Summary
Hier presenteren we een gestandaardiseerd SAH-muismodel, geïnduceerd door endovasculaire filamentperforatie, gecombineerd met magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) 24 uur na de operatie om de juiste bloedingsplaats te garanderen en andere relevante intracraniale pathologieën uit te sluiten.
Abstract
Het endovasculaire filamentperforatiemodel om subarachnoïdale bloeding (SAH) na te bootsen is een veelgebruikt model - de techniek kan echter een hoog sterftecijfer veroorzaken, evenals een oncontroleerbaar volume van SAH en andere intracraniale complicaties zoals beroerte of intracraniële bloeding. In dit protocol wordt een gestandaardiseerd SAH-muismodel gepresenteerd, geïnduceerd door endovasculaire filamentperforatie, gecombineerd met magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) 24 uur na de operatie om de juiste bloedingsplaats te garanderen en andere relevante intracraniale pathologieën uit te sluiten. Kortom, C57BL/6J muizen worden verdoofd met een intraperitoneale ketamine/xylazine (70 mg/16 mg/kg lichaamsgewicht) injectie en in rugligging geplaatst. Na middellijn nekincisie worden de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en halsslagaderbifurcatie blootgesteld en wordt een 5-0 niet-absorbeerbare monofilament polypropyleen hechtdraad retrograde ingebracht in de externe halsslagader (ECA) en in de gemeenschappelijke halsslagader gebracht. Vervolgens wordt het filament in de interne halsslagader (ICA) geïnvagineerd en naar voren geduwd om de voorste hersenslagader (ACA) te perforeren. Na herstel van de operatie ondergaan muizen 24 uur later een 7,0 T MRI. Het bloedingsvolume kan worden gekwantificeerd en gesorteerd via postoperatieve MRI, waardoor een robuuste experimentele SAH-groep de mogelijkheid heeft om verdere subgroepanalyses uit te voeren op basis van de bloedhoeveelheid.
Introduction
Subarachnoïdale bloeding (SAH) wordt veroorzaakt door de breuk van een intracranieel aneurysma en vormt een levensbedreigende noodsituatie, geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit, goed voor ongeveer 5% van de beroertes 1,2. SAH-patiënten presenteren zich met ernstige hoofdpijn, neurologische disfunctie en progressieve bewustzijnsstoornissen3. Ongeveer 30% van de SAH-patiënten overlijdt binnen de eerste 30 dagen na de eerste bloeding4. Klinisch gezien ervaart 50% van de patiënten vertraagd hersenletsel (DBI) na vroeg hersenletsel. DBI wordt gekenmerkt door vertraagde cerebrale ischemie en vertraagde neurologische tekorten. Huidige studies hebben aangetoond dat de synergetische effecten van verschillende factoren leiden tot het verlies van neurologische functie, waaronder de vernietiging van de bloed-hersenbarrière, de samentrekking van kleine slagaders, microcirculatiedisfunctie en trombose 5,6.
Een uniek aspect van SAH is dat de pathogenese afkomstig is van een extraparenchymale locatie, maar vervolgens leidt tot schadelijke cascades in het parenchym: de pathologie begint met de accumulatie van bloed in de subarachnoïdale ruimte, waardoor een groot aantal intraparenchymale effecten wordt veroorzaakt, zoals neuro-inflammatie, neuronale en endotheelcelapoptose, corticale verspreidingsdepolarisatie en hersenoedeemvorming7, 8.
Klinisch onderzoek wordt beperkt door verschillende factoren, waardoor het diermodel een cruciaal element is in het consistent en nauwkeurig nabootsen van de pathomechanismeistische veranderingen van de ziekte. Er zijn verschillende SAH-modelprotocollen voorgesteld, bijvoorbeeld autologe bloedinjectie in de cisterna magna (ACM). Ook een aangepaste methode met een dubbele injectie van autoloog bloed in respectievelijk de cisterna magna en de optische chiasm cisterne (APC) 9,10. Hoewel autologe bloedinjectie een eenvoudige manier is om het pathologische proces van vasospasme en ontstekingsreacties na subarachnoïdale bloeding te simuleren, is de volgende stijging van de intracraniale druk (ICP) relatief langzaam en worden er geen opmerkelijke veranderingen in de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière geïnduceerd11,12. Een andere methode, de periarteriële bloedplaatsing, meestal gebruikt in grote SAH-modellen (bijv. Apen en honden), omvat het plaatsen van antistollingsautoloog bloed of vergelijkbare bloedproducten rond het vat. De diameterveranderingen van de slagader kunnen worden waargenomen met een microscoop, die dient als een indicator voor cerebrale vasospasme na SAH13.
Barry et al. beschreven voor het eerst een endovasculair perforatiemodel in 1979 waarbij de basilaire slagader wordt blootgelegd na het verwijderen van de schedel; de slagader wordt vervolgens doorboord met wolfraammicro-elektroden, met behulp van een microscopische stereotactische techniek14. In 1995 pasten Bederson en Veelken het Zea-Longa-model van cerebrale ischemie aan en stelden de endovasculaire perforatie vast, die sinds15,16 voortdurend is verbeterd. Deze methode is gebaseerd op het feit dat muizen en mensen een vergelijkbaar intracranieel vasculair netwerk delen, bekend als de cirkel van Willis.
Voor postoperatieve evaluatie en sortering van SAH in het muismodel zijn verschillende benaderingen voorgesteld. Sugawara et al. ontwikkelden een sorteerschaal die sinds 2008 veel wordt gebruikt17. Deze methode beoordeelt de ernst van SAH op basis van morfologische veranderingen. Voor deze methode moet de morfologie van het hersenweefsel van de muis echter onder direct zicht worden onderzocht en daarom moet de muis worden opgeofferd voor beoordeling. Bovendien zijn verschillende methoden vastgesteld voor het bepalen van de ernst van SAH in vivo. Benaderingen variëren van eenvoudige neurologische scoring tot monitoring van intracraniale druk (ICP) tot verschillende radiologische beeldvormingstechnieken. Bovendien is MRI-gradatie aangetoond als een nieuw, niet-invasief hulpmiddel om de ernst van SAH te beoordelen, correlerend met neurologische score18,19.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een SAH-model veroorzaakt door endovasculaire perforatie, gecombineerd met postoperatieve MRI. In een poging om een systeem op te zetten om de hoeveelheid bloedingen in een in vivo setting te objectiveren, ontwikkelden we ook een systeem voor SAH-sortering en kwantificering van het totale bloedvolume op basis van 7,0 T hoge resolutie T2-gewogen MRI. Deze aanpak zorgt voor de juiste inductie van SAH en uitsluiting van andere pathologieën zoals beroerte, hydrocefalie of intracerebrale bloeding (ICH) en complicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlijn, Duitsland (G0063/18). In deze studie werden C57Bl/6J mannelijke (8-12 weken oude) muizen met een gewicht van 25 ± 0,286 g (gemiddeld ± s.e.m.) gebruikt.
1. Bereiding van dieren
- Induceer anesthesie door ketamine (70 mg/kg) en xylazine (16 mg/kg) intraperitoneaal te injecteren. Handhaaf een normale lichaamstemperatuur, wat bijdraagt aan een snelle inductie van diepe anesthesie. Test op adequate sedatie met een pijnprikkel, zoals een teenknelpunt, en controleer de afwezigheid van een reactie.
- Scheer het nekhaar van de muis zorgvuldig met een scheermes, reinig het met 70% ethanol gevolgd door betadine / chloorhexidine en breng 1% lidocaïne aan op het huidoppervlak voor lokale pijnbestrijding.
- Plaats de muis in rugligging. Gebruik tape om de ledematen en staart te fixeren en de huid van de nek voorzichtig uit te rekken naar de andere kant van de operatie. Til tegelijkertijd de nek iets op.
- Gebruik oogheelkundige zalf (bijv. 5% dexpanthenol) om uitdroging van de ogen tijdens de operatie te voorkomen.
2. SAH inductie
Figuur 1: Stapsgewijze beelden van de chirurgische techniek. (A) Afbeelding van de blootgestelde anatomie van de rechter halsslagader: het CCA en zijn splitsing in ICA en ECA worden geïdentificeerd, evenals de kleine takken van de ECA (OA en STA). (B) De ERK wordt gemobiliseerd uit het omliggende weefsel en met twee hechtingen geligeerd voordat het wordt doorgesneden. Een derde ligatie moet losjes in de buurt van de bifurcatie worden geplaatst zonder deze af te sluiten. C) De ICA en het WVV worden tijdelijk afgesloten (met ligatie of clips) om overmatig bloeden te voorkomen wanneer de ERK zorgvuldig wordt ingesneden. D) De gloeidraad wordt in de ERK ingebracht en in het WVV gebracht. De vooraf afgesproken ligatie moet zorgvuldig worden aangespannen, zodat er geen bloeduitvloeiing optreedt, maar het mogelijk blijft om het filament vooruit te helpen. (E) De ICA en CCA worden heropend en de ECA-stronk moet in een schedelrichting worden aangepast. Door de gloeidraad ~ 9 mm naar voren in de ICA te duwen, wordt de ACA-MCA-bifurcatie bereikt en wordt het vat vervolgens geperforeerd door de gloeidraad ~ 3 mm verder te duwen. (F) De gloeidraad wordt teruggetrokken nadat een tijdelijke herligatie van het CCA is gewaarborgd. De vooraf afgesproken ligatie van de ERK wordt snel afgesloten en het WVV wordt heropend om reperfusie mogelijk te maken. Afkortingen: ACA = voorste hersenslagader, CCA = gemeenschappelijke halsslagader, ECA = externe halsslagader, MCA = middelste hersenslagader, ICA = interne halsslagader, OA = occipitale slagader, PPA = pterygopalatine slagader, STA = superieure schildklierslagader. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Open de nekhuid met een steriel scalpel, van de kin tot de bovenrand van het borstbeen (1,5 cm), en scheid speekselklieren botweg van hun omliggende bindweefsel.
- Scheid de spiergroep langs één kant [in dit geval de rechterkant] van de luchtpijp, waardoor de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) schede bedekt met voedende bloedvaten en venules wordt blootgesteld. Het CCA en de nervus vagus bevinden zich dicht bij elkaar.
- Dissociëer de CCA en laat een vrije 8-0 zijde hechtdraad rond de CCA zonder deze van tevoren te legen. Let op de bescherming van de nervus vagus, omdat deze gemakkelijk wordt beschadigd (figuur 1A).
- Een drievoudige bifurcatie van het CCA, de ICA en de ECA is zichtbaar langs het onderste achterste derde deel van de diastase. Ontleed het distale uiteinde van de ERK en laat het vat tweemaal zo ver mogelijk zakken.
- Koppel de ECA los op het middelpunt van het tweemaal geligeerde segment, waardoor een vatstomp ontstaat.
- Regel één ligatie voor het filament rond de ECA-stronk, sluit deze niet totdat het filament met succes is ingebracht.
- Gebruik een hechting of microclip om de ICA en CCA tijdelijk af te sluiten (figuur 1B).
- Maak een kleine incisie (ongeveer de helft van de ECA-diameter) in de ECA met behulp van een microvasculaire schaar. Plaats een 5-0 (alternatief 4-0) proleenfilament in de ECA en breng het in het CCA.
- Sluit de ligatuur op de ECA iets terwijl u de microclip op de ICA en CCA losmaakt (figuur 1C).
- Trek voorzichtig terug aan de gloeidraad en pas de ECA-stomp in de schedelrichting aan, waarbij het filament door de bifurcatie in de ICA wordt geïnvagineerd (figuur 1D).
- Richt de filamentpunt mediaal onder een hoek van ~30° ten opzichte van de tracheale middellijn en ~30° op het horizontale vlak. Duw de gloeidraad naar voren in de ICA. Na het bereiken van de ACA-MCA bifurcatie wordt weerstand aangetroffen (~9 mm).
- Verschuif het filament 3 mm verder en perforeer de juiste ACA. Trek het filament onmiddellijk terug naar de ECA-stomp, waardoor het bloed in de subarachnoïdale ruimte kan stromen.
- Houd het filament ongeveer 10 s in deze positie (figuur 1E). De aanwezigheid van spiertrillingen, ipsilaterale miose, naar adem happen, veranderd hartritme en urine-incontinentie kunnen ondersteunend bewijs zijn van een succesvolle operatie.
- Sluit de CCA tijdelijk om overmatig bloedverlies te voorkomen. Trek de gloeidraad er onmiddellijk uit en laat de ECA los met de vooraf afgesproken hechting. Heropen het CCA en laat reperfusie en verdere effusie van bloed in de subarachnoïdale ruimte toe (figuur 1F).
- Na controle op bloedingslekkage, desinfecteer de huid rond de wond om postoperatieve huidinfecties te voorkomen en hecht de wond met een niet-absorbeerbare 4-0 polyestervezel hechtdraad.
- Plaats de muis in een thermische doos totdat het bewustzijn is herwonnen. Wacht tot het dier volledig wakker is en zorg ervoor dat het voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden. Breng dieren niet terug naar het gezelschap van andere muizen totdat ze volledig hersteld zijn.
- Dien 200-300 mg/kg lichaamsgewicht paracetamol toe voor postoperatieve pijnverlichting.
- Controleer de muizen dagelijks na de operatie.
3. MRI-meting
- 24 uur na de operatie, MRI uitvoeren met behulp van een knaagdierscanner (Table of Materials) en een speciale muiskopresonator - hier werd een 20 mm zend / ontvang-volumeresonator gebruikt.
- Plaats de muis op een verwarmde circulerende waterdeken om een constante lichaamstemperatuur van ~37 °C te garanderen. Anesthesie induceren met 2,5% isofluraan in een O2/N2O-mengsel (30%/70%) en handhaven met 1,5-2% isofluraan via gezichtsmasker onder continue ventilatiebewaking.
- Voer eerst een snelle referentiescan uit met 3 orthogonale plakverpakkingen (Tri-Pilot-Multi, FLASH met herhalingstijd TR/echotijd TE = 200 ms/3 ms, 1 gemiddelde, fliphoek FA = 30°, gezichtsveld FOV = 28 mm x 28 mm, matrix MTX = 256 x 256, plakdikte 1 mm, totale acquisitietijd TA = 30 s).
- Gebruik vervolgens een hoge resolutie T2-gewogen 2D turbo spin-echo sequentie voor beeldvorming (beeldvormingsparameters TR / TE = 5505 ms / 36 ms, RARE factor 8, 6 gemiddelden, 46 aaneengesloten axiale plakjes met een plakdikte van 0,35 mm om de hele hersenen te bedekken, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 min).
- Als het resultaat onduidelijk is, gebruik dan een extra door ademhaling geactiveerde T2 *gewogen gradiëntechosequentie met dezelfde isodistantie als de T2w-scan (2D FLASH, TR / TE = 600 ms / 6,3 ms, FA = 30 °, 1 gemiddelde, 20 axiale plakjes met een dikte van 0,35 mm, FOV en MTX identiek aan T2w, TA = 5-10 minuten, afhankelijk van de ademhalingssnelheid).
- Breng de gegevens over naar het DICOM-beeldformaat en gebruik ImageJ-software voor SAH-sortering en volumetrie van bloedstolsels. Details over de kwantificering worden als een stapsgewijze handleiding vermeld in het aanvullende materiaal (aanvullende figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mortaliteit
Voor deze studie werden in totaal 92 mannelijke C57Bl/6J-muizen in de leeftijd van 8-12 weken onderworpen aan SAH-operatie; hierin zagen we een algemeen sterftecijfer van 11,9% (n = 12). Mortaliteit trad uitsluitend op binnen de eerste 6-24 uur na de operatie, wat suggereert dat perioperatieve mortaliteit en SAH-bloeding zelf de meest waarschijnlijke bijdragende factoren zijn.
SAH bloedingsgraad
In totaal ontvingen 50 muizen MRI 24 uur postoperatief om SAH te bevestigen en de detectie van andere co-voorkomende pathologieën te garanderen, waaronder subacute ischemische beroerte en hydrocefalie. De overige dieren werden gebruikt voor eerdere scans om de juiste tijd voor postoperatieve MRI te selecteren. Van de 50 onderzochte muizen op 24 uurs tijdstip, n = 7 dieren die geen SAH (bloedingsgraad 0) en n = 5 muizen vertoonden waarbij extra beroerte en/of ICH (bloedingsgrade IV) werd gedetecteerd. De SAH-bloedingsgrade werd als volgt gekwantificeerd op basis van T2-gewogen MRI-scans (figuur 2A,B):
graad 0: geen SAH of bloeding geïdentificeerd (14%)
graad I: SAH dikte ≤0,80 mm (24%)
graad II: SAH dikte >0,8 en <1,6 mm (28%)
graad III: SAH dikte ≥1,6 mm (24%)
graad IV: SAH met ICH en/of beroerte (10%).
Figuur 2: SAH-classificatiesysteem met overeenkomstig bloedvolume en MRI-beelden. (A) T2-gewogen MRI-axiale secties met representatieve afbeeldingen die de SAH-graad categoriseren. Graad 0: geen SAH of bloeding geïdentificeerd (14%); graad I: SAH dikte ≤0,80 mm; graad II: SAH-dikte >0,8 en <1,6 mm; graad III: SAH dikte ≥1,6 mm; graad IV: SAH met ICH en/of beroerte. (B) Cirkeldiagram met de verdeling van de SAH-graad in de experimentele muizen. (C,E) Berekend SAH-bloedingsvolume op basis van de formule V = A1 + A2 + ... + Ax) · d, waarbij het bloedingsgebied wordt bepaald via ImageJ op elke diasectie en de som van alle bloedingsgebieden wordt vermenigvuldigd met de overeenkomstige MRI-diadikte. (D) Totaal bloedingsvolume van elke SAH-graad op basis van de Kothari abc/2-volumeschatting. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Afkortingen: ICH = intracerebrale bloeding, MRI = magnetische resonantie beeldvorming. Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bloedend volume
Voor graad I-III werd het bloedingsvolume gekwantificeerd met twee verschillende methoden:
Methode A: Het totale bloedingsvolume werd berekend op basis van de abc/2-volumeschatting door Kathari et al., een wijziging van de vergelijking voor ellipsoïdevolume die op grote schaal is gebruikt in de klinische setting om het ICH-volume te schatten (figuur 2D)20.
Methode B: Het berekende SAH-bloedingsvolume werd geschat op basis van de formule V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, waarmee het bloedingsgebied werd bepaald via AfbeeldingJ op elke diasectie en de som van alle bloedingsgebieden werd vermenigvuldigd met de overeenkomstige MRI-diadikte ('Ai' komt overeen met het bloedingsgebied op plak 'i', 'x' is het totale aantal plakjes, 'd' komt overeen met de plakdikte). Bij deze methode is rekening gehouden met de onregelmatigheid van de vorm (figuur 2C,E). Naar verwachting toonde methode B een groter bereik van waarden in elke subgroep. Beide methoden toonden echter een significant verschil in de overeenkomstige bloedingsgraden die waren gebaseerd op de axiale SAH-dikte en worden in de volgende paragraaf beschreven. Aanvullende figuur 2 toont het SAH-volume van alle subgroepen; naar verwachting was graad IV van heterogene aard omdat het ook co-voorkomende ICH bevatte.
Statistische analyse en cijfers
Gegevens werden geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism voor statistische analyses. Eenrichtings-ANOVA-analyses werden gebruikt om meerdere groepen te vergelijken. De waarden worden weergegeven als middel ± standaardfouten en p-waarden van p < 0,05 als statistisch significant werden beschouwd. Elementen van figuur 1 en figuur 2 zijn samengesteld met behulp van BioRender.com.
Aanvullende figuur 1: Een stapsgewijze handleiding voor het kwantificeren van het bloedingsvolume met ImageJ. Importeer de afbeeldingen met ImageJ en voer "Strg+I" in om de dimensionale gegevens weer te geven. Stel vervolgens de schaal voor de afbeelding in. Identificeer alle afbeeldingen waarin SAH te zien is. Identificeer voor methode A de plak met het grootste bloedingsgebied en meet de craniocradale lengte (=a) en de middellaterale lengte (=b) van de twee orthogonale assen die het ellipsoïde SAH-volume overspannen. De ventrodorsale dimensie (=c) van de ellipsoïde vorm kan worden geschat op basis van de plakdikte en het aantal plakjes waarop SAH wordt gezien [c = plakdikte x aantal plakjes]. Bereken het volume op basis van de formule:V= abc/2. Meet voor methode B de bloedingsgebieden op elke plak afzonderlijk en bereken vervolgens het volume op basis van de formule: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, waarmee d= plakdikte. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Bloedingsvolumes van alle subgroepen. (A) Bloedingsvolume (mm3) in elke subgroep op basis van methode A met de formule V= abc/2. (B) Bloedingsvolumes (mm3) van de overeenkomstige subgroepen met behulp van methode B (formule V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d; d= plakdikte). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samenvattend wordt een gestandaardiseerd SAH-muismodel geïnduceerd door endovasculaire filamentperforatieoperatie gepresenteerd met een kleine invasie, korte operatietijd en acceptabele sterftecijfers. MRI wordt 24 uur postoperatief uitgevoerd om de juiste bloedingsplaats en de uitsluiting van andere relevante intracraniale pathologieën te garanderen. Bovendien hebben we verschillende SAH-bloedingsgraden geclassificeerd en bloedingsvolumes gemeten, waardoor verdere subgroepanalyses op basis van bloedingsgraden mogelijk zijn.
Een adequate positionering van de muis beïnvloedt het succes van de juiste perforatie. De nek van de muis moet iets naar de andere kant van de operatie worden uitgerekt, waarbij het hoofd iets verhoogd is. Dit legt de trifurcatie bloot en maakt het prikpad beter toegankelijk. Als het oprukken van het filament mislukt, kan het nuttig zijn om het filament iets terug te trekken naar de trifurcatie en de positie van de kop aan te passen totdat verder gaan mogelijk is zonder enige weerstand.
Intraoperatieve zenuwbescherming is van cruciaal belang. Verstoringen van de nervus vagus en cervicale plexus kunnen veranderingen in ademhalings- en hartritme veroorzaken en sommige muizen kunnen zelfs sterven als gevolg van kwaadaardige aritmieën. Als deze symptomen optreden, is het essentieel om de procedure een paar minuten te pauzeren totdat de ademhaling en hartslag stabiliseren.
Het verminderen van intraoperatief bloedverlies is van vitaal belang voor het verbeteren van de overleving van muizen. Op basis van onze ervaring kan dubbele hechtligatie het beste dicht bij de ECA worden toegepast. We ontkoppelen de ECA in het midden van de twee ligaties om bloedterugstroming uit de distale ECA-stomp te voorkomen. Wanneer het filament in de ERK wordt ingebracht, moet de vooraf afgesproken hechting worden geligeerd om bloeduitsijpeling uit de incisie te voorkomen. Het is van cruciaal belang om het vat niet te strak te trekken, omdat dit een goede filamentvoortgang belemmert.
De juiste diepte van het inbrengen van filamenten is essentieel voor een succesvolle SAH-inductie. Vanwege de leeftijd van de gebruikte muizen (8-12 weken), brengen we het filament ~ 9 mm in de ICA in en stoppen we wanneer weerstand werd aangetroffen, en vervolgens ~ 3 mm verder voor perforatie. Het inbrengen van de gloeidraad die niet diep genoeg is, kan resulteren in onvoldoende perforatie, waardoor er geen SAH ontstaat, terwijl overmatig inbrengen kan leiden tot een slag en/of ICH (figuur 3). Tegelijkertijd moeten de oorspronkelijke anatomie en vasculaire structuren van de muizen tijdens de operatie zo goed mogelijk worden bewaard. Zo moeten bijvoorbeeld de occipitale slagader (OA) of superieure schildklierslagader (STA) en voedende bloedvaten op de schede zoveel mogelijk worden behouden.
Figuur 3: Anatomie van muizenhersenen en macroscopische beelden van SAH. (A) Schematische vasculaire anatomie van muizen die de plaats van filamentperforatie weergeven. (B) Klassiek macroscopisch beeld van succesvolle inductie van SAH. Voordat de hersenen werden verwijderd, werd een perfusie van 1x PBS uitgevoerd. (C) Macroscopisch beeld van de muis waarin de gloeidraad te diep werd geduwd, waardoor ICH ontstond. Afkortingen: ACA = voorste hersenslagader, ECA = uitwendige halsslagader, CCA = gemeenschappelijke halsslagader, ICA = interne halsslagader, ICH = intracerebrale bloeding, L = links, MCA = middelste hersenslagader, PPA = pterygopalatine slagader, R = rechts. Schaalbalk = 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het endovasculaire perforatiemodel is een veelgebruikt diermodel om SAH te bestuderen, maar de middelen om de bloedingsgraad te garanderen en andere pathologieën zoals beroerte of intracerebrale bloeding uit te sluiten, zijn niet voldoende gestandaardiseerd in de literatuur21. Net als elk operatief diermodel zijn het slagingspercentage en de robuustheid van SAH-inductie afhankelijk van de ervaring van de chirurg.
Momenteel is het endovasculaire perforatiemodel een van de meest populaire methoden voor experimentele SAH-inductie bij muizen. Deze aanpak vereist geen craniotomie en lijkt nauwkeurig op de processen die plaatsvinden bij mensen die lijden aan aneurysmale SAH22. Voordelen zijn onder meer nauwe imitatie van de pathofysiologie na aneurysmale SAH, met betrekking tot acute en vertraagde reacties23. Bovendien is aangetoond dat de sterftecijfers in dit model vergelijkbaar zijn met die van klinische studies bij patiënten die lijden aan aneurysmale SAH23. In vergelijking met bloedinjectiemodellen worden veranderingen in de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière nauwer nagebootst en worden hogere percentages vasospasme bereikt bij filamentperforatie11,24. Bloedinjectiemodellen zijn invasiever en vormen daarom een groter risico op weefselbeschadiging in vergelijking met het minder invasieve endovasculaire perforatiemodel. Niettemin moet worden opgemerkt dat een groot voordeel van bloedinjectiemethoden het gemakkelijk te controleren bloedvolume23 is. De standaardisatie van de injectiesnelheid is belangrijk om te overwegen, omdat veranderingen van ICP sterk afhankelijk zijn van de snelheid van injectie23. Afgezien van deze klassieke modellen vormt de combinatie van elastase-injectie om aneurysmavorming en hypertensie te induceren door unilaterale nefrectomie, wat uiteindelijk leidt tot aneurysmaruptuur, een interessant model om subarachnoïdale bloeding te bestuderen in een meer pathofysiologisch realistische setting25. Het integreren van dergelijke technieken met genetisch gemodificeerde muizen zal van belang zijn voor toekomstige studies.
Eerdere SAH-sorteersystemen voor het filamentperforatiemodel zijn gebaseerd op de hoeveelheid zichtbaar subarachnoïdaal bloed in verschillende hersensegmenten nadat de muis is opgeofferd17. Bijgevolg laten deze beoordelingssystemen geen langetermijnstudies toe wanneer het bloed al is geresorbeerd op het moment van opoffering. In de klinische setting wordt SAH beoordeeld op basis van klinische presentatie en SAH-dikte op beeldvorming, overeenkomend met klinische uitkomst 1,26,27,28. Daarom hebben we, in een poging om de ernst van de bloeding niet-invasief te classificeren, een gestandaardiseerd MRI-vervolgonderzoek toegevoegd om SAH röntgenologisch te beoordelen, waarbij de beoordeling was gebaseerd op reeds bestaande menselijke sorteerschalen, waarbij het beoordelingssysteem van een eerder gepubliceerd MRI-beoordelingssysteem bij SAH-muizen door Egashira et al.18 werd aangepast. Deze aanpak zorgt ook voor kwantificering van het totale bloedvolume en uitsluiting van dieren met andere gelijktijdig voorkomende intracraniale pathologieën (bijv. Beroerte, ICH, hydrocefalie). Sommige studies stelden intracraniale druk (ICP), cerebrale perfusie en bloeddrukmonitoring voor als bewijs van succesvolle SAH-inductie, wat aanvullende nuttige hulpmiddelen kunnen zijn29. Indirecte manieren om de ernst van SAH en mogelijke intraparenchymale schade te beoordelen, omvatten het combineren van klinische bevindingen met histologische kleuring voor celdoodmarkers zoals p53, TUNEL of caspase-3. Deze indirecte hulpmiddelen zoals ICP-monitoring en neurologische kunnen echter geen onderscheid maken tussen andere pathologieën zoals beroerte, intracraniële bloeding of hydrocefalie. Ondanks de voordelen van MRI-classificatie, is er één groot nadeel van deze aanpak met betrekking tot de haalbaarheid ervan: MRI is niet zo algemeen beschikbaar voor laboratoria als andere methoden. Dit beperkt de brede introductie van MRI-beoordelingssystemen in experimentele SAH. Indien beschikbaar, voegt het gepresenteerde MRI-beoordelingssysteem echter een hulpmiddel toe om experimentele SAH-modellen te standaardiseren, waardoor de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van de experimentenworden vergemakkelijkt 23. In deze studie was er, ondanks waargenomen klinische veranderingen tijdens de operatie, nog steeds een percentage van 14% muizen zonder bewijs van SAH op postoperatieve MRI. Mogelijk leden muizen in deze subgroep aan microhemortrofieën, niet detecteerbaar op MRI (vergelijkbaar met SAH-patiënten met negatieve CT, maar de aanwezigheid van xanthochromie bij lumbale punctie). Deze muizen werden in deze experimentele opstelling uitgesloten voor verdere analyses. De technische reden voor deze "no-bleeds" op MRI kan onvoldoende filamentinbrenging zijn, wat resulteert in geen perforatie (bijvoorbeeld door onjuiste plaatsing in OA of pterygopalatine artery (PPA)). Bovendien kan het succesvol geperforeerde vat weer sluiten na het terugtrekken van de gloeidraad, waardoor SAH wordt voorkomen.
Samenvattend wordt een gestandaardiseerd model voor experimentele aneurysmale SAH door endovasculaire perforatie gepresenteerd, gecombineerd met MR-beeldvorming 24 uur na de operatie om de bloeding te bevestigen en te beoordelen en om andere relevante intracraniale pathologieën uit te sluiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling
Acknowledgments
SL werd ondersteund door de Chinese Scholarship Council. KT werd ondersteund door de BIH-MD-beurs van het Berlijnse Instituut voor Gezondheid en de Sonnenfeld-Stiftung. RX wordt ondersteund door het BIH-Charité Clinician Scientist Program, gefinancierd door de Charité-Universitätsmedizin Berlin en het Berlin Institute of Health. We erkennen de steun van de German Research Foundation (DFG) en het Open Access Publication Fund van Charité - Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
- Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
- Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
- Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
- de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
- Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
- Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
- Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
- Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
- Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
- Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
- Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
- Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
- Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
- Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
- Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
- Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
- Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
- Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
- Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).
