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Neuroscience

くも膜下出血の血管内穿孔モデルと磁気共鳴画像法(MRI)の組み合わせ

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3, 2,3, 1, 1
1Department of Neurosurgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, and Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Department of Experimental Neurology and Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3NeuroCure Cluster of Excellence and Charité Core Facility 7T Experimental MRIs, Charité - Universitätsmedizin Berlin
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、血管内フィラメント穿孔によって誘導された標準化されたSAHマウスモデルを、手術後24時間で磁気共鳴画像法(MRI)と組み合わせて、正しい出血部位を確保し、他の関連する頭蓋内病変を排除する。

Abstract

くも膜下出血(SAH)を模倣するための血管内フィラメント穿孔モデルは一般的に使用されるモデルである - しかし、この技術は、高い死亡率だけでなく、制御不能な量のSAHおよび脳卒中または頭蓋内出血などの他の頭蓋内合併症を引き起こす可能性がある。このプロトコルでは、血管内フィラメント穿孔によって誘導された標準化されたSAHマウスモデルを提示し、手術後24時間で磁気共鳴画像法(MRI)と組み合わせて、正しい出血部位を確保し、他の関連する頭蓋内病変を排除する。簡単に言えば、C57BL/6Jマウスを腹腔内ケタミン/キシラジン(70mg/16mg/kg体重)注射で麻酔し、仰臥位に置いた。正中線頸部切開後、総頚動脈(CCA)および頸動脈分岐部が露出し、5-0非吸収性モノフィラメントポリプロピレン縫合糸が外頚動脈(ECA)に逆行的に挿入され、総頚動脈に進んだ。次いで、フィラメントを内頸動脈(ICA)に浸入し、前方に押し出して前大脳動脈(ACA)を穿孔する。手術からの回復後、マウスは24時間後に7.0T MRIを受ける。出血量は術後MRIを介して定量化および等級付けすることができ、血液量に基づいてさらなるサブグループ分析を実行するオプションを備えた堅牢な実験SAHグループを可能にします。

Introduction

くも膜下出血(SAH)は、頭蓋内動脈瘤の破裂によって引き起こされ、脳卒中の約5%を占める実質的な罹患率および死亡率に関連する生命を脅かす緊急事態をもたらす1,2。SAH患者は、重度の頭痛、神経機能障害、および進行性の意識障害を呈する3。SAH患者の約30%が、最初の出血事象4後最初の30日以内に死亡する。臨床的には、患者の50%が早期の脳損傷後に遅延脳損傷(DBI)を経験する。DBIは、遅延性脳虚血および遅延性神経学的欠損を特徴とする。現在の研究は、いくつかの異なる要因の相乗効果が、血液脳関門の破壊、小動脈の収縮、微小循環機能障害、および血栓症を含む神経学的機能の喪失につながることを示している5,6。

SAHの1つのユニークな側面は、病因が実質外の場所に由来するが、その後実質内の有害なカスケードにつながることである:病理はくも膜下腔における血液の蓄積から始まり、神経炎症、神経および内皮細胞アポトーシス、皮質拡散脱分極、および脳浮腫形成7などの多数の実質外効果を引き起こす、8.

臨床研究はいくつかの要因によって制限されており、動物モデルは、疾患のパトメカニスティックな変化を一貫して正確に模倣する上で重要な要素となっています。異なるSAHモデルプロトコルが提案されている、例えば、大槽への自家血液注入(ACM)。また、胸郭マグナおよび視神経キアズム槽(APC)にそれぞれ自家血液を二重注射する修正方法9、10である。自家血液注射は、くも膜下出血後の血管れん縮および炎症反応の病理学的過程をシミュレートする簡単な方法であるが、以下の頭蓋内圧(ICP)の上昇は比較的遅く、血液脳関門の透過性に顕著な変化は誘発されない11、12。別の方法である動脈周囲血液配置は、通常、大型SAHモデル(例えば、サルおよびイヌ)において使用され、抗凝固された自家血液または同等の血液製剤を血管の周囲に配置することを含む。動脈の直径変化は顕微鏡で観察することができ、SAH13後の脳血管れん縮の指標となる。

Barryらは、頭蓋骨を切除した後に脳底動脈が露出する血管内穿孔モデルを1979年に初めて記載した。次いで、動脈をタングステン微小電極で穿刺し、顕微鏡定位技術14を使用する。1995年、ベダーソンとVeelkenは脳虚血のZea-Longaモデルを修正し、血管内穿孔を確立し、15,16以来継続的に改善されています。この方法は、マウスとヒトがウィリスのサークルとして知られる同様の頭蓋内血管網を共有しているという事実に基づいている。

マウスモデルにおけるSAHの術後評価およびグレーディングのために、異なるアプローチが提案されている。菅原らは、2008年から広く用いられているグレーディングスケールを開発した17。この方法は、形態学的変化に基づいてSAHの重症度を評価する。しかし、この方法では、マウスの脳組織形態を直接視力で検査する必要があるため、マウスを評価のために犠牲にする必要があります。さらに、インビボでSAH重症度を決定するためのいくつかの方法が確立されている。アプローチは、単純な神経学的スコアリングから頭蓋内圧(ICP)のモニタリング、さまざまな放射線イメージング技術まで多岐にわたります。さらに、MRIグレーディングは、SAH重症度をグレード化する新しい非侵襲的ツールとして示されており、神経学的スコア18、19と相関している。

ここでは、血管内穿孔によって引き起こされるSAHモデルのためのプロトコールを、術後MRIと組み合わせる。また、 生体内 における出血量を客観化するシステムを確立するために、7.0T高分解能T2加重MRIを用いてSAHグレーディングと総血液量定量を行うシステムを開発しました。このアプローチは、SAHの正しい誘導と、脳卒中、水頭症、または脳内出血(ICH)および合併症などの他の病状の排除を保証する。

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Protocol

実験は、Landesamt fuer Gesundheit undheit und and Soziales (LaGeSo), Berlin, Germany(G0063/18)によって定められたガイドラインおよび規制に従って実施した。本研究では、体重25±0.286g(平均±s.e.m.)のC57Bl/6J雄(8~12週齢)マウスを用いた。

1. 動物の準備

  1. ケタミン(70mg/kg)およびキシラジン(16mg/kg)を腹腔内に注射して麻酔を誘導する。体温を正常に保ち、深部麻酔の迅速な誘導に貢献します。つま先のピンチなどの痛みの刺激で適切な鎮静をテストし、反応がないことを確認します。
  2. マウスの首の毛をカミソリで慎重に剃り、70%エタノールとそれに続くベタジン/クロルヘキシジンできれいにし、局所的な痛みを抑えるために皮膚表面に1%のリドカインを塗布する。
  3. マウスを仰臥位に置きます。テープを使用して手足と尾を固定し、首の皮膚を手術の反対側に優しく伸ばします。同時に、首をわずかに上げます。
  4. 眼科用軟膏(例えば、5%デクスパンテノール)を使用して、手術中の眼の脱水を防止する。

2. SAH誘導

Figure 1
図1: 外科的技術の段階的な画像 。 (A)露出した右頸動脈解剖学の描写:CCAおよびICAおよびECAへの分岐、ならびにECA(OAおよびSTA)の小さな枝が同定される。(B)ECAを周囲の組織から動員し、切断する前に2本の縫合糸で結紮する。第3の結紮は、それを閉塞することなく分岐部の近くに緩やかに配置する必要がある。(C)ICAおよびCCAは、ECAを慎重に切開したときに過度の出血を防ぐために、一時的に(ライゲーションまたはクリップのいずれかで)閉塞される。(D)フィラメントをECAに挿入し、CCAに前進させる。予め配置された結紮は、輸血が起こらないように慎重に締め付けなければならないが、フィラメントの前進は可能である。(E) ICAとCCAが再び開かれ、ECAの切り株を頭蓋方向に調整する必要がある。フィラメントを約9mm前方に押し込むと、ACA-MCA分岐部に到達し、フィラメントをさらに約3mm押し込んで容器に穴を開けます。(f)フィラメントは、CCAの経時的な再ライゲーションを確保した後に引き抜かれる。ECAの予め配置されたライゲーションは迅速に閉塞され、CCAは再灌流を可能にするために再び開かれる。略語:ACA=前大脳動脈、CCA=総頚動脈、ECA=外頸動脈、MCA=中大脳動脈、ICA=内頚動脈、OA=後頭動脈、PPA=翼状口蓋動脈、STA=上甲状腺動脈。スケール バー = 2 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 顎から胸骨の上端(1.5cm)まで、滅菌メスで首の皮膚を開き、周囲の結合組織から唾液腺を鈍く分離する。
  2. 気管の片側(この場合は右側)に沿って筋肉群を分離し、栄養のある血管と細静脈で覆われた総頸動脈(CCA)鞘を露出させる。CCAと迷走神経は互いに近接して位置している。
  3. CCAを解離させ、フリーのまま8-0事前に結紮せずにCCAの周りの絹縫合糸。迷走神経は損傷しやすいため、保護に注意してください(図1A)。
  4. CCA、ICA、およびECAの三重分岐は、拡張症の後3分の1の下方に沿って見える。ECAの遠位端を解剖し、血管をできるだけ遠位距離の2倍に結紮する。
  5. 2回ライゲーションされたセグメントの中間点でECAを切断し、血管切り株を作成する。
  6. ECA切り株の周囲にフィラメント用のライゲーションを1つ予め配置し、フィラメント挿入が成功するまで閉じないでください。
  7. 縫合糸またはマイクロクリップを使用して、ICAとCCAを一時的に閉塞します(図1B)。
  8. 微小血管はさみを用いてECAに小さな切開(ECA直径の約半分)を行う。5-0(または4-0)のプロレンフィラメントをECAに挿入し、CCAに進めます。
  9. ICAとCCAのマイクロクリップを緩めながら、ECAの合字を少し閉じます(図1C)。
  10. フィラメントを静かに引き戻し、ECA切り株を頭蓋方向に調整し、分岐部を通ってフィラメントをICAに侵入させます(図1D)。
  11. フィラメント先端を内側に、気管正中線に対して〜30°、水平面に対して〜30°の角度でポイントします。フィラメントをICA内で前方に押し込みます。ACA-MCA分岐部に到達した後、抵抗(〜9mm)に遭遇する。
  12. フィラメントをさらに3mm前進させ、右ACAを穿孔する。速やかにフィラメントをECA切り株に引き抜き、くも膜下腔への血流を可能にする。
  13. フィラメントをこの位置に約10秒間保持します(図1E)。筋肉の振戦、同側縮瞳、息を呑むこと、心臓のリズムの変化、尿失禁の存在は、手術の成功の証拠を裏付けることができます。
  14. 過剰な失血を避けるためにCCAを一時的に閉じます。フィラメントを即座に引き出し、あらかじめ配置された縫合糸でECAを結紮する。CCAを再度開き、くも膜下腔への血液の再灌流およびさらなる滲出を可能にする(図1F)。
  15. 出血漏れを確認した後、術後の皮膚感染を防ぐために創傷周囲の皮膚を消毒し、非吸収性の4-0ポリエステル繊維縫合糸で創傷を縫合する。
  16. 意識が回復するまで、マウスをサーマルボックスに入れます。動物が完全に目覚めるまで待って、胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したことを確認してください。完全に回復するまで動物を他のマウスの会社に戻さないでください。
  17. 術後の疼痛緩和のために200-300mg / kg体重パラセタモールを投与する。
  18. 手術後、毎日マウスをチェックしてください。

3. MRI測定

  1. 手術後24時間後、げっ歯類スキャナー(材料表)と専用のマウス頭部共振器を用いてMRIを行い、ここでは20mmの送受信直交体積共振器を使用した。
  2. マウスを加熱循環水毛布の上に置き、〜37°Cの一定の体温を確保します。 O2/N2O混合物(30%/70%)中の2.5%イソフルランで麻酔を誘導し、連続換気モニタリング下でフェイスマスクを介して1.5〜2%イソフルランで維持する。
  3. まず、高速リファレンススキャンを実行して、3つの直交スライスパッケージ(トライパイロットマルチ、繰り返し時間TR/エコー時間TE = 200ms/3ms、1平均、フリップ角FA = 30°、視野FOV = 28 mm x 28 mm、マトリックスMTX = 256 x 256、スライス厚さ1 mm、合計集録時間TA = 30 s)を集録します。
  4. 次に、イメージングに高解像度のT2加重2Dターボスピンエコーシーケンスを使用します(イメージングパラメータTR/TE = 5505 ms/36 ms、RERE係数8、6平均、脳全体を覆うスライス厚さ0.35 mmの46個の連続したアキシャルスライス、FOV = 25.6 mm x 25.6 mm、MTX = 256 x 256、TA = 13分)。
  5. 結果が不明瞭な場合は、T2wスキャンと同じ等距離で追加の呼吸トリガT2*加重勾配エコーシーケンスを使用します(2D FLASH、TR / TE = 600 ms/6.3 ms、FA = 30°、平均1、厚さ0.35 mmの20軸スライス、呼吸数に応じてT2w、TA = 5-10分と同じFOVおよびMTX)。
  6. データをDICOM画像形式に転送し、血栓のSAHグレーディングと体積測定にImageJソフトウェアを使用します。定量に関する詳細は、補足資料にステップバイステップガイドとして記載されています(補足図1)。

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Representative Results

死亡率
この研究のために、8〜12週齢の合計92匹の雄C57Bl/6JマウスをSAH手術に供した。これらにおいて、我々は11.9%(n = 12)の全体的な死亡率を観察した。死亡率は手術後最初の6〜24時間以内にのみ発生し、周術期死亡率およびSAH出血自体が最も可能性の高い寄与因子であることを示唆している。

SAH出血グレード
合計50匹のマウスが術後24時間でMRIを受け、SAHを確認し、亜急性虚血性脳卒中および水頭症を含む他の併発病変の検出を確実にした。残りの動物を、術後MRIのための適切な時間を選択するために、以前のスキャンに使用した。24時間時点の50匹の検査マウスのうち、SAH(出血グレード0)を示さなかったn=7匹および追加の脳卒中および/またはICH(出血グレードIV)が検出されたn=5匹のマウス。SAH出血グレードを、以下のようにT2加重MRIスキャンに基づいて定量化した(図2A、B)。

グレード0:SAHまたは出血が確認されていない(14%)
グレードI:SAH厚さ≤0.80ミリメートル(24%)
グレードII:SAHの厚さ>0.8および<1.6ミリメートル(28%)
グレードIII:SAH厚さ≥1.6ミリメートル(24%)
グレードIV:ICHおよび/または脳卒中のいずれかを有するSAH(10%)。

Figure 2
図2:対応する血液量およびMRI画像を有するSAHグレーディングシステム。 (A)SAHグレードを分類する代表的な画像を描いたT2強調MRI軸切片。グレード0:SAHまたは出血が同定されていない(14%);グレードI:SAH厚さ≤0.80ミリメートル。グレードII:SAH厚さ>0.8および<1.6ミリメートル。グレードIII:SAHの厚さ≥1.6ミリメートル。グレードIV:ICHおよび/または脳卒中のいずれかを有するSAH。(b)実験マウスにおけるSAHグレードの分布を示す円グラフ。(C,E)式V=A1+A2+...+Ax)に基づいてSAHブリード体積を計算した。dは、各スライド部上のImageJを介して出血領域が決定されることにより、全ての出血領域の合計に、対応するMRIスライド厚さを乗じたものである。(D)コタリabc/2体積推定に基づく各SAHグレードの総出血量。略語:ICH = 脳内出血、MRI = 磁気共鳴イメージング。±スケール バー = 5 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

出血量
グレードI〜IIIについて、出血量は2つの異なる方法によって定量された:

方法A:出血の総体積は、ICH体積を推定するために臨床現場で広く利用されている楕円体体積の式の変形であるKathariらによるabc/2体積推定に基づいて計算された(図2D)20。

方法B:計算されたSAHブリード容積を、式V=(A1+A2+...+Ax)・式に基づいて推定した。dは、各スライド部上のImageJを介して出血領域を決定し、すべての出血領域の合計に対応するMRIスライド厚さを乗じたものである(「Ai」はスライス上の出血領域「i」に対応し、「x」はスライスの総数であり、「d」はスライス厚さに対応する)。この方法では、形状の凹凸を考慮に入れました(図2C、E)。予想通り、方法Bは各サブグループでより大きな範囲の値を示しました。しかしながら、両方の方法は、軸方向SAH厚さに基づいていた対応するブリードグレードに有意な差を示し、以下の段落に記載されている。 補足図2は、すべてのサブグループのSAH体積を示す。予想通り、グレードIVは、共存するICHも含んでいるため、不均一な性質のものであった。

統計分析と数値
データは、統計分析のためにGraphPad Prismを用いて分析した。一元配置分散分析は、複数のグループを比較するために使用されました。値は標準誤差±平均として表示され、p<0.05のp値は統計的に有意であると考えられました。 図1および 図2の要素は、BioRender.com を用いて構成した。

補足図1:ImageJで出血量を定量化するためのステップバイステップガイド。 ImageJで画像をインポートし、「Strg + I」と入力して寸法データを表示します。次に、画像のスケールを設定します。SAH が見えるすべての画像を特定します。方法Aの場合、最大の出血領域を有するスライスを特定し、楕円体SAH体積にまたがる2つの直交軸の頭蓋尾長(=a)および髄側長(=b)を測定する。楕円体形状の腹側寸法(=c)は、スライスの厚さとSAHが見られるスライスの数[c = スライスの厚さ x スライスの数]に基づいて推定することができる。体積は、V= abc/2 の式に基づいて計算します。方法Bの場合、各スライスのにじみの領域を別々に測定し、V = (A 1 + A2 + ... + Ax ·d、d=スライスの厚さ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:すべてのサブグループの出血量。(A)式V= abc/2を用いた方法Aに基づく各サブグループにおける出血量(mm3)。(b)方法Bを用いた対応するサブグループの出血体積(mm3)(式V=(A1+A2+...+Ax)·d;d=スライスの厚さ)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

要約すると、血管内フィラメント穿孔操作によって誘導される標準化されたSAHマウスモデルは、軽度の浸潤、短い手術時間、および許容可能な死亡率で提示される。MRIは術後24時間で行われ、正しい出血部位および他の関連する頭蓋内病変の排除を確実にする。さらに、異なるSAH出血グレードを分類し、出血量を測定し、出血グレードに基づいてさらなるサブグループ分析を可能にした。

マウスの適切な位置決めは、正しいミシン目の成功に影響します。マウスの首は、頭をわずかに上げて、操作の反対側にわずかに伸ばす必要があります。これにより、三股が露出し、穿刺経路へのアクセスが容易になります。フィラメントの前進が失敗した場合は、フィラメントを三股にわずかに引き出し、抵抗なく前進できるようになるまでヘッドの位置を調整すると便利です。

術中の神経保護は非常に重要です。迷走神経および子宮頸神経叢の障害は、呼吸および心臓のリズムの変化を引き起こす可能性があり、一部のマウスは悪性不整脈のために死亡することさえある。これらの症状が発生した場合は、呼吸と心拍数が安定するまで数分間手順を一時停止することが不可欠です。

術中の失血を減らすことは、マウスの生存率を向上させるために不可欠です。私たちの経験に基づいて、二重縫合糸結紮はECAの近くで最もよく適用されます。遠位ECA切り株からの逆流を防ぐために、2つの結紮の中央にあるECAを切断します。フィラメントをECAに挿入するときは、切開部からの血液滲出を防ぐために、予め配置された縫合糸を結紮する必要があります。これは適切なフィラメントの進歩を妨げるため、容器をあまりにも強く結紮しないことが重要です。

適切な深さのフィラメント挿入は、SAH誘導を成功させるために不可欠です。使用したマウスの年齢(8〜12週間)により、ICA内に約9mmのフィラメントを挿入し、抵抗に遭遇したときに停止し、穿孔のためにさらに約3mm前進させた。フィラメントを十分に深く挿入しないと、ミシン目が不十分になり、SAHが発生せず、過度の挿入はストロークおよび/またはICHにつながる可能性があります(図3)。同時に、マウスの元の解剖学的および血管構造は、手術中に可能な限り保存される必要がある。例えば、後頭動脈(OA)または上甲状腺動脈(STA)、および鞘上の栄養血管は、可能な限り保持されるべきである。

Figure 3
図3:マウスの脳解剖学とSAHの巨視的画像。(a)フィラメント穿孔の部位を示すマウス血管解剖学の概略図。(B)SAHの誘導に成功した古典的な巨視的画像。脳を除去する前に、1x PBSの灌流を行った。(c)フィラメントがあまりにも深く押し込まれ、ICHを引き起こしたマウスの巨視図。略語:ACA=前大脳動脈、ECA=外頚動脈、CCA=総頚動脈、ICA=内頚動脈、ICH=脳内出血、L=左、MCA=中大脳動脈、PPA=翼状葉パラチン動脈、R=右。スケール バー = 3 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

血管内穿孔モデルは、SAHを研究するために一般的に使用される動物モデルであるが、出血グレードを確保し、脳卒中または脳内出血などの他の病状を除外する手段は、文献21において十分に標準化されていない。他の手術動物モデルと同様に、SAH誘導の成功率と堅牢性は外科医の経験に依存します。

現在、血管内穿孔モデルは、マウスにおける実験的SAH誘導の最も一般的な方法の1つである。このアプローチは開頭術を必要とせず、動脈瘤SAH22に罹患しているヒトで起こっているプロセスと正確に類似している。利点は、動脈瘤SAHに続く病態生理学の密接な模倣、急性および遅延反応に関する23を含む。さらに、このモデルにおける死亡率は、動脈瘤SAH23に罹患している患者における臨床研究の死亡率と類似していることが示されている。血液注射モデルと比較して、血液脳関門透過性の変化はより密接に模倣され、そしてフィラメント穿孔においてより高い血管れん縮率が達成される11、24。血液注入モデルはより侵襲的であり、したがって、より侵襲性の低い血管内穿孔モデルと比較して、組織損傷のリスクが高い。それにもかかわらず、血液注入方法の主な利点は、血液量23を制御しやすいことであることに留意されたい。ICPの変化は射出速度23の速度に大きく依存するため、射出速度の標準化を考慮することが重要である。これらの古典的なモデルとは別に、片側腎摘出術によって動脈瘤形成および高血圧を誘導するエラスターゼ注射の組み合わせは、最終的に動脈瘤破裂をもたらし、より病態生理学的に現実的な設定でくも膜下出血を研究するための興味深いモデルを提示する25。このような技術を遺伝子改変マウスと統合することは、将来の研究にとって興味深いものとなるでしょう。

フィラメント穿孔モデルのための以前のSAHグレーディングシステムは、マウスが屠殺された後の異なる脳セグメントにおける目に見えるくも膜下血液の量に基づいている17。したがって、これらのグレーディングシステムは、仙骨化時に血液がすでに再吸収されている場合、長期的な研究を許可しない。臨床現場では、SAHは、臨床的提示ならびに画像化上のSAH厚さに基づいて等級付けされ、臨床転帰1、26、27、28に対応する。したがって、出血の重症度を非侵襲的に分類する試みとして、我々は標準化されたMRIフォローアップ検査を追加してSAHをX線写真的に等級付けし、それによって格付けは既存のヒト等級付け尺度に基づいており、Egashira et al.18によってSAHマウスにおいて以前に発表されたMRIグレーディングシステムのグレーディングシステムを適応させた。このアプローチはまた、総血液量の定量化および他の併発する頭蓋内病状(例えば、脳卒中、ICH、水頭症)を有する動物の排除を保証する。いくつかの研究は、頭蓋内圧(ICP)、脳灌流、および血圧モニタリングをSAH誘導の成功の証拠として提案しており、これは追加の有用なツールであるかもしれない29。SAHの重症度および潜在的な実質内損傷を等級付けする間接的な方法には、p53、TUNELまたはカスパーゼ-3などの細胞死マーカーの組織学的染色と臨床所見を組み合わせることが含まれる。しかし、ICPモニタリングや神経学などのこれらの間接的なツールは、脳卒中、頭蓋内出血、水頭症などの他の病状をきちんと区別できない場合があります。MRIグレーディングの利点にもかかわらず、その実現可能性に関してこのアプローチの1つの大きな欠点があります:MRIは他の方法ほど広く実験室で利用可能ではありません。これは、実験SAHにおけるMRIグレーディングシステムの広範な導入を制限する。しかしながら、提示されたMRIグレーディングシステムは、利用可能な場合、実験SAHモデルを標準化するためのツールを追加し、したがって、実験23の再現性および比較可能性を容易にする。この研究では、手術中に観察された臨床的変化にもかかわらず、術後MRIでSAHの証拠のないマウスの割合は依然として14%であった。おそらく、このサブグループのマウスは、MRIでは検出できない微小出血に罹患した(CT陰性を有するSAH患者に類似しているが、腰椎穿刺におけるキサントクロミアの存在)。これらのマウスは、さらなる分析のためにこの実験セットアップにおいて除外された。MRI上のこれらの「出血不良」の技術的理由は、フィラメント挿入が不十分であり、穿孔を生じない(例えば、OAまたは翼状口蓋動脈(PPA)への誤った配置による)。さらに、正常に穿孔された容器は、フィラメントの引き抜き後に再び閉じ、SAHを妨げる可能性がある。

要約すると、血管内穿孔による実験的動脈瘤SAHの標準化されたモデルを提示し、出血を確認および等級付けし、他の関連する頭蓋内病理を除外するために、手術後24時間のMR画像化と組み合わせる。

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Disclosures

利益相反の禁止

Acknowledgments

SLは中国奨学金評議会の支援を受けました。KTはベルリン保健研究所のBIH-MD奨学金とゾンネンフェルト財団の支援を受けた。RXは、ベルリンのシャリテ大学とベルリン衛生研究所が資金提供するBIH-Charité Clinician Scientist Programの支援を受けています。我々は、ドイツ研究財団(DFG)及びシャリテのオープンアクセス出版基金(ベルリン大学)からの支援を認める。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eye cream Bayer 815529836 Bepanthen
Images analysis software ImageJ Bundled with Java 1.8.0_172
Ligation suture (5-0) SMI Silk black USP
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Ketamine CP-pharma 797-037 100 mg/mL
MRI Bruker Pharmascan 70/16  7 Tesla
MRI images acquired software Bruker Bruker Paravision 5.1
Paracetamol (40 mg/mL) bene Arzneimittel 4993736
Prolene filament (5-0) Erhicon EH7255
Razor Wella HS61
Surgical instrument (Fine Scissors) FST 14060-09
Surgical instrument (forceps#1) AESCULAP FM001R
Surgical instrument (forceps#2) AESCULAP FD2855R
Surgical instrument (forceps#3) Hammacher HCS 082-12
Surgical instrument (Needle holder) FST 91201-13
Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) FST 15000-08
Surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Ventilation monitoring Stony Brook Small Animal Monitoring & Gating System
Wounding suture(4-0) Erhicon CB84D
Xylavet CP-pharma 797-062 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  3. Abraham, M. K., Chang, W. -T. W. Subarachnoid hemorrhage. Emergency Medicine Clinics of North America. 34 (4), 901-916 (2016).
  4. Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  5. Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
  6. Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
  7. de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
  8. Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
  9. Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  10. Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  11. Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
  12. Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
  13. Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
  14. Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
  15. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  16. Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
  17. Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
  18. Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
  19. Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
  20. Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
  21. Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
  23. Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
  24. Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
  25. Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
  26. Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
  27. Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
  28. Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
  29. Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).

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神経科学 第178号
くも膜下出血の血管内穿孔モデルと磁気共鳴画像法(MRI)の組み合わせ
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Liu, S., Tielking, K., von Wedel,… More

Liu, S., Tielking, K., von Wedel, D., Nieminen-Kelhä, M., Mueller, S., Boehm-Sturm, P., Vajkoczy, P., Xu, R. Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging (MRI). J. Vis. Exp. (178), e63150, doi:10.3791/63150 (2021).

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