Summary
Qui presentiamo un modello murino SAH standardizzato, indotto dalla perforazione del filamento endovascolare, combinato con la risonanza magnetica (MRI) 24 ore dopo l'operazione per garantire il corretto sito di sanguinamento ed escludere altre patologie intracraniche rilevanti.
Abstract
Il modello di perforazione del filamento endovascolare per imitare l'emorragia subaracnoidea (SAH) è un modello comunemente usato - tuttavia, la tecnica può causare un alto tasso di mortalità e un volume incontrollabile di SAH e altre complicanze intracraniche come ictus o emorragia intracranica. In questo protocollo viene presentato un modello murino SAH standardizzato, indotto dalla perforazione del filamento endovascolare, combinato con la risonanza magnetica (MRI) 24 ore dopo l'operazione per garantire il corretto sito di sanguinamento ed escludere altre patologie intracraniche rilevanti. In breve, i topi C57BL/ 6J vengono anestetizzati con un'iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina (70 mg/16 mg/kg di peso corporeo) e posti in posizione supina. Dopo l'incisione del collo della linea mediana, l'arteria carotide comune (CCA) e la biforcazione carotidea sono esposte e una sutura di polipropilene monofilamento non assorbibile 5-0 viene inserita in modo retrogrado nell'arteria carotide esterna (ECA) e avanzata nell'arteria carotide comune. Quindi, il filamento viene invaginato nell'arteria carotide interna (ICA) e spinto in avanti per perforare l'arteria cerebrale anteriore (ACA). Dopo il recupero dall'intervento chirurgico, i topi subiscono una risonanza magnetica 7.0 T 24 ore dopo. Il volume di sanguinamento può essere quantificato e classificato tramite risonanza magnetica postoperatoria, consentendo un robusto gruppo sperimentale SAH con la possibilità di eseguire ulteriori analisi di sottogruppo in base alla quantità di sangue.
Introduction
L'emorragia subaracnoidea (SAH) è causata dalla rottura di un aneurisma intracranico e rappresenta un'emergenza pericolosa per la vita, associata a morbilità e mortalità sostanziali, pari a circa il 5% degli ictus 1,2. I pazienti con SAH presentano forti mal di testa, disfunzioni neurologiche e disturbi progressivi della coscienza3. Circa il 30% dei pazienti con SAH muore entro i primi 30 giorni dopo l'evento emorragico iniziale4. Clinicamente, il 50% dei pazienti sperimenta lesioni cerebrali ritardate (DBI) dopo lesioni cerebrali precoci. La DBI è caratterizzata da ischemia cerebrale ritardata e deficit neurologici ritardati. Studi attuali hanno dimostrato che gli effetti sinergici di diversi fattori portano alla perdita della funzione neurologica, tra cui la distruzione della barriera emato-encefalica, la contrazione delle piccole arterie, la disfunzione microcircolatoria e la trombosi 5,6.
Un aspetto unico della SAH è che la patogenesi ha origine da una posizione extraparenchimale ma poi porta a cascate dannose all'interno del parenchima: la patologia inizia con l'accumulo di sangue nello spazio subaracnoideo, innescando una moltitudine di effetti intraparenchimali, come neuroinfiammazione, apoptosi delle cellule neuronali ed endoteliali, depolarizzazione della diffusione corticale e formazione di edema cerebrale7, 8.
La ricerca clinica è limitata da diversi fattori, rendendo il modello animale un elemento critico nell'imitare in modo coerente e accurato i cambiamenti patomeccanici della malattia. Sono stati proposti diversi protocolli modello SAH, ad esempio l'iniezione di sangue autologo nella cisterna magna (ACM). Inoltre, un metodo modificato con una doppia iniezione di sangue autologo nella cisterna magna e nella cisterna del chiasma ottico (APC) rispettivamente 9,10. Mentre l'iniezione di sangue autologo è un modo semplice per simulare il processo patologico del vasospasmo e le reazioni infiammatorie dopo l'emorragia subaracnoidea, il seguente aumento della pressione intracranica (ICP) è relativamente lento e non vengono indotti cambiamenti degni di nota nella permeabilità della barriera emato-encefalica11,12. Un altro metodo, il posizionamento del sangue periarterioso, solitamente utilizzato in grandi modelli di SAH (ad esempio, scimmie e cani), prevede il posizionamento di sangue autologo anticoagulato o di prodotti sanguigni comparabili attorno alla nave. I cambiamenti di diametro dell'arteria possono essere osservati con un microscopio, che funge da indicatore per il vasospasmo cerebrale dopo SAH13.
Barry et al. descrissero per la prima volta un modello di perforazione endovascolare nel 1979 in cui l'arteria basilare è esposta dopo aver rimosso il cranio; l'arteria viene quindi perforata con microelettrodi di tungsteno, utilizzando una tecnica stereotassica microscopica14. Nel 1995, Bederson e Veelken hanno modificato il modello Zea-Longa di ischemia cerebrale e stabilito la perforazione endovascolare, che è stata continuamente migliorata dal15,16. Questo metodo si basa sul fatto che topi e umani condividono una rete vascolare intracranica simile, nota come il cerchio di Willis.
Per la valutazione postoperatoria e la classificazione della SAH nel modello murino, sono stati proposti diversi approcci. Sugawara et al. hanno sviluppato una scala di classificazione che è stata ampiamente utilizzata dal 200817. Questo metodo valuta la gravità della SAH in base ai cambiamenti morfologici. Tuttavia, per questo metodo, la morfologia del tessuto cerebrale del topo deve essere esaminata in visione diretta e, pertanto, il topo deve essere sacrificato per la valutazione. Inoltre, sono stati stabiliti diversi metodi per determinare la gravità della SAH in vivo. Gli approcci vanno dal semplice punteggio neurologico al monitoraggio della pressione intracranica (ICP) a varie tecniche di imaging radiologico. Inoltre, la classificazione MRI si è dimostrata un nuovo strumento non invasivo per valutare la gravità del SAH, correlata al punteggio neurologico18,19.
Qui, viene presentato un protocollo per un modello SAH causato dalla perforazione endovascolare, combinato con la risonanza magnetica postoperatoria. Nel tentativo di stabilire un sistema per oggettivare la quantità di sanguinamento in un ambiente in vivo , abbiamo anche sviluppato un sistema per la classificazione SAH e la quantificazione del volume totale del sangue basato su una risonanza magnetica ponderata T2 ad alta risoluzione 7.0 T. Questo approccio garantisce la corretta induzione della SAH e l'esclusione di altre patologie come ictus, idrocefalo o emorragia intracerebrale (ICH) e complicanze.
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Protocol
Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti stabiliti da Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlino, Germania (G0063/18). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J (8-12 settimane) con un peso di 25 ± 0,286 g (media ± s.e.m.).
1. Preparazione animale
- Indurre l'anestesia iniettando ketamina (70 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) per via intraperitoneale. Mantenere la temperatura corporea normale, contribuendo alla rapida induzione dell'anestesia profonda. Testare un'adeguata sedazione con uno stimolo al dolore, come un pizzico di punta, e verificare l'assenza di una reazione.
- Rasare con cura i peli del collo del topo con un rasoio, pulirlo con etanolo al 70% seguito da betadina / clorexidina e applicare l'1% di lidocaina sulla superficie della pelle per il controllo del dolore locale.
- Posizionare il mouse in posizione supina. Utilizzare il nastro adesivo per fissare gli arti e la coda, allungando delicatamente la pelle del collo sul lato opposto dell'intervento chirurgico. Allo stesso tempo, sollevare leggermente il collo.
- Utilizzare unguento oftalmico (ad esempio, 5% dexpantenolo) per prevenire la disidratazione degli occhi durante l'operazione.
2. Induzione SAH
Figura 1: Immagini passo-passo della tecnica chirurgica. (A) Rappresentazione dell'anatomia dell'arteria carotide destra esposta: il CCA e la sua biforcazione in ICA ed ECA sono identificati, così come i piccoli rami dell'ECA (OA e STA). (B) L'ECA viene mobilitata dal tessuto circostante e legata con due punti di sutura prima di tagliarlo. Una terza legatura deve essere posizionata liberamente vicino alla biforcazione senza occluderla. (C) L'ICA e il CCA sono temporaneamente occlusi (con legatura o clip) per evitare un sanguinamento eccessivo quando la Corte dei conti europea è accuratamente incisa. (D) Il filamento è inserito nella Corte dei conti europea e avanzato nel CCA. La legatura prestabilita deve essere serrata con cura in modo che non si verifichi alcun versamento di sangue, ma l'avanzamento del filamento rimane possibile. (E) L'ICA e il CCA sono riaperti e il moncone della Corte deve essere adattato in direzione cranica. Spingendo il filamento ~ 9 mm in avanti nell'ICA, verrà raggiunta la biforcazione ACA-MCA e il recipiente viene quindi perforato spingendo ulteriormente il filamento di circa 3 mm. (F) Il filamento viene ritirato dopo aver assicurato una rilegatura temporale del CCA. La legatura prestabilita dell'ECA viene rapidamente occlusa e il CCA viene riaperto per consentire la riperfusione. Abbreviazioni: ACA = arteria cerebrale anteriore, CCA = arteria carotide comune, ECA = arteria carotide esterna, MCA = arteria cerebrale media, ICA = arteria carotide interna, OA = arteria occipitale, PPA = arteria pterigopalatina, STA = arteria tiroidea superiore. Barra della scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Aprire la pelle del collo con un bisturi sterile, dal mento al bordo superiore dello sterno (1,5 cm), e separare senza mezzi termini le ghiandole salivari dal tessuto connettivo circostante.
- Separare il gruppo muscolare lungo un lato [in questo caso, il lato destro] della trachea, esponendo la guaina dell'arteria carotide comune (CCA) ricoperta di vasi sanguigni e venule nutrienti. Il CCA e il nervo vagale si trovano in prossimità l'uno dell'altro.
- Dissociare il CCA e lasciare un 8-0 libero sutura di seta attorno al CCA senza legarlo in anticipo. Prestare attenzione alla protezione del nervo vagale, in quanto è facilmente danneggiato (Figura 1A).
- Una tripla biforcazione del CCA, dell'ICA e dell'ECA è visibile lungo il terzo posteriore inferiore della diastasi. Sezionare l'estremità distale dell'ECA e ligatare la nave due volte più distanti possibile.
- Scollegare l'ECA nel punto medio del segmento due volte legato, creando un moncone del vaso.
- Predisporre una legatura per il filamento attorno al moncone ECA, non chiuderlo fino a quando l'inserimento del filamento non è riuscito.
- Utilizzare una sutura o una micro clip per occludere temporaneamente l'ICA e il CCA (Figura 1B).
- Effettuare una piccola incisione (circa la metà del diametro dell'ECA) nell'ECA utilizzando forbici microvascolari. Inserire un filamento di prolene 5-0 (in alternativa 4-0) nell'ECA e farlo avanzare nel CCA.
- Chiudere leggermente la legatura sull'ECA mentre si allenta la micro clip sull'ICA e sul CCA (Figura 1C).
- Tirare delicatamente indietro il filamento e regolare il moncone ECA nella direzione cranica, invaginando il filamento attraverso la biforcazione nell'ICA (Figura 1D).
- Puntare la punta del filamento medialmente con un angolo di ~30° rispetto alla linea mediana tracheale e di ~30° rispetto al piano orizzontale. Spingere il filamento in avanti all'interno dell'ICA. Dopo aver raggiunto la biforcazione ACA-MCA, si incontra resistenza (~ 9 mm).
- Avanzare ulteriormente il filamento di 3 mm, perforando l'ACA giusto. Prelevare tempestivamente il filamento al moncone ECA, consentendo il flusso di sangue nello spazio subaracnoideo.
- Mantenere il filamento in questa posizione per circa 10 s (Figura 1E). La presenza di tremori muscolari, miosi ipsilaterale, respiro affannoso, alterazione del ritmo cardiaco e incontinenza urinaria può essere la prova di successo di un intervento chirurgico.
- Chiudere temporaneamente il CCA per evitare una perdita di sangue in eccesso. Estrarre istantaneamente il filamento e legare l'ECA con la sutura prestabilita. Riaprire il CCA e consentire la riperfusione e l'ulteriore versamento di sangue nello spazio subaracnoideo (Figura 1F).
- Dopo aver controllato la presenza di perdite di sanguinamento, disinfettare la pelle che circonda la ferita per prevenire infezioni cutanee postoperatorie e suturare la ferita con una sutura in fibra di poliestere 4-0 non assorbibile.
- Metti il mouse in una scatola termica fino a quando la coscienza non viene riacquistata. Attendere che l'animale sia completamente sveglio e assicurarsi che abbia riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale. Non restituire gli animali alla compagnia di altri topi fino a quando non sono completamente recuperati.
- Somministrare 200-300 mg / kg di peso corporeo paracetamolo per alleviare il dolore postoperatorio.
- Controllare i topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico.
3. Misurazione mritch
- 24 ore dopo l'intervento chirurgico, eseguire la risonanza magnetica utilizzando uno scanner per roditori (Tabella dei materiali) e un risonatore dedicato alla testa del mouse: qui è stato utilizzato un risonatore di volume in quadratura di trasmissione / ricezione da 20 mm.
- Posizionare il mouse su una coperta d'acqua circolante riscaldata per garantire una temperatura corporea costante di ~ 37 ° C. Indurre l'anestesia con il 2,5% di isoflurano in una miscela di O2/N2O (30%/70%) e mantenere con l'1,5-2% di isoflurano tramite maschera facciale sotto monitoraggio continuo della ventilazione.
- Per prima cosa eseguire una scansione di riferimento veloce acquisendo 3 pacchetti di slice ortogonali (Tri-Pilot-Multi, FLASH con tempo di ripetizione TR/echo time TE = 200 ms/3 ms, 1 media, angolo di flip FA = 30°, campo visivo FOV = 28 mm x 28 mm, matrice MTX = 256 x 256, spessore fetta 1 mm, tempo totale di acquisizione TA =30 s).
- Quindi utilizzare una sequenza turbo spin-echo 2D pesata T2 ad alta risoluzione per l'imaging (parametri di imaging TR / TE = 5505 ms / 36 ms, fattore RARE 8, medie 6, 46 fette assiali contigue con uno spessore della fetta di 0,35 mm per coprire l'intero cervello, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 min).
- Se il risultato non è chiaro, utilizzare un'ulteriore sequenza di eco a gradiente T2* attivata dalla respirazione con la stessa isodistanza della scansione T2w (2D FLASH, TR/TE = 600 ms/6,3 ms, FA = 30°, 1 media, 20 fette assiali con spessore di 0,35 mm, FOV e MTX identici a T2w, TA = 5-10 min a seconda della frequenza respiratoria).
- Trasferire i dati nel formato immagine DICOM e utilizzare il software ImageJ per la classificazione SAH e la volumetria dei coaguli di sangue. I dettagli sulla quantificazione sono elencati come guida passo-passo nel materiale supplementare (Figura supplementare 1).
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Representative Results
Mortalità
Per questo studio, un totale di 92 topi maschi C57Bl / 6J di età compresa tra 8-12 settimane sono stati sottoposti a operazione SAH; in questi, abbiamo osservato un tasso di mortalità complessivo dell'11,9% (n = 12). La mortalità si è verificata esclusivamente entro le prime 6-24 ore dopo l'intervento chirurgico, suggerendo la mortalità perioperatoria e il sanguinamento SAH stesso come i fattori che contribuiscono più probabilmente.
Grado di sanguinamento SAH
Un totale di 50 topi ha ricevuto la risonanza magnetica 24 ore dopo l'intervento per confermare la SAH e garantire il rilevamento di altre patologie concomitanti, tra cui ictus ischemico subacuto e idrocefalo. Gli animali rimanenti sono stati utilizzati per scansioni precedenti per selezionare il tempo adeguato per la risonanza magnetica postoperatoria. Tra i 50 topi esaminati a 24 ore di tempo, n = 7 animali che non presentavano SAH (grado di sanguinamento 0) e n = 5 topi in cui è stato rilevato un ulteriore ictus e / o ICH (sanguinamento di grado IV). Il grado di sanguinamento SAH è stato quantificato in base alle scansioni MRI ponderate T2 come segue (Figura 2A, B):
grado 0: nessun SAH o emorragia identificata (14%)
grado I: spessore SAH ≤0,80 mm (24%)
grado II: spessore SAH >0,8 e <1,6 mm (28%)
grado III: spessore SAH ≥1,6 mm (24%)
grado IV: SAH con ICH e/o ictus (10%).
Figura 2: Sistema di classificazione SAH con corrispondente volume di sangue e immagini MRI. (A) Sezioni assiali MRI pesate T2 raffiguranti immagini rappresentative che classificano il grado SAH. Grado 0: nessun SAH o emorragia identificata (14%); grado I: spessore SAH ≤0,80 mm; grado II: spessore SAH >0,8 e <1,6 mm; grado III: spessore SAH ≥1,6 mm; grado IV: SAH con ICH e/o ictus. (B) Grafico a torta che mostra la distribuzione del grado SAH nei topi sperimentali. (C,E) Volume di sanguinamento SAH calcolato in base alla formula V = A1 + A2 + ... + Ax) · d, in base al quale l'area di sanguinamento viene determinata tramite ImageJ su ciascuna sezione del vetrino e la somma di tutte le aree di sanguinamento viene moltiplicata per lo spessore del vetrino MRI corrispondente. (D) Volume totale di sanguinamento di ciascun grado SAH basato sulla stima del volume di Kothari abc/2. I valori sono espressi come media ± SEM. Abbreviazioni: ICH = emorragia intracerebrale, MRI = risonanza magnetica. Barra della scala = 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Volume di sanguinamento
Per il grado I-III, il volume di sanguinamento è stato quantificato con due diversi metodi:
Metodo A: Il volume totale di sanguinamento è stato calcolato sulla base della stima del volume abc/2 di Kathari et al., una modifica dell'equazione per il volume ellissoide che è stata ampiamente utilizzata in ambito clinico per stimare il volume di ICH (Figura 2D)20.
Metodo B: Il volume di sanguinamento SAH calcolato è stato stimato in base alla formula V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, in base al quale l'area di sanguinamento è stata determinata tramite ImageJ su ciascuna sezione del vetrino e la somma di tutte le aree di sanguinamento è stata moltiplicata con lo spessore del vetrino MRI corrispondente ('Ai' corrisponde all'area di sanguinamento sulla fetta 'i', 'x' è il numero totale di fette, 'd' corrisponde allo spessore della fetta). Questo metodo ha tenuto conto dell'irregolarità della forma (figura 2C, E). Prevedibilmente, il metodo B ha mostrato un intervallo più ampio di valori in ciascun sottogruppo. Tuttavia, entrambi i metodi hanno mostrato una differenza significativa nei corrispondenti gradi di sanguinamento che si basavano sullo spessore assiale del SAH e sono descritti nel paragrafo seguente. La Figura 2 supplementare mostra il volume SAH di tutti i sottogruppi; prevedibilmente, il grado IV era di natura eterogenea poiché conteneva anche ICH concomitante.
Analisi statistiche e cifre
I dati sono stati analizzati utilizzando GraphPad Prism per analisi statistiche. Le analisi ANOVA unidirezionali sono state utilizzate per confrontare più gruppi. I valori vengono visualizzati come mezzi ± gli errori standard e i valori p di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Gli elementi della Figura 1 e della Figura 2 sono stati composti utilizzando BioRender.com.
Figura 1 supplementare: Una guida passo-passo per quantificare il volume di sanguinamento con ImageJ. Importa le immagini con ImageJ e inserisci "Strg+I" per mostrare i dati dimensionali. Quindi impostare la scala per l'immagine. Identifica tutte le immagini in cui SAH può essere visto. Per il metodo A, identificare la fetta con l'area di sanguinamento più grande e misurare la lunghezza craniocaudale (=a) e la lunghezza mediolaterale (=b) dei due assi ortogonali che coprono il volume SAH ellissoide. La dimensione ventrodorsale (=c) della forma ellissoide può essere stimata in base allo spessore della fetta e al numero di fette su cui si vede SAH [c = spessore della fetta x numero di fette]. Calcola il volume in base alla formula:V= abc/2. Per il metodo B, misurare separatamente le aree di sanguinamento su ciascuna fetta e quindi calcolare il volume in base alla formula: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, con cui d= spessore della fetta. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Volumi di sanguinamento di tutti i sottogruppi. (A) Volume di sanguinamento (mm3) in ciascun sottogruppo in base al metodo A utilizzando la formula V= abc/2. B) Volumi di spurgo (mm3) dei sottogruppi corrispondenti con metodo B (formula V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d; d= spessore della fetta). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
In sintesi, un modello murino SAH standardizzato indotto dall'operazione di perforazione del filamento endovascolare è presentato con invasione minore, breve tempo operativo e tassi di mortalità accettabili. La risonanza magnetica viene condotta 24 ore su 24 postoperatoria per garantire il corretto sito di sanguinamento e l'esclusione di altre patologie intracraniche rilevanti. Inoltre, abbiamo classificato diversi gradi di sanguinamento SAH e misurato i volumi di sanguinamento, consentendo ulteriori analisi di sottogruppi basate sul grado di sanguinamento.
Un adeguato posizionamento del mouse influisce sul successo della corretta perforazione. Il collo del topo deve essere allungato leggermente sul lato opposto dell'operazione, con la testa leggermente sollevata. Questo espone la triforcazione e rende più facilmente accessibile il percorso di foratura. Se l'avanzamento del filamento fallisce, può essere utile ritirare leggermente il filamento alla triforcazione e regolare la posizione della testa fino a quando l'avanzamento è possibile senza alcuna resistenza.
La protezione intraoperatoria dei nervi è fondamentale. I disturbi del nervo vagale e del plesso cervicale possono causare cambiamenti nei ritmi respiratori e cardiaci e alcuni topi possono persino morire a causa di aritmie maligne. Se si verificano questi sintomi, è essenziale sospendere la procedura per alcuni minuti fino a quando la respirazione e la frequenza cardiaca si stabilizzano.
Ridurre la perdita di sangue intraoperatoria è vitale per migliorare la sopravvivenza dei topi. Sulla base della nostra esperienza, la legatura a doppia sutura viene applicata al meglio vicino all'ECA. Scolleghiamo l'ECA nel mezzo delle due legature per impedire il riflusso di sangue dal moncone ECA distale. Quando il filamento viene inserito nell'ECA, la sutura predisposta deve essere legata per evitare il versamento di sangue dall'incisione. È fondamentale non legare troppo strettamente la nave in quanto ciò ostacola il corretto avanzamento del filamento.
La profondità appropriata di inserimento del filamento è essenziale per il successo dell'induzione SAH. A causa dell'età dei topi utilizzati (8-12 settimane), inseriamo il filamento ~ 9 mm all'interno dell'ICA e ci fermiamo quando si incontra resistenza, quindi avanziamo di ~ 3 mm ulteriormente per la perforazione. L'inserimento del filamento non abbastanza profondo potrebbe comportare una perforazione insufficiente, senza causare SAH, mentre un inserimento eccessivo potrebbe portare a ictus e/o ICH (Figura 3). Allo stesso tempo, l'anatomia originale dei topi e le strutture vascolari devono essere preservate nel miglior modo possibile durante l'operazione. Ad esempio, l'arteria occipitale (OA) o l'arteria tiroidea superiore (STA) e i vasi sanguigni nutrienti sulla guaina dovrebbero essere mantenuti il più possibile.
Figura 3: Anatomia del cervello del topo e immagini macroscopiche di SAH. (A) Anatomia vascolare schematica del topo che mostra il sito di perforazione del filamento. (B) Immagine macroscopica classica dell'induzione riuscita di SAH. Prima di rimuovere il cervello, è stata eseguita una perfusione di 1x PBS. (C) Vista macroscopica del mouse in cui il filamento è stato spinto troppo in profondità, causando ICH. Abbreviazioni: ACA = arteria cerebrale anteriore, ECA = arteria carotide esterna, CCA = arteria carotide comune, ICA = arteria carotide interna, ICH = emorragia intracerebrale, L = sinistra, MCA = arteria cerebrale media, PPA = arteria pterigopalatina, R = destra. Barra della scala = 3 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il modello di perforazione endovascolare è un modello animale comunemente usato per studiare la SAH, ma i mezzi per garantire il grado di sanguinamento ed escludere altre patologie come l'ictus o l'emorragia intracerebrale non sono sufficientemente standardizzati nella letteratura21. Proprio come qualsiasi modello animale operativo, il tasso di successo e la robustezza dell'induzione SAH dipendono dall'esperienza del chirurgo.
Attualmente, il modello di perforazione endovascolare è uno dei metodi più popolari di induzione sperimentale SAH nei topi. Questo approccio non richiede craniotomia e assomiglia accuratamente ai processi che si svolgono negli esseri umani affetti da Aneurisma SAH22. I vantaggi includono la stretta imitazione della fisiopatologia a seguito di SAH aneurismatica, per quanto riguarda le reazioni acute e ritardate23. Inoltre, i tassi di mortalità in questo modello hanno dimostrato di essere simili a quelli degli studi clinici in pazienti affetti da SAH23 aneurismatico. Rispetto ai modelli di iniezione di sangue, i cambiamenti nella permeabilità della barriera emato-encefalica sono più strettamente imitati e si ottengono tassi più elevati di vasospasmo nella perforazione del filamento11,24. I modelli di iniezione di sangue sono più invasivi e quindi rappresentano un rischio maggiore di danno tissutale rispetto al modello di perforazione endovascolare meno invasivo. Tuttavia, va notato che uno dei principali vantaggi dei metodi di iniezione del sangue è il volume del sangue facilmente controllabile23. La standardizzazione della velocità di iniezione è importante da considerare poiché le alterazioni dell'ICP dipendono fortemente dalla velocità di iniezione23. Oltre a questi modelli classici, la combinazione di iniezione di elastasi per indurre la formazione di aneurisma e ipertensione mediante nefrectomia unilaterale, che alla fine porta alla rottura dell'aneurisma, rappresenta un modello interessante per studiare l'emorragia subaracnoidea in un ambiente più fisiopatologicamente realistico25. L'integrazione di tali tecniche con topi geneticamente modificati sarà di interesse per studi futuri.
I precedenti sistemi di classificazione SAH per il modello di perforazione del filamento si basano sulla quantità di sangue subaracnoideo visibile in diversi segmenti cerebrali dopo che il topo è stato sacrificato17. Di conseguenza, questi sistemi di classificazione non consentono studi a lungo termine quando il sangue è già stato riassorbito al momento del sacrificio. In ambito clinico, la SAH viene classificata in base alla presentazione clinica e allo spessore del SAH sull'imaging, corrispondente all'esito clinico 1,26,27,28. Quindi, nel tentativo di classificare la gravità del sanguinamento in modo non invasivo, abbiamo aggiunto un esame di follow-up MRI standardizzato per valutare radiograficamente SAH, con il quale la classificazione si basava su scale di classificazione umane preesistenti, adattando il sistema di classificazione di un sistema di classificazione MRI precedentemente pubblicato in topi SAH da Egashira et al.18. Questo approccio garantisce anche la quantificazione del volume totale del sangue e l'esclusione degli animali con altre patologie intracraniche concomitanti (ad esempio, ictus, ICH, idrocefalo). Alcuni studi hanno proposto la pressione intracranica (ICP), la perfusione cerebrale e il monitoraggio della pressione sanguigna come prova del successo dell'induzione del SAH, che potrebbe essere un ulteriore strumento utile29. I modi indiretti per valutare la gravità della SAH e il potenziale danno intraparenchimale includono la combinazione di risultati clinici con la colorazione istologica per i marcatori di morte cellulare come p53, TUNEL o caspasi-3. Tuttavia, questi strumenti indiretti come il monitoraggio ICP e neurologico potrebbero non distinguere ordinatamente altre patologie come ictus, emorragia intracranica o idrocefalo. Nonostante i vantaggi della classificazione MRI, c'è un grosso svantaggio di questo approccio per quanto riguarda la sua fattibilità: la risonanza magnetica non è così ampiamente disponibile per i laboratori come altri metodi. Ciò limita l'ampia introduzione di sistemi di classificazione MRI nella SAH sperimentale. Quando disponibile, tuttavia, il sistema di classificazione MRI presentato aggiunge uno strumento per standardizzare i modelli sperimentali SAH, facilitando così la riproducibilità e la comparabilità degli esperimenti23. In questo studio, nonostante i cambiamenti clinici osservati durante l'operazione, c'era ancora un tasso del 14% di topi senza evidenza di SAH sulla risonanza magnetica postoperatoria. Probabilmente, i topi di questo sottogruppo soffrivano di microemorragie, non rilevabili alla risonanza magnetica (simile ai pazienti con SAH con TC negativa ma presenza di xantocromia nella puntura lombare). Questi topi sono stati esclusi in questa configurazione sperimentale per ulteriori analisi. La ragione tecnica di questi "no-bleed" alla risonanza magnetica potrebbe essere l'insufficiente inserimento del filamento, con conseguente assenza di perforazione (ad esempio, da un posizionamento errato nell'OA o nell'arteria pterigopalatina (PPA)). Inoltre, la nave perforata con successo potrebbe chiudersi di nuovo dopo il ritiro del filamento, impedendo SAH.
In sintesi, viene presentato un modello standardizzato per la SAH aneurismatica sperimentale mediante perforazione endovascolare, combinato con l'imaging MR 24 ore dopo l'intervento chirurgico per confermare e classificare il sanguinamento ed escludere altre patologie intracraniche rilevanti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi
Acknowledgments
SL è stato sostenuto dal Chinese Scholarship Council. KT è stato sostenuto dalla borsa di studio BIH-MD dell'Istituto di sanità di Berlino e dalla Sonnenfeld-Stiftung. RX è supportato dal BIH-Charité Clinician Scientist Program, finanziato dalla Charité -Universitätsmedizin Berlin e dal Berlin Institute of Health. Riconosciamo il sostegno della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) e del Fondo di pubblicazione ad accesso aperto di Charité - Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
- Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
- Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
- Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
- de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
- Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
- Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
- Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
- Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
- Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
- Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
- Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
- Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
- Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
- Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
- Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
- Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
- Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
- Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
- Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).
