلين أحادية الخيوط غير القابلة للامتصاص 5-0 بطريقة رجعية في الشريان السباتي الخارجي (ECA) والتقدم إلى الشريان السباتي المشترك. بعد ذلك ، يتم غزو الخيوط في الشريان السباتي الداخلي (ICA) ودفعها إلى الأمام لثقب الشريان الدماغي الأمامي (ACA). بعد الشفاء من الجراحة ، تخضع الفئران للتصوير بالرنين المغناطيسي 7.0 T بعد 24 ساعة. يمكن تحديد حجم النزيف وتصنيفه عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي بعد العملية الجراحية ، مما يتيح مجموعة SAH تجريبية قوية مع خيار إجراء المزيد من تحليلات المجموعة الفرعية بناء على كمية الدم.

Introduction

يحدث النزيف تحت العنكبوتية (SAH) بسبب تمزق تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة ويشكل حالة طوارئ تهدد الحياة ، مرتبطة بأمراض ووفيات كبيرة ، وهو ما يمثل حوالي 5٪ من السكتات الدماغية 1,2. مرضى SAH الذين يعانون من صداع شديد ، وخلل وظيفي عصبي ، واضطراب تدريجي في الوعي3. يموت حوالي 30٪ من مرضى SAH خلال أول 30 يوما بعد حدث النزيف الأولي4. سريريا ، يعاني 50٪ من المرضى من إصابات الدماغ المتأخرة (DBI) بعد إصابة الدماغ المبكرة. يتميز DBI بنقص التروية الدماغية المتأخر والعجز العصبي المتأخر. أظهرت الدراسات الحالية أن الآثار التآزرية للعديد من العوامل المختلفة تؤدي إلى فقدان الوظيفة العصبية ، بما في ذلك تدمير الحاجز الدموي الدماغي ، وتقلص الشرايين الصغيرة ، وخلل الدورة الدموية الدقيقة ، وتجلط الدم 5,6.

أحد الجوانب الفريدة ل SAH هو أن الإمراض ينشأ من موقع خارج المتني ولكنه يؤدي بعد ذلك إلى شلالات ضارة داخل الحمة: يبدأ علم الأمراض بتراكم الدم في الفضاء تحت العنكبوتية ، مما يؤدي إلى العديد من التأثيرات داخل الأروقيات ، مثل الالتهاب العصبي ، موت الخلايا المبرمج العصبي والبطاني ، إزالة الاستقطاب القشري الانتشار ، وتشكيل وذمة الدماغ7 ، 8.

البحث السريري محدود بعدة عوامل ، مما يجعل النموذج الحيواني عنصرا حاسما في محاكاة التغيرات الباثومية للمرض باستمرار ودقة. تم اقتراح بروتوكولات نموذج SAH مختلفة ، على سبيل المثال ، حقن الدم الذاتي في الصهريج الضخم (ACM). أيضا ، طريقة معدلة مع حقن مزدوج من الدم الذاتي في صهريجنا ماجنا وصهريج chiasm البصري (APC) على التوالي 9,10. في حين أن حقن الدم الذاتي هو وسيلة بسيطة لمحاكاة العملية المرضية للتشنج الوعائي والتفاعلات الالتهابية بعد النزيف تحت العنكبوتية ، فإن الارتفاع التالي للضغط داخل الجمجمة (ICP) بطيء نسبيا ، ولا يتم تحفيز أي تغييرات جديرة بالملاحظة في نفاذية الحاجز الدموي الدماغي11,12. طريقة أخرى ، وضع الدم حول الشرايين ، وعادة ما تستخدم في نماذج SAH الكبيرة (على سبيل المثال ، القرود والكلاب) ، تتضمن وضع دم ذاتي مضاد للتخثر أو منتجات دم مماثلة حول الوعاء. يمكن ملاحظة تغيرات قطر الشريان باستخدام المجهر ، ليكون بمثابة مؤشر على التشنج الوعائي الدماغي بعد SAH13.

وصف باري وآخرون لأول مرة نموذج ثقب داخل الأوعية الدموية في عام 1979 حيث يتعرض الشريان القاعدي بعد إزالة الجمجمة. ثم يتم ثقب الشريان بأقطاب التنغستن الدقيقة ، باستخدام تقنية مجسمة مجهرية14. في عام 1995 ، قام بيدرسون وفيلكين بتعديل نموذج Zea-Longa لنقص التروية الدماغية وأنشأا ثقب الأوعية الدموية الداخلية ، والذي تم تحسينه باستمرار منذ15,16. تعتمد هذه الطريقة على حقيقة أن الفئران والبشر يشتركون في شبكة وعائية مماثلة داخل الجمجمة ، والمعروفة باسم دائرة ويليس.

لتقييم ما بعد الجراحة وتصنيف SAH في نموذج الماوس ، تم اقتراح نهج مختلفة. طور سوغاوارا وآخرون مقياس تصنيف تم استخدامه على نطاق واسع منذ عام 200817. تقوم هذه الطريقة بتقييم شدة SAH بناء على التغيرات المورفولوجية. ومع ذلك ، بالنسبة لهذه الطريقة ، يجب فحص مورفولوجيا أنسجة دماغ الفأر تحت الرؤية المباشرة ، وبالتالي ، يجب التضحية بالفأر للتقييم. علاوة على ذلك ، تم إنشاء عدة طرق لتحديد شدة SAH في الجسم الحي. تتراوح الأساليب من التسجيل العصبي البسيط إلى مراقبة الضغط داخل الجمجمة (ICP) إلى تقنيات التصوير الإشعاعي المختلفة. علاوة على ذلك ، تم عرض تصنيف التصوير بالرنين المغناطيسي كأداة جديدة غير جراحية لتقدير شدة SAH ، المرتبطة بالنتيجة العصبية18,19.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لنموذج SAH الناجم عن ثقب الأوعية الدموية ، جنبا إلى جنب مع التصوير بالرنين المغناطيسي بعد العملية الجراحية. في محاولة لإنشاء نظام لتجسيد كمية النزيف في بيئة في الجسم الحي ، قمنا أيضا بتطوير نظام لتصنيف SAH وتحديد حجم الدم الكلي بناء على التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة T2 عالي الدقة 7.0 T. يضمن هذا النهج الحث الصحيح ل SAH واستبعاد الأمراض الأخرى مثل السكتة الدماغية أو استسقاء الرأس أو النزيف داخل المخ (ICH) والمضاعفات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo) ، برلين ، ألمانيا (G0063/18). في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران C57Bl / 6J الذكور (8-12 أسابيع) بوزن 25 ± 0.286 جم (متوسط ± s.e.m).

1. إعداد الحيوان

  1. الحث على التخدير عن طريق حقن الكيتامين (70 ملغم / كغ) والزيلازين (16 ملغ / كغ) داخل الصفاق. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية، مما يساهم في الحث السريع للتخدير العميق. اختبر التخدير الكافي باستخدام محفز الألم ، مثل قرصة إصبع القدم ، وتحقق من عدم وجود رد فعل.
  2. حلق شعر عنق الفأر بعناية باستخدام ماكينة حلاقة ، ونظفه بالإيثانول بنسبة 70٪ متبوعا بالبيتادين / الكلورهيكسيدين ، وتطبيق 1٪ ليدوكائين على سطح الجلد للسيطرة على الألم المحلي.
  3. ضع الماوس في وضع ضعيف. استخدم شريطا لاصقا لإصلاح الأطراف والذيل ، مع تمديد جلد الرقبة بلطف إلى الجانب الآخر من الجراحة. في وقت واحد ، ارفع الرقبة قليلا.
  4. استخدم مرهم العيون (على سبيل المثال ، 5٪ ديكسبانثينول) لمنع جفاف العينين أثناء العملية.

2. تحريض SAH

Figure 1
الشكل 1: صور خطوة بخطوة للتقنية الجراحية. (أ) تصوير تشريح الشريان السباتي الأيمن المكشوف: يتم تحديد CCA وتشعبه إلى ICA و ECA ، وكذلك الفروع الصغيرة من ECA (OA و STA). (ب) يتم تعبئة ECA من الأنسجة المحيطة وربطها بخيطين قبل قطعها. يجب وضع ربط ثالث بشكل فضفاض بالقرب من التشعب دون انسداده. (ج) يتم إغلاق ICA و CCA مؤقتا (إما بالربط أو المقاطع) لمنع النزيف المفرط عندما يتم شق ECA بعناية. (دال) تدرج الخيوط في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وتتدرج في التقييم القطري المشترك. يجب تشديد الربط المرتب مسبقا بعناية حتى لا يحدث أي انصباب دم ولكن يبقى تقدم الخيوط ممكنا. (هاء) يعاد فتح ال ICA و CCA ، ويجب تعديل جذع ECA إلى اتجاه الجمجمة. عن طريق دفع الخيط ~ 9 مم إلى الأمام في ICA ، سيتم الوصول إلى تشعب ACA-MCA ، ثم يتم ثقب السفينة عن طريق دفع الخيط ~ 3 مم إلى أبعد من ذلك. (و) يسحب الخيط بعد ضمان إعادة الربط الزمني للتقييم القطري المشترك. يتم إغلاق الربط المرتب مسبقا ل ECA بسرعة ، ويتم إعادة فتح CCA للسماح بإعادة التروية. الاختصارات: ACA = الشريان الدماغي الأمامي ، CCA = الشريان السباتي المشترك ، ECA = الشريان السباتي الخارجي ، MCA = الشريان الدماغي الأوسط ، ICA = الشريان السباتي الداخلي ، OA = الشريان القذالي ، PPA = الشريان الظفري ، STA = الشريان الدرقي العلوي. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. افتح جلد الرقبة بمشرط معقم ، من الذقن إلى الحافة العليا لعظم الصدر (1.5 سم) ، وافصل الغدد اللعابية بصراحة عن النسيج الضام المحيط بها.
  2. افصل مجموعة العضلات على طول جانب واحد [في هذه الحالة ، الجانب الأيمن] من القصبة الهوائية ، مما يعرض غمد الشريان السباتي الشائع (CCA) المغطى بالأوعية الدموية والأوردة المغذية. يقع CCA والعصب المبهمي على مقربة من بعضهما البعض.
  3. فصل CCA وترك 8-0 مجانا خياطة الحرير حول CCA دون ربطه مقدما. انتبه إلى حماية العصب المبهم ، لأنه يتلف بسهولة (الشكل 1A).
  4. يمكن رؤية تشعب ثلاثي ل CCA و ICA و ECA على طول الثلث الخلفي السفلي من الانبساط . تشريح الطرف البعيد من ECA و ligate السفينة مرتين بقدر الإمكان.
  5. افصل ECA عند نقطة منتصف الجزء المربوط مرتين ، مما أدى إلى إنشاء جذع سفينة.
  6. قم بترتيب ربط واحد مسبقا للخيوط حول جذع ECA ، ولا تغلقه حتى يتم إدخال خيوط ناجحة.
  7. استخدم خياطة أو مشبك صغير لحجب ICA و CCA مؤقتا (الشكل 1B).
  8. قم بعمل شق صغير (حوالي نصف قطر ECA) في ECA باستخدام مقص الأوعية الدموية الدقيقة. أدخل خيوط برولين 5-0 (بدلا من ذلك 4-0) في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وقدمها في التقييم القطري المشترك.
  9. أغلق الرباط على ECA قليلا أثناء تخفيف المشبك الصغير على ICA و CCA (الشكل 1C).
  10. اسحب الخيط برفق واضبط جذع ECA في اتجاه الجمجمة ، وقم بغزو الخيوط من خلال التشعب إلى ICA (الشكل 1D).
  11. وجه طرف الخيوط إنسيابيا بزاوية ~ 30 درجة إلى خط الوسط القصبي و ~ 30 درجة إلى المستوى الأفقي. ادفع الخيوط إلى الأمام داخل ICA. بعد الوصول إلى تشعب ACA-MCA ، تتم مواجهة المقاومة (~ 9 مم).
  12. قم بدفع الخيوط بمقدار 3 مم ، مما أدى إلى ثقب ACA الأيمن. اسحب الخيوط على الفور إلى جذع ECA ، مما يسمح بتدفق الدم إلى الفضاء تحت العنكبوتية.
  13. حافظ على الخيط في هذا الموضع لمدة 10 ثوان تقريبا (الشكل 1E). يمكن أن يكون وجود هزات العضلات ، والاختزال الجانبي ، واللهاث من أجل التنفس ، وتغير إيقاع القلب ، وسلس البول دليلا على نجاح الجراحة.
  14. أغلق CCA مؤقتا لتجنب فقدان الدم الزائد. اسحب الخيوط على الفور وقم بربط ECA بالخياطة المعدة مسبقا. إعادة فتح التقييم القطري المشترك والسماح بإعادة التروية والمزيد من انصباب الدم في الفضاء تحت العنكبوتية (الشكل 1F).
  15. بعد التحقق من تسرب النزيف ، قم بتطهير الجلد المحيط بالجرح لمنع الالتهابات الجلدية بعد العملية الجراحية ، وخياطة الجرح باستخدام خياطة ألياف البوليستر 4-0 غير القابلة للامتصاص.
  16. ضع الماوس في صندوق حراري حتى يتم استعادة الوعي. انتظر حتى يستيقظ الحيوان تماما وتأكد من أنه استعاد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء الصارم. لا تقم بإعادة الحيوانات إلى شركة الفئران الأخرى حتى تتعافى تماما.
  17. إدارة 200-300 مغ / كغ من الباراسيتامول من وزن الجسم لتخفيف الألم بعد العملية الجراحية.
  18. تحقق من الفئران يوميا بعد الجراحة.

3. قياس التصوير بالرنين المغناطيسي

  1. 24 ساعة بعد الجراحة ، قم بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام ماسح ضوئي للقوارض (جدول المواد) ومرنان مخصص لرأس الماوس - هنا ، تم استخدام مرنان حجم التربيعي 20 مم للإرسال / الاستقبال.
  2. ضع الماوس على بطانية مياه ساخنة متداولة لضمان درجة حرارة ثابتة للجسم تبلغ ~ 37 درجة مئوية. حث التخدير مع 2.5 ٪ من الايزوفلوران في خليط O2 / N2O (30 ٪ / 70 ٪) والحفاظ على 1.5-2 ٪ من الايزوفلوران عبر قناع الوجه تحت مراقبة التهوية المستمرة.
  3. قم أولا بإجراء مسح مرجعي سريع للحصول على 3 حزم شرائح متعامدة (Tri-Pilot-Multi ، FLASH مع وقت التكرار TR / echo time TE = 200 مللي ثانية / 3 مللي ثانية ، 1 متوسط ، زاوية الوجه FA = 30 درجة ، مجال الرؤية FOV = 28 مم × 28 مم ، مصفوفة MTX = 256 × 256 ، سمك الشريحة 1 مم ، إجمالي وقت الاكتساب TA = 30 ثانية).
  4. ثم استخدم تسلسل T2D turbo spin-echo عالي الدقة للتصوير (معلمات التصوير TR / TE = 5505 مللي ثانية / 36 مللي ثانية ، عامل RARE 8 ، 6 متوسطات ، 46 شريحة محورية متجاورة بسماكة شريحة 0.35 مم لتغطية الدماغ بأكمله ، FOV = 25.6 مم × 25.6 مم ، MTX = 256 × 256 ، TA = 13 دقيقة).
  5. إذا كانت النتيجة غير واضحة ، فاستخدم تسلسل صدى التدرج المرجح T2 * الذي يتم تشغيله بالتنفس بنفس المسافة مثل فحص T2W (فلاش 2D ، TR / TE = 600 مللي ثانية / 6.3 مللي ثانية ، FA = 30 درجة ، 1 متوسط ، 20 شريحة محورية بسماكة 0.35 مم ، FOV و MTX متطابقان مع T2w ، TA = 5-10 دقيقة اعتمادا على معدل التنفس).
  6. انقل البيانات إلى تنسيق صورة DICOM واستخدم برنامج ImageJ لتصنيف SAH وقياس حجم جلطات الدم. وترد تفاصيل القياس الكمي كدليل خطوة بخطوة في المواد التكميلية (الشكل التكميلي 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفيات
بالنسبة لهذه الدراسة ، خضع ما مجموعه 92 من ذكور الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا لعملية SAH. في هذه ، لاحظنا معدل وفيات إجمالي قدره 11.9 ٪ (n = 12). حدثت الوفيات حصريا خلال أول 6-24 ساعة بعد الجراحة ، مما يشير إلى الوفيات المحيطة بالجراحة وكذلك نزيف SAH نفسه كعوامل مساهمة على الأرجح.

SAH نزيف الصف
تلقى ما مجموعه 50 فأرا التصوير بالرنين المغناطيسي لمدة 24 ساعة بعد العملية الجراحية لتأكيد SAH وضمان الكشف عن الأمراض الأخرى المصاحبة ، بما في ذلك السكتة الدماغية الإقفارية تحت الحادة واستسقاء الرأس. تم استخدام الحيوانات المتبقية لإجراء فحوصات مبكرة لتحديد الوقت المناسب للتصوير بالرنين المغناطيسي بعد العملية الجراحية. من بين الفئران ال 50 التي تم فحصها في نقطة زمنية 24 ساعة ، n = 7 لم تقدم SAH (نزيف الصف 0) و n = 5 فئران تم فيها اكتشاف سكتة دماغية إضافية و / أو ICH (نزيف من الدرجة الرابعة). تم تحديد درجة نزيف SAH كميا بناء على فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T2 على النحو التالي (الشكل 2A ، B):

الصف 0: لم يتم تحديد SAH أو نزيف (14٪)
الصف الأول: سمك SAH ≤0.80 مم (24٪)
الصف الثاني: سمك SAH >0.8 و <1.6 مم (28٪)
الصف الثالث: سمك SAH ≥1.6 مم (24٪)
الصف الرابع: SAH مع إما ICH و / أو السكتة الدماغية (10 ٪).

Figure 2
الشكل 2: نظام تصنيف SAH مع حجم الدم المقابل وصور التصوير بالرنين المغناطيسي. (A) أقسام محورية للتصوير بالرنين المغناطيسي مرجحة T2 تصور صورا تمثيلية تصنف درجة SAH. الصف 0: لم يتم تحديد SAH أو نزيف (14٪) ؛ الصف الأول: سمك SAH ≤0.80 مم ؛ الصف الثاني: سمك SAH >0.8 و <1.6 مم ؛ الصف الثالث: سمك SAH ≥1.6 مم ؛ الصف الرابع: SAH مع إما ICH و / أو السكتة الدماغية. (ب) مخطط دائري يوضح توزيع درجة SAH في الفئران التجريبية. (ج، هاء) حجم نزيف SAH المحسوب على أساس الصيغة V = A 1 + A 2 + ... + Ax) · د ، حيث يتم تحديد منطقة النزيف عبر ImageJ في كل قسم من أقسام الشرائح ، ويتم ضرب مجموع جميع مناطق النزيف مع سمك شريحة التصوير بالرنين المغناطيسي المقابل. (د) إجمالي حجم النزيف لكل درجة SAH استنادا إلى تقدير حجم Kothari abc/2. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SEM. الاختصارات: ICH = نزيف داخل المخ ، التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي. شريط المقياس = 5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حجم النزيف
بالنسبة للصف الأول إلى الثالث ، تم تحديد حجم النزيف بطريقتين مختلفتين:

الطريقة ألف: تم حساب الحجم الكلي للنزيف استنادا إلى تقدير حجم abc/2 من قبل Kathari et al.، وهو تعديل لمعادلة الحجم الإهليلجي الذي استخدم على نطاق واسع في الإعداد السريري لتقدير حجم التراث الثقافي غير المادي (الشكل 2D)20.

الطريقة ب: تم تقدير حجم نزيف SAH المحسوب بناء على الصيغة V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) · د ، حيث تم تحديد منطقة النزيف عبر ImageJ في كل قسم من أقسام الشرائح وتم ضرب مجموع جميع مناطق النزيف مع سمك شريحة التصوير بالرنين المغناطيسي المقابل ("A i" يتوافق مع منطقة النزيف على الشريحة "i" ، "x" هو العدد الإجمالي للشرائح ، "d" يتوافق مع سمك الشريحة). أخذت هذه الطريقة في الاعتبار عدم انتظام الشكل (الشكل 2C ، E). من المتوقع أن تظهر الطريقة B نطاقا أكبر من القيم في كل مجموعة فرعية. ومع ذلك ، أظهرت كلتا الطريقتين اختلافا كبيرا في درجات النزيف المقابلة التي استندت إلى سمك SAH المحوري والموضحة في الفقرة التالية. ويبين الشكل التكميلي 2 حجم SAH لجميع المجموعات الفرعية؛ ومن المتوقع أن يكون الصف الرابع ذا طبيعة غير متجانسة لأنه يحتوي على التراث الثقافي غير المادي المشترك أيضا.

التحليل الإحصائي والأرقام
تم تحليل البيانات باستخدام GraphPad Prism للتحليلات الإحصائية. تم استخدام تحليلات ANOVA أحادية الاتجاه لمقارنة مجموعات متعددة. يتم عرض القيم كوسيلة ± الأخطاء القياسية وقيم p من p < 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. تم تكوين عناصر الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.com.

الشكل التكميلي 1: دليل خطوة بخطوة لقياس حجم النزيف باستخدام ImageJ. قم باستيراد الصور باستخدام ImageJ ، وأدخل "Strg + I" لإظهار بيانات الأبعاد. ثم اضبط المقياس للصورة. حدد جميع الصور التي يمكن رؤية SAH فيها. بالنسبة للطريقة A ، حدد الشريحة التي تحتوي على أكبر منطقة نزيف وقم بقياس الطول القحفي الذيلي (=a) بالإضافة إلى الطول المتوسط الجانبي (=b) للمحورين المتعامدين اللذين يمدان حجم SAH الإهليلجي. يمكن تقدير البعد البطني (=c) للشكل الإهليلجي بناء على سمك الشريحة وعدد الشرائح التي ينظر إليها SAH [c = سمك الشريحة × عدد الشرائح]. احسب الحجم استنادا إلى الصيغة:V= abc/2. بالنسبة للطريقة B ، قم بقياس مناطق النزيف على كل شريحة على حدة ثم احسب الحجم بناء على الصيغة: V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) · d ، والتي من خلالها d = سمك الشريحة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: أحجام النزيف لجميع المجموعات الفرعية. (أ) حجم النزيف (مم3) في كل مجموعة فرعية استنادا إلى الطريقة A باستخدام الصيغة V = abc/2. (ب) أحجام النزيف (مم3) من المجموعات الفرعية المقابلة باستخدام الطريقة B (الصيغة V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) · د؛ د = سمك الشريحة). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باختصار ، يتم تقديم نموذج فأر SAH موحد ناجم عن عملية ثقب خيوط الأوعية الدموية مع غزو طفيف ، ووقت تشغيل قصير ، ومعدلات وفيات مقبولة. يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على مدار 24 ساعة بعد العملية الجراحية لضمان موقع النزيف الصحيح واستبعاد الأمراض الأخرى ذات الصلة داخل الجمجمة. علاوة على ذلك ، قمنا بتصنيف درجات نزيف SAH المختلفة وقياس أحجام النزيف ، مما يسمح بإجراء مزيد من تحليلات المجموعات الفرعية بناء على درجة النزيف.

يؤثر تحديد المواقع المناسبة للماوس على نجاح الثقب الصحيح. يجب تمديد عنق الماوس قليلا إلى الجانب الآخر من العملية ، مع رفع الرأس قليلا. هذا يكشف عن التثليث ويجعل مسار الثقب أسهل في الوصول. إذا فشل تقدم الخيط ، فقد يكون من المفيد سحب الخيط قليلا إلى التثليث وضبط موضع الرأس حتى يصبح التقدم ممكنا دون أي مقاومة.

حماية الأعصاب أثناء العملية الجراحية أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تسبب اضطرابات العصب المبهمي والضفيرة العنقية تغيرات في إيقاعات الجهاز التنفسي والقلب ، وقد تموت بعض الفئران بسبب عدم انتظام ضربات القلب الخبيث. في حالة حدوث هذه الأعراض ، من الضروري إيقاف الإجراء مؤقتا لبضع دقائق حتى يستقر التنفس ومعدل ضربات القلب.

الحد من فقدان الدم أثناء العملية الجراحية أمر حيوي لتحسين بقاء الفئران. استنادا إلى خبرتنا ، من الأفضل تطبيق ربط الخيط المزدوج بالقرب من ECA. نقوم بفصل ECA في منتصف الربطتين لمنع تدفق الدم من جذع ECA البعيد. عندما يتم إدخال الخيوط في ECA ، يجب ربط الخيط المرتب مسبقا لمنع انصباب الدم من الشق. من الأهمية بمكان عدم ربط السفينة بإحكام شديد لأن هذا يعوق تقدم الخيوط بشكل صحيح.

يعد العمق المناسب لإدخال الخيوط أمرا ضروريا لنجاح تحريض SA. نظرا لعمر الفئران المستخدمة (8-12 أسبوعا) ، نقوم بإدخال الخيوط ~ 9 مم داخل ICA ونتوقف عند مواجهة المقاومة ، ثم نتقدم ~ 3 مم إضافية للثقب. يمكن أن يؤدي إدخال الخيوط غير العميقة بما فيه الكفاية إلى ثقب غير كاف ، مما لا يسبب SAH ، في حين أن الإدخال المفرط قد يؤدي إلى سكتة دماغية و / أو ICH (الشكل 3). في الوقت نفسه ، يجب الحفاظ على التشريح الأصلي للفئران وهياكل الأوعية الدموية قدر الإمكان أثناء العملية. على سبيل المثال ، يجب الاحتفاظ بالشريان القذالي (OA) أو الشريان الدرقي العلوي (STA) ، والأوعية الدموية المغذية على الغمد ، قدر الإمكان.

Figure 3
الشكل 3: تشريح دماغ الفأر والصور العيانية ل SAH. (أ) تشريح الأوعية الدموية التخطيطي للفأر الذي يوضح موقع ثقب الخيوط. (ب) الصورة العيانية الكلاسيكية للتحريض الناجح ل SAH. قبل إزالة الدماغ ، تم إجراء تروية 1x PBS. (ج) منظر عياني للفأر الذي دفعت فيه الخيوط عميقا جدا، مما تسبب في حدوث تفاعل كيميائي غير صحيح. الاختصارات: ACA = الشريان الدماغي الأمامي ، ECA = الشريان السباتي الخارجي ، CCA = الشريان السباتي الشائع ، ICA = الشريان السباتي الداخلي ، ICH = نزيف داخل المخ ، L = اليسار ، MCA = الشريان الدماغي الأوسط ، PPA = الشريان الظفري ، R = اليمين. شريط المقياس = 3 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نموذج ثقب الأوعية الدموية هو نموذج حيواني شائع الاستخدام لدراسة SAH ولكن الوسائل اللازمة لضمان درجة النزيف واستبعاد الأمراض الأخرى مثل السكتة الدماغية أو النزيف داخل المخ ليست موحدة بما فيه الكفاية في الأدبيات21. تماما مثل أي نموذج حيواني جراحي ، يعتمد معدل نجاح ومتانة تحريض SAH على خبرة الجراح.

حاليا ، يعد نموذج ثقب الأوعية الدموية أحد أكثر الطرق شيوعا لتحريض SAH التجريبي في الفئران. هذا النهج لا يتطلب بضع القحف ويشبه بدقة العمليات التي تحدث في البشر الذين يعانون من تمدد الأوعية الدموية SAH22. تشمل المزايا التقليد الوثيق للفيزيولوجيا المرضية بعد تمدد الأوعية الدموية SAH ، فيما يتعلق بردود الفعل الحادة والمتأخرة23. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن معدلات الوفيات في هذا النموذج مماثلة لتلك الموجودة في الدراسات السريرية في المرضى الذين يعانون من تمدد الأوعية الدموية SAH23. بالمقارنة مع نماذج حقن الدم ، يتم محاكاة التغيرات في نفاذية حاجز الدم في الدماغ بشكل أوثق ، ويتم تحقيق معدلات أعلى من التشنج الوعائي في ثقب الخيوط11,24. نماذج حقن الدم أكثر توغلا وبالتالي تشكل خطرا أكبر لتلف الأنسجة بالمقارنة مع نموذج ثقب الأوعية الدموية الداخلية الأقل توغلا. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الميزة الرئيسية لطرق حقن الدم هي حجم الدم الذي يمكن التحكم فيه بسهولة23. من المهم مراعاة توحيد سرعة الحقن لأن تعديلات برنامج المقارنات الدولية تعتمد اعتمادا كبيرا على سرعة الحقن23. بصرف النظر عن هذه النماذج الكلاسيكية ، فإن الجمع بين حقن الإيلاستاز للحث على تكوين تمدد الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم عن طريق استئصال الكلية من جانب واحد ، مما يؤدي في النهاية إلى تمزق تمدد الأوعية الدموية ، يشكل نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة النزيف تحت العنكبوتية في بيئة أكثر واقعية من الناحية الفسيولوجية المرضية25. وسيكون دمج هذه التقنيات مع الفئران المعدلة وراثيا موضع اهتمام للدراسات المستقبلية.

تعتمد أنظمة تصنيف SAH السابقة لنموذج ثقب الخيوط على كمية الدم تحت العنكبوتية المرئية في أجزاء مختلفة من الدماغ بعد التضحية بالفأر17. وبالتالي ، فإن أنظمة التصنيف هذه لا تسمح بإجراء دراسات طويلة الأجل عندما يكون الدم قد تم امتصاصه بالفعل في وقت التقديس. في الإعداد السريري ، يتم تصنيف SAH بناء على العرض السريري بالإضافة إلى سمك SAH في التصوير ، وهو ما يتوافق مع النتيجة السريرية1،26،27،28. وبالتالي ، في محاولة لتصنيف شدة النزيف بشكل غير جراحي ، أضفنا فحصا موحدا لمتابعة التصوير بالرنين المغناطيسي لتصنيف SAH بالأشعة ، والذي استند من خلاله التصنيف إلى مقاييس تصنيف بشرية موجودة مسبقا ، مع تكييف نظام الدرجات لنظام تصنيف التصوير بالرنين المغناطيسي المنشور سابقا في فئران SAH بواسطة Egashira et al.18. يضمن هذا النهج أيضا تحديد حجم الدم الكلي واستبعاد الحيوانات مع الأمراض الأخرى داخل الجمجمة (على سبيل المثال ، السكتة الدماغية ، ICH ، استسقاء الرأس). اقترحت بعض الدراسات الضغط داخل الجمجمة (ICP) ، والتروية الدماغية ، ومراقبة ضغط الدم كدليل على نجاح تحريض SAH ، والتي قد تكون أدوات مفيدة إضافية29. تشمل الطرق غير المباشرة لتقدير شدة SAH والضرر المحتمل للبطانة السفلية الجمع بين النتائج السريرية والتلطيخ النسيجي لعلامات موت الخلايا مثل p53 أو TUNEL أو caspase-3. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوات غير المباشرة مثل مراقبة برنامج المقارنات الدولية وكذلك العصبية قد لا تميز بدقة الأمراض الأخرى مثل السكتة الدماغية أو النزيف داخل الجمجمة أو استسقاء الرأس. على الرغم من مزايا تصنيف التصوير بالرنين المغناطيسي ، هناك عيب رئيسي واحد لهذا النهج فيما يتعلق بجدواه: التصوير بالرنين المغناطيسي ليس متاحا على نطاق واسع للمختبرات مثل الطرق الأخرى. هذا يحد من الإدخال الواسع لأنظمة تصنيف التصوير بالرنين المغناطيسي في SAH التجريبية. ومع ذلك، يضيف نظام تصنيف التصوير بالرنين المغناطيسي المقدم، عند توفره، أداة لتوحيد نماذج SAH التجريبية، وبالتالي تسهيل قابلية التكرار والمقارنة بين التجارب23. في هذه الدراسة ، على الرغم من التغيرات السريرية التي لوحظت أثناء العملية ، كان لا يزال هناك معدل 14٪ من الفئران دون دليل على SAH على التصوير بالرنين المغناطيسي بعد العملية الجراحية. ربما عانت الفئران في هذه المجموعة الفرعية من نزيف دقيق ، لا يمكن اكتشافه في التصوير بالرنين المغناطيسي (على غرار مرضى SAH الذين يعانون من التصوير المقطعي المحوسب السلبي ولكن وجود زانثوكروميا في البزل القطني). تم استبعاد هذه الفئران في هذا الإعداد التجريبي لمزيد من التحليلات. يمكن أن يكون السبب التقني لهذه "عدم النزيف" في التصوير بالرنين المغناطيسي هو عدم كفاية إدخال الخيوط ، مما يؤدي إلى عدم وجود ثقب (على سبيل المثال ، عن طريق وضعه بشكل غير صحيح في OA أو شريان الظفرة (PPA)). بالإضافة إلى ذلك ، قد تغلق السفينة المثقوبة بنجاح مرة أخرى بعد سحب الخيوط ، مما يمنع SAH.

باختصار ، يتم تقديم نموذج موحد لتمدد الأوعية الدموية التجريبي SAH عن طريق ثقب الأوعية الدموية الداخلية ، جنبا إلى جنب مع التصوير بالرنين المغناطيسي 24 ساعة بعد الجراحة لتأكيد وتصنيف النزيف واستبعاد الأمراض الأخرى ذات الصلة داخل الجمجمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

عدم وجود تضارب في المصالح

Acknowledgments

تم دعم SL من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني. تم دعم KT من خلال منحة BIH-MD من معهد برلين للصحة و Sonnenfeld-Stiftung. يتم دعم RX من قبل برنامج BIH-Charité Clinician Scientist Program ، بتمويل من Charité - Universitätsmedizin Berlin ومعهد برلين للصحة. نحن نقدر الدعم المقدم من مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) وصندوق النشر المفتوح الوصول التابع ل Charité - Universitätsmedizin Berlin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eye cream Bayer 815529836 Bepanthen
Images analysis software ImageJ Bundled with Java 1.8.0_172
Ligation suture (5-0) SMI Silk black USP
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Ketamine CP-pharma 797-037 100 mg/mL
MRI Bruker Pharmascan 70/16  7 Tesla
MRI images acquired software Bruker Bruker Paravision 5.1
Paracetamol (40 mg/mL) bene Arzneimittel 4993736
Prolene filament (5-0) Erhicon EH7255
Razor Wella HS61
Surgical instrument (Fine Scissors) FST 14060-09
Surgical instrument (forceps#1) AESCULAP FM001R
Surgical instrument (forceps#2) AESCULAP FD2855R
Surgical instrument (forceps#3) Hammacher HCS 082-12
Surgical instrument (Needle holder) FST 91201-13
Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) FST 15000-08
Surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Ventilation monitoring Stony Brook Small Animal Monitoring & Gating System
Wounding suture(4-0) Erhicon CB84D
Xylavet CP-pharma 797-062 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  3. Abraham, M. K., Chang, W. -T. W. Subarachnoid hemorrhage. Emergency Medicine Clinics of North America. 34 (4), 901-916 (2016).
  4. Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  5. Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
  6. Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
  7. de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
  8. Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
  9. Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  10. Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  11. Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
  12. Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
  13. Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
  14. Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
  15. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  16. Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
  17. Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
  18. Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
  19. Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
  20. Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
  21. Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
  23. Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
  24. Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
  25. Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
  26. Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
  27. Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
  28. Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
  29. Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 178 ،
نموذج ثقب الأوعية الدموية الداخلية للنزيف تحت العنكبوتية جنبا إلى جنب مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, S., Tielking, K., von Wedel,… More

Liu, S., Tielking, K., von Wedel, D., Nieminen-Kelhä, M., Mueller, S., Boehm-Sturm, P., Vajkoczy, P., Xu, R. Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging (MRI). J. Vis. Exp. (178), e63150, doi:10.3791/63150 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter