Summary
Burada, doğru kanama bölgesini sağlamak ve diğer ilgili intrakraniyal patolojileri dışlamak için operasyondan 24 saat sonra manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile kombine edilen endovasküler filament perforasyonu ile indüklenen standartlaştırılmış bir SAH fare modeli sunulmaktadır.
Abstract
Subaraknoid kanamayı (SAK) taklit etmek için endovasküler filament perforasyon modeli yaygın olarak kullanılan bir modeldir - ancak teknik, yüksek mortalite oranının yanı sıra kontrol edilemeyen bir SAH hacmine ve inme veya intrakraniyal kanama gibi diğer intrakraniyal komplikasyonlara neden olabilir. Bu protokolde, doğru kanama bölgesini sağlamak ve diğer ilgili intrakraniyal patolojileri dışlamak için ameliyattan 24 saat sonra manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile kombine edilmiş, endovasküler filament perforasyonu ile indüklenen standartlaştırılmış bir SAH fare modeli sunulmaktadır. Kısaca C57BL/6J fareler intraperitoneal ketamin/ksilazin (70 mg/16 mg/kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile uyuşturulur ve sırtüstü pozisyona yerleştirilir. Orta hat boyun insizyonundan sonra, ortak karotis arter (CCA) ve karotis bifurkasyonu açığa çıkar ve 5-0 emilemeyen monofilament polipropilen sütür, retrograd bir şekilde eksternal karotis artere (ECA) yerleştirilir ve ortak karotis artere ilerletilir. Daha sonra, filament internal karotis artere (ICA) invagine edilir ve anterior serebral arteri (ACA) delmek için ileri itilir. Ameliyattan iyileştikten sonra, fareler 24 saat sonra 7.0 T MRG'ye tabi tutulur. Kanama hacmi, postoperatif MRG ile ölçülebilir ve derecelendirilebilir, bu da kan miktarına göre daha fazla alt grup analizi yapma seçeneği ile sağlam bir deneysel SAH grubu sağlar.
Introduction
Subaraknoid kanama (SAK), intrakraniyal anevrizmanın rüptürü sonucu oluşur ve hayatı tehdit eden acil bir durum oluşturur ve inmelerin yaklaşık %5'ini oluşturan önemli morbidite ve mortalite ile ilişkilidir1,2. SAH hastaları şiddetli baş ağrısı, nörolojik disfonksiyon ve ilerleyici bilinç bozukluğu ile başvururlar3. SAH hastalarının yaklaşık% 30'u ilk kanama olayından sonraki ilk 30 gün içinde ölür4. Klinik olarak, hastaların% 50'si erken beyin hasarından sonra gecikmiş beyin hasarı (DBI) yaşamaktadır. DBI gecikmiş serebral iskemi ve gecikmiş nörolojik defisitler ile karakterizedir. Mevcut çalışmalar, birkaç farklı faktörün sinerjik etkilerinin, kan-beyin bariyerinin tahrip olması, küçük arterlerin kasılması, mikrodolaşım bozukluğu ve tromboz dahil olmak üzere nörolojik fonksiyon kaybına yol açtığını göstermiştir 5,6.
SAH'ın benzersiz bir yönü, patogenezin ekstraparankimal bir lokalizasyondan kaynaklanması, ancak daha sonra parankim içinde zararlı kaskadlara yol açmasıdır: patoloji, subaraknoid boşlukta kan birikmesi ile başlar ve nöroinflamasyon, nöronal ve endotel hücre apoptozisi, kortikal yayılan depolarizasyon ve beyin ödemi oluşumu7 gibi çok sayıda intraparankimal etkiyi tetikler, 8.
Klinik araştırmalar çeşitli faktörlerle sınırlıdır ve hayvan modelini hastalığın pathomechanistic değişikliklerini tutarlı ve doğru bir şekilde taklit etmede kritik bir unsur haline getirmektedir. Farklı SAH model protokolleri önerilmiştir, örneğin, sarnıç magna (ACM) içine otolog kan enjeksiyonu. Ayrıca, sırasıyla 9,10 sarnıç magna ve optik kiazm sarnıcına (APC) otolog kan enjeksiyonu ile modifiye bir yöntem. Otolog kan enjeksiyonu, subaraknoid kanama sonrası vazospazm ve inflamatuar reaksiyonların patolojik sürecini simüle etmenin basit bir yolu olsa da, aşağıdaki kafa içi basınç (ICP) artışı nispeten yavaştır ve kan-beyin bariyerinin geçirgenliğinde kayda değer bir değişiklik indüklenmemiştir11,12. Başka bir yöntem, genellikle büyük SAH modellerinde (örneğin, maymunlar ve köpekler) kullanılan periarteriyel kan yerleşimi, damarın etrafına antikoagüle otolog kan veya karşılaştırılabilir kan ürünleri yerleştirmeyi içerir. Arterin çap değişiklikleri, SAH13'ten sonra serebral vazospazm için bir gösterge görevi gören mikroskopla gözlemlenebilir.
Barry ve ark. ilk olarak 1979'da kafatasını çıkardıktan sonra baziler arterin açığa çıktığı bir endovasküler perforasyon modelini tanımladılar; arter daha sonra mikroskobik stereotaktik teknik14 kullanılarak tungsten mikroelektrotlarla delinir. 1995 yılında Bederson ve Veelken, Zea-Longa serebral iskemi modelini değiştirdi ve 15,16'dan beri sürekli olarak iyileştirilen endovasküler perforasyonu kurdu. Bu yöntem, farelerin ve insanların, Willis'in çemberi olarak bilinen benzer bir kafa içi vasküler ağı paylaştığı gerçeğine dayanmaktadır.
Fare modelinde SAH'ın postoperatif değerlendirilmesi ve derecelendirilmesi için farklı yaklaşımlar önerilmiştir. Sugawara ve ark. 2008'den beri yaygın olarak kullanılan bir derecelendirme ölçeği geliştirmiştir17. Bu yöntem, morfolojik değişikliklere dayanarak SAH'ın şiddetini değerlendirir. Ancak bu yöntem için farenin beyin dokusu morfolojisi doğrudan görme altında incelenmeli ve bu nedenle farenin değerlendirme için feda edilmesi gerekir. Ayrıca, in vivo SAH şiddetini belirlemek için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Yaklaşımlar basit nörolojik skorlamadan kafa içi basıncın (ICP) izlenmesine ve çeşitli radyolojik görüntüleme tekniklerine kadar uzanmaktadır. Ayrıca, MRG derecelendirmesi, nörolojik skor18,19 ile ilişkili olarak, SAH şiddetini derecelendirmek için yeni, invaziv olmayan bir araç olarak gösterilmiştir.
Burada, endovasküler perforasyonun neden olduğu bir SAH modeli için postoperatif MRG ile birlikte bir protokol sunulmaktadır. İn vivo bir ortamda kanama miktarını nesnelleştirmek için bir sistem kurmak amacıyla, 7.0 T yüksek çözünürlüklü T2 ağırlıklı MRG'ye dayanarak toplam kan hacminin SAH derecelendirilmesi ve nicelleştirilmesi için bir sistem geliştirdik. Bu yaklaşım, SAH'ın doğru indüklenmesini ve inme, hidrosefali veya intraserebral kanama (ICH) ve komplikasyonlar gibi diğer patolojilerin dışlanmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlin, Almanya (G0063/18) tarafından belirlenen kılavuz ilkelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, 25 ± 0.286 g (ortalama ± s.e.m.) ağırlığında C57Bl/6J erkek (8-12 haftalık) fareler kullanılmıştır.
1. Hayvan hazırlığı
- İntraperitoneal olarak ketamin (70 mg/kg) ve ksilazin (16 mg/kg) enjekte edilerek anesteziyi indükleyin. Normal vücut ısısını koruyun, derin anestezinin hızlı indüksiyonuna katkıda bulunun. Ayak parmağı sıkışması gibi bir ağrı uyaranı ile yeterli sedasyonu test edin ve bir reaksiyonun yokluğunu doğrulayın.
- Farenin boyun kıllarını bir tıraş bıçağı ile dikkatlice tıraş edin,% 70 etanol ve ardından betadin / klorheksidin ile temizleyin ve lokal ağrı kontrolü için cilt yüzeyine% 1 lidokain uygulayın.
- Fareyi sırtüstü konuma getirin. Uzuvları ve kuyruğu sabitlemek için bant kullanın, boynun derisini ameliyatın karşı tarafına hafifçe gerin. Aynı zamanda, boynu hafifçe yükseltin.
- Operasyon sırasında gözlerin dehidrasyonunu önlemek için oftalmik merhem (örneğin,% 5 dekspantenol) kullanın.
2. SAH indüksiyonu
Şekil 1: Cerrahi tekniğin adım adım görüntüleri. (A) Maruz kalan sağ karotis arter anatomisinin tasviri: CCA ve ICA ve ECA'ya çatallanmasının yanı sıra ECA'nın küçük dalları (OA ve STA) tanımlanmıştır. (B) ECA, çevre dokudan mobilize edilir ve kesilmeden önce iki dikişle bağlanır. Üçüncü bir ligasyonun, çatallanmanın yakınında, tıkanmadan gevşek bir şekilde yerleştirilmesi gerekir. (C) ICAA ve CCA, ECA dikkatli bir şekilde kesildiğinde aşırı kanamayı önlemek için geçici olarak (ligasyon veya klipslerle) tıkanır. (D) Filament ECA'ya yerleştirilir ve CCA'ya ilerletilir. Önceden düzenlenmiş ligasyon dikkatlice sıkılmalıdır, böylece kan efüzyonu meydana gelmez, ancak filamentin ilerlemesi mümkün kalır. (E) ICA ve CCA yeniden açılır ve ECA kütüğünün kafatası yönüne ayarlanması gerekir. Filamenti ~9 mm ileriye doğru ICA'ya iterek, ACA-MCA çatallanmasına ulaşılacak ve daha sonra filaman ~ 3mm daha itilerek kap delinecektir. (F) Filament, CCA'nın zamansal olarak yeniden bağlanmasını sağladıktan sonra geri çekilir. ECA'nın önceden düzenlenmiş ligasyonu hızla tıkanır ve CCA reperfüzyona izin vermek için yeniden açılır. Kısaltmalar: ACA = anterior serebral arter, CCA = ortak karotis arter, ECA = eksternal karotis arter, MCA = orta serebral arter, ICA = internal karotis arter, OA = oksipital arter, PPA = pterygopalatine arter, STA = superior tiroid arter. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Boyun derisini çeneden göğüs kemiğinin üst kenarına (1,5 cm) kadar steril bir neşterle açın ve tükürük bezlerini çevreleyen bağ dokusundan açıkça ayırın.
- Kas grubunu trakeanın bir tarafı boyunca ayırın [bu durumda, sağ taraf] ve besleyici kan damarları ve venüllerle kaplı ortak karotis arter (CCA) kılıfını açığa çıkarın. CCA ve vagal sinir birbirine yakın konumdadır.
- CCA'yı ayrıştırın ve 8-0'lık ücretsiz bir skor bırakın CCA'nın etrafına önceden bağlamadan ipek dikiş. Vagal sinirin korunmasına dikkat edin, çünkü kolayca hasar görür (Şekil 1A).
- CCA, ICA ve ECA'nın üçlü çatallanması, diastazın alt posterior üçte biri boyunca görülebilir. ECA'nın distal ucunu disseke edin ve kabı mümkün olduğunca iki kat daha distaal olarak bağlayın.
- ECA'yı iki kez bağlanmış segmentin orta noktasında ayırın ve bir gemi kütüğü oluşturun.
- ECA kütüğünün etrafındaki filament için bir ligasyonu önceden ayarlayın, başarılı filament yerleştirmeye kadar kapatmayın.
- ICA ve CCA'yı geçici olarak tıkamak için bir dikiş veya mikro klips kullanın (Şekil 1B).
- Mikrovasküler makas kullanarak ECA'da küçük bir kesi (ECA çapının yaklaşık yarısı) yapın. ECA'ya 5-0 (alternatif olarak 4-0) prolene filament yerleştirin ve CCA'ya ilerletin.
- ICA ve CCA üzerindeki mikro klipsi gevşetirken ECA üzerindeki bağı hafifçe kapatın (Şekil 1C).
- Filamenti yavaşça geri çekin ve ECA kütüğünü kraniyal yönde ayarlayın, filamenti çatallanma yoluyla ICA'ya invagine edin (Şekil 1D).
- Filament ucunu medial olarak trakeal orta çizgiye ~30° ve yatay düzleme ~30° açıyla doğrultun. Filamenti ICA içinde ileri doğru itin. ACA-MCA bifurkasyonuna ulaştıktan sonra dirençle (~9 mm) karşılaşılır.
- Filamenti 3 mm daha ileri götürerek sağ ACA'yı delin. Filamenti derhal ECA kütüğüne çekin ve subaraknoid boşluğa kan akışına izin verin.
- Filamenti yaklaşık 10 s boyunca bu konumda tutun (Şekil 1E). Kas titremeleri, ipsilateral miyoz, nefes nefese kalma, değişmiş kalp ritmi ve idrar kaçırma varlığı başarılı cerrahinin kanıtlarını destekleyebilir.
- Aşırı kan kaybını önlemek için CCA'yı geçici olarak kapatın. Filamenti anında dışarı çekin ve ECA'yı önceden düzenlenmiş dikişle bağlayın. CCA'yı yeniden açın ve kanın subaraknoid boşluğa reperfüzyonuna ve daha fazla efüzyonuna izin verin (Şekil 1F).
- Kanama sızıntısını kontrol ettikten sonra, ameliyat sonrası cilt enfeksiyonlarını önlemek için yarayı çevreleyen cildi dezenfekte edin ve emilemeyen 4-0 polyester elyaf dikiş ile yarayı dikin.
- Bilinç yeniden kazanılana kadar fareyi termal bir kutuya yerleştirin. Hayvan tamamen uyanık olana kadar bekleyin ve sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazandığından emin olun. Tamamen iyileşene kadar hayvanları diğer farelerin şirketine iade etmeyin.
- Postoperatif ağrı kesici için 200-300 mg / kg vücut ağırlığı parasetamol uygulayın.
- Ameliyattan sonra fareleri günlük olarak kontrol edin.
3. MRG ölçümü
- Ameliyattan 24 saat sonra, bir kemirgen tarayıcı (Malzeme Tablosu) ve özel bir fare kafası rezonatörü kullanarak MRG yapın - burada, 20 mm'lik bir gönderme / alma dörtgen hacim rezonatörü kullanıldı.
- ~37 °C'lik sabit bir vücut ısısı sağlamak için fareyi ısıtılmış bir dolaşımdaki su battaniyesinin üzerine yerleştirin. Bir O2/N2O karışımında (%30/%70) %2,5 izofluran ile anestezi indükleyin ve sürekli ventilasyon monitörizasyonu altında yüz maskesi aracılığıyla %1,5-2 izofluran ile devam ettirin.
- İlk önce 3 ortogonal dilim paketi elde ederek hızlı bir referans taraması yapın (Tri-Pilot-Multi, tekrarlama süresi TR/yankı süresi TE = 200 ms/3 ms, 1 ortalama, çevirme açısı FA = 30°, görüş alanı FOV = 28 mm x 28 mm, matris MTX = 256 x 256, dilim kalınlığı 1 mm, toplam edinme süresi TA = 30 s).
- Daha sonra görüntüleme için yüksek çözünürlüklü T2 ağırlıklı 2D turbo spin-echo dizisi kullanın (görüntüleme parametreleri TR/TE = 5505 ms/36 ms, RARE faktörü 8, 6 ortalama, tüm beyni kapsayacak şekilde 0,35 mm dilim kalınlığında 46 bitişik eksenel dilim, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 dakika).
- Sonuç belirsizse, T2w taraması ile aynı izomesafeye sahip ek bir solunum tetiklemeli T2* ağırlıklı gradyan yankı dizisi kullanın (2D FLASH, TR/TE = 600 ms/6,3 ms, FA = 30°, 1 ortalama, 0,35 mm kalınlığında 20 eksenel dilim, T2w ile aynı FOV ve MTX, solunum hızına bağlı olarak TA = 5-10 dakika).
- Verileri DICOM görüntü formatına aktarın ve SAH derecelendirmesi ve kan pıhtılarının hacimlendirilmesi için ImageJ yazılımını kullanın. Nicelemeyle ilgili ayrıntılar, ek materyalde adım adım kılavuz olarak listelenmiştir (Ek Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ölümlülük
Bu çalışmada 8-12 haftalık toplam 92 erkek C57Bl/6J faresi SAH operasyonuna tabi tutuldu; bunlarda ise genel mortalite oranı %11,9 (n=12) olarak gözlenmiştir. Mortalite sadece ameliyattan sonraki ilk 6-24 saat içinde meydana geldi ve perioperatif mortalitenin yanı sıra SAH kanamasının kendisini en olası katkıda bulunan faktörler olarak düşündürdü.
SAH kanama derecesi
Toplam 50 fare, SAH'yi doğrulamak ve subakut iskemik inme ve hidrosefali de dahil olmak üzere birlikte ortaya çıkan diğer patolojilerin saptanmasını sağlamak için ameliyat sonrası 24 saat MRG aldı. Kalan hayvanlar, postoperatif MRG için yeterli zamanı seçmek için daha önceki taramalarda kullanıldı. 24 saatlik zaman noktasında incelenen 50 fare arasında, n = SAH (kanama derecesi 0) göstermeyen 7 hayvan ve n = 5 farede ek inme ve / veya ICH (kanama derecesi IV) tespit edildi. SAH kanama derecesi, T2 ağırlıklı MRG taramalarına dayanarak aşağıdaki gibi ölçüldü (Şekil 2A, B):
Derece 0: SAH veya kanama tanımlanmadı (%14)
Sınıf I: SAH kalınlığı ≤0.80 mm (% 24)
Derece II: SAH kalınlığı >0.8 ve <1.6 mm (%28)
Derece III: SAH kalınlığı ≥1.6 mm (% 24)
Derece IV: ICH ve/veya inme ile SAH (%10).
Şekil 2: Karşılık gelen kan hacmi ve MRG görüntüleri ile SAH derecelendirme sistemi. (A) SAH derecesini kategorize eden temsili görüntüleri gösteren T2 ağırlıklı MRG eksenel kesitleri. Derece 0: SAH veya kanama tanımlanmadı (% 14); sınıf I: SAH kalınlığı ≤0.80 mm; sınıf II: SAH kalınlığı >0.8 ve <1.6 mm; derece III: SAH kalınlığı ≥1.6 mm; Derece IV: ICH ve / veya inme ile SAH. (B) Deneysel farelerde SAH derecesinin dağılımını gösteren pasta grafiği. (C,E) V formülüne göre hesaplanan SAH kanama hacmi = A 1 + A 2 + ... + Ax) · d, kanama alanının her slayt kesitinde ImageJ aracılığıyla belirlendiği ve tüm kanama alanlarının toplamının karşılık gelen MRI slayt kalınlığı ile çarpıldığı d. (D) Kothari abc/2 hacim tahminine dayanan her SAH derecesinin toplam kanama hacmi. Değerler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Kısaltmalar: ICH = intraserebral kanama, MRI = manyetik rezonans görüntüleme. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kanama hacmi
Derece I-III için kanama hacmi iki farklı yöntemle ölçüldü:
Yöntem A: Toplam kanama hacmi, ICH hacmini tahmin etmek için klinik ortamda yaygın olarak kullanılan elipsoid hacim denkleminin bir modifikasyonu olan Kathari ve ark. tarafından yapılan abc / 2 hacim tahminine dayanarak hesaplanmıştır (Şekil 2D)20.
Yöntem B: Hesaplanan SAH kanama hacmi, V = (A 1 + A2 + ... + Ax) formülüne dayanarak tahmin edildi · d, kanama alanının her slayt kesitinde ImageJ ile belirlendiği ve tüm kanama alanlarının toplamının karşılık gelen MRI slayt kalınlığı ile çarpıldığı d' ('A i', 'i' dilimindeki kanama alanına karşılık gelir, 'x' toplam dilim sayısıdır, 'd' dilim kalınlığına karşılık gelir). Bu yöntem, şeklin düzensizliğini dikkate almıştır (Şekil 2C,E). Beklendiği gibi, Yöntem B her alt grupta daha büyük bir değer aralığı gösterdi. Bununla birlikte, her iki yöntem de eksenel SAH kalınlığına dayanan ve aşağıdaki paragrafta açıklanan karşılık gelen kanama derecelerinde anlamlı bir fark göstermiştir. Ek Şekil 2, tüm alt grupların SAH hacmini göstermektedir; Beklendiği gibi, derece IV, birlikte oluşan ICH'yi de içerdiği için heterojen bir yapıya sahipti.
İstatistiksel analiz ve rakamlar
Veriler istatistiksel analizler için GraphPad Prizması kullanılarak analiz edilmiştir. Birden fazla grubu karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA analizleri kullanıldı. Değerler standart hataların ortalamaları ± olarak görüntülendi ve p < 0.05'in p değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Şekil 1 ve Şekil 2'nin elemanları BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.
Ek Şekil 1: ImageJ ile kanama hacmini ölçmek için adım adım kılavuz. ImageJ ile görüntüleri içe aktarın ve boyutsal verileri göstermek için "Strg+I" girin. Ardından görüntünün ölçeğini ayarlayın. SAH'ın görülebileceği tüm görüntüleri tanımlayın. A yöntemi için, en büyük kanama alanına sahip dilimi tanımlayın ve elipsoid SAH hacmini kapsayan iki ortogonal eksenin kraniyoaudal uzunluğunu (=a) ve mediolateral uzunluğunu (=b) ölçün. Elipsoid şeklin ventrodorsal boyutu (=c), dilim kalınlığına ve SAH'ın görüldüğü dilim sayısına göre tahmin edilebilir [c = dilim kalınlığı x dilim sayısı]. Hacmi şu formüle göre hesaplayın: V= abc/2. B yöntemi için, her dilimdeki kanama alanlarını ayrı ayrı ölçün ve ardından aşağıdaki formüle göre hacmi hesaplayın: V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) · d, hangi d= dilim kalınlığı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Tüm alt grupların kanama hacimleri. (A) V= abc/2 formülü kullanılarak A yöntemine dayanan her alt grupta kanama hacmi (mm3). (B) B yöntemi kullanılarak karşılık gelen alt grupların kanama hacimleri (mm3) (formül V = (A 1 + A2 + ... + Ax) · d; d= dilim kalınlığı). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özetle, endovasküler filament perforasyon operasyonunun neden olduğu standartlaştırılmış bir SAH fare modeli, minör invazyon, kısa ameliyat süresi ve kabul edilebilir mortalite oranları ile sunulmaktadır. MRG, doğru kanama bölgesini ve diğer ilgili intrakraniyal patolojilerin dışlanmasını sağlamak için postoperatif 24 saat yapılır. Ayrıca, farklı SAH kanama derecelerini sınıflandırdık ve kanama hacimlerini ölçtük, böylece kanama derecesine göre daha fazla alt grup analizine izin verdik.
Farenin yeterli konumlandırılması, doğru perforasyonun başarısını etkiler. Farenin boynu, başın hafifçe yükseltilmesiyle operasyonun karşı tarafına hafifçe gerilmelidir. Bu, trifurkasyonu açığa çıkarır ve delinme yoluna daha kolay erişilebilir hale getirir. Filamentin ilerlemesi başarısız olursa, filamenti hafifçe trifurkasyona çekmek ve herhangi bir direnç olmadan ilerlemek mümkün olana kadar başın pozisyonunu ayarlamak yararlı olabilir.
İntraoperatif sinir koruması kritiktir. Vagal sinir ve servikal pleksus bozuklukları solunum ve kalp ritimlerinde değişikliklere neden olabilir ve bazı fareler malign aritmiler nedeniyle bile ölebilir. Bu semptomlar ortaya çıkarsa, solunum ve kalp atış hızı stabilize olana kadar prosedürü birkaç dakika duraklatmak önemlidir.
İntraoperatif kan kaybını azaltmak, farelerin hayatta kalmasını iyileştirmek için hayati öneme sahiptir. Deneyimlerimize dayanarak, çift sütür ligasyonu en iyi ECA'ya yakın bir yerde uygulanır. Distal ECA kütüğünden kan geri akışını önlemek için ECA'yı iki ligasyonun ortasında ayırıyoruz. Filament ECA'ya yerleştirildiğinde, önceden düzenlenmiş sütür, insizyondan kan efüzyonunu önlemek için bağlanmalıdır. Gemiyi çok sıkı bir şekilde bağlamamak çok önemlidir, çünkü bu uygun filament ilerlemesini engeller.
Başarılı SAH indüksiyonu için uygun filament yerleştirme derinliği şarttır. Kullanılan farelerin yaşı nedeniyle (8-12 hafta), filamenti ~9 mm ICA içine yerleştirir ve dirençle karşılaşıldığında dururuz, daha sonra perforasyon için ~ 3 mm daha ilerleriz. Filamentin yeterince derin yerleştirilmemesi yetersiz perforasyona neden olabilir, bu da SAH'a neden olmazken, aşırı yerleştirme inme ve / veya ICH'ye neden olabilir (Şekil 3). Aynı zamanda, farelerin orijinal anatomisi ve vasküler yapılarının operasyon sırasında mümkün olduğunca korunması gerekir. Örneğin, oksipital arter (OA) veya superior tiroid arter (STA) ve kılıf üzerindeki besleyici kan damarları mümkün olduğunca tutulmalıdır.
Resim 3: Fare beyin anatomisi ve SAH'ın makroskopik görüntüleri. (A) Filament perforasyon bölgesini gösteren şematik fare vasküler anatomisi. (B) SAH'ın başarılı indüksiyonunun klasik makroskopik görüntüsü. Beyni çıkarmadan önce, 1x PBS'lik bir perfüzyon gerçekleştirildi. (C) Filamentin çok derine itildiği ve ICH'ye neden olduğu farenin makroskopik görünümü. Kısaltmalar: ACA = anterior serebral arter, ECA = eksternal karotis arter, CCA = ortak karotis arter, ICA = internal karotis arter, ICH = intraserebral kanama, L = sol, MCA = orta serebral arter, PPA = pterygopalatine arter, R = sağ. Ölçek çubuğu = 3 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Endovasküler perforasyon modeli, SAH'yi incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelidir, ancak kanama derecesini sağlama ve inme veya intraserebral kanama gibi diğer patolojileri dışlama araçları literatürde yeterince standartlaştırılmamıştır21. Herhangi bir operatif hayvan modelinde olduğu gibi, SAH indüksiyonunun başarı oranı ve sağlamlığı cerrahın deneyimine bağlıdır.
Şu anda, endovasküler perforasyon modeli, farelerde deneysel SAH indüksiyonunun en popüler yöntemlerinden biridir. Bu yaklaşım kraniyotomi gerektirmez ve anevrizmal SAH22'den muzdarip insanlarda meydana gelen süreçlere doğru bir şekilde benzer. Avantajları arasında anevrizmal SAK sonrası patofizyolojinin akut ve gecikmiş reaksiyonlarla yakından taklit edilmesiyer almaktadır 23. Ek olarak, bu modeldeki mortalite oranlarının, anevrizmal SAH23'ten muzdarip hastalarda yapılan klinik çalışmalara benzer olduğu gösterilmiştir. Kan enjeksiyon modellerine kıyasla, kan-beyin bariyeri geçirgenliğindeki değişiklikler daha yakından taklit edilir ve filament perforasyonunda daha yüksek vazospazm oranları elde edilir11,24. Kan enjeksiyon modelleri daha invazivdir ve bu nedenle daha az invaziv endovasküler perforasyon modeline kıyasla doku hasarı için daha büyük bir risk oluşturur. Bununla birlikte, kan enjeksiyon yöntemlerinin en büyük avantajının kolay kontrol edilen kan hacmi23 olduğu unutulmamalıdır. ICP'deki değişiklikler büyük ölçüde enjeksiyon23'ün hızına bağlı olduğundan, enjeksiyon hızının standardizasyonu dikkate alınması önemlidir. Bu klasik modellerin dışında, tek taraflı nefrektomi ile anevrizma oluşumunu ve hipertansiyonu indüklemek için elastaz enjeksiyonunun kombinasyonu ve sonuçta anevrizma rüptürüne yol açması, subaraknoid kanamayı daha patofizyolojik olarak gerçekçi bir ortamda incelemek için ilginç bir model ortaya koymaktadır25. Bu tür teknikleri genetiği değiştirilmiş farelerle entegre etmek, gelecekteki çalışmalar için ilgi çekici olacaktır.
Filament perforasyon modeli için önceki SAH derecelendirme sistemleri, fare17 kurban edildikten sonra farklı beyin segmentlerinde görünür subaraknoid kan miktarına dayanmaktadır. Sonuç olarak, bu derecelendirme sistemleri, kan kutsallaştırma sırasında zaten emildiğinde uzun vadeli çalışmalara izin vermez. Klinik ortamda, SAH klinik prezentasyona ve görüntülemedeki SAH kalınlığına göre derecelendirilir ve klinik sonuca karşılık gelir 1,26,27,28. Bu nedenle, kanama şiddetini noninvaziv olarak sınıflandırmak amacıyla, SAH radyografik olarak derecelendirmek için standartlaştırılmış bir MRG takip muayenesi ekledik, bu sayede derecelendirme, önceden var olan insan derecelendirme ölçeklerine dayanıyordu ve SAH farelerde daha önce yayınlanmış bir MRG derecelendirme sisteminin derecelendirme sistemini uyarladık Egashira ve ark.18. Bu yaklaşım aynı zamanda toplam kan hacminin ölçülmesini ve hayvanların diğer birlikte ortaya çıkan intrakraniyal patolojilerle (örneğin, inme, ICH, hidrosefali) dışlanmasını sağlar. Bazı çalışmalar, başarılı SAH indüksiyonunun kanıtı olarak kafa içi basınç (ICP), serebral perfüzyon ve kan basıncı izlemeyi önerdi, bu da ek yararlı araçlar olabilir29. SAH şiddetini ve potansiyel intraparankimal hasarı derecelendirmenin dolaylı yolları, klinik bulguların p53, TUNEL veya kaspaz-3 gibi hücre ölüm belirteçleri için histolojik boyama ile birleştirilmesini içerir. Bununla birlikte, ICP monitörizasyonu ve nörolojik gibi bu dolaylı araçlar, inme, intrakraniyal kanama veya hidrosefali gibi diğer patolojileri düzgün bir şekilde ayırt edemeyebilir. MRG derecelendirmesinin avantajlarına rağmen, bu yaklaşımın fizibilitesi ile ilgili önemli bir dezavantajı vardır: MRG, laboratuvarlar için diğer yöntemler kadar yaygın değildir. Bu, deneysel SAH'de MRG derecelendirme sistemlerinin geniş çapta tanıtılmasını sınırlar. Bununla birlikte, mevcut olduğunda, sunulan MRG derecelendirme sistemi, deneysel SAH modellerini standartlaştırmak için bir araç ekler, böylece deneylerin tekrarlanabilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini kolaylaştırır23. Bu çalışmada, operasyon sırasında gözlenen klinik değişikliklere rağmen, postoperatif MRG'de SAH kanıtı olmayan farelerin oranı hala %14 idi. Muhtemelen, bu alt gruptaki fareler, MRG'de tespit edilemeyen mikrohemorajilerden muzdaripti (negatif BT'li SAH hastalarına benzer, ancak lomber ponksiyonda ksantokromi varlığı). Bu fareler, daha ileri analizler için bu deney düzeneğinde hariç tutuldu. MRG'deki bu "kanamasız" ın teknik nedeni, yetersiz filament yerleştirilmesi olabilir, bu da perforasyona neden olmaz (örneğin, OA veya ptergopalatin artere (PPA) yanlış yerleştirme ile). Ek olarak, başarılı bir şekilde delinmiş kap, filamentin çekilmesinden sonra tekrar kapanabilir ve SAH'yi önleyebilir.
Özetle, endovasküler perforasyon ile deneysel anevrizmal SAH için standartlaştırılmış bir model, kanamayı doğrulamak ve derecelendirmek ve diğer ilgili intrakraniyal patolojileri dışlamak için ameliyattan 24 saat sonra MR görüntüleme ile birlikte sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması yok
Acknowledgments
SL, Çin Burs Konseyi tarafından desteklendi. KT, Berlin Sağlık Enstitüsü ve Sonnenfeld-Stiftung'un BIH-MD bursu ile desteklendi. RX, Charité -Universitätsmedizin Berlin ve Berlin Sağlık Enstitüsü tarafından finanse edilen BIH-Charité Klinisyen Bilim İnsanı Programı tarafından desteklenmektedir. Alman Araştırma Vakfı (DFG) ve Charité Açık Erişim Yayın Fonu - Universitätsmedizin Berlin'in desteğini kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
- Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
- Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
- Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
- de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
- Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
- Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
- Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
- Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
- Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
- Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
- Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
- Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
- Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
- Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
- Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
- Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
- Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
- Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
- Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).
