Summary
Här presenterar vi en standardiserad SAH-musmodell, inducerad av endovaskulär filamentperforering, i kombination med magnetisk resonansavbildning (MRI) 24 timmar efter operationen för att säkerställa rätt blödningsställe och utesluta andra relevanta intrakraniella patologier.
Abstract
Den endovaskulära filamentperforeringsmodellen för att efterlikna subaraknoidalblödning (SAH) är en vanlig modell - men tekniken kan orsaka en hög dödlighet samt en okontrollerbar volym SAH och andra intrakraniella komplikationer som stroke eller intrakraniell blödning. I detta protokoll presenteras en standardiserad SAH-musmodell, inducerad av endovaskulär filamentperforering, i kombination med magnetisk resonansavbildning (MRI) 24 timmar efter operationen för att säkerställa rätt blödningsställe och utesluta andra relevanta intrakraniella patologier. Kortfattat bedövas C57BL/6J-möss med en intraperitoneal ketamin/xylazin (70 mg/16 mg/kg kroppsvikt) injektion och placeras i ryggläge. Efter snitt i midline-halsen exponeras den gemensamma halspulsådern (CCA) och karotisförgrening, och en 5-0 icke-absorberbar monofilament polypropensutur sätts in på ett retrograd sätt i den yttre halspulsådern (ECA) och avanceras in i den gemensamma halspulsådern. Därefter invagineras filamentet i den inre halspulsådern (ICA) och skjuts framåt för att perforera den främre hjärnartären (ACA). Efter återhämtning från operationen genomgår möss en 7,0 T MR 24 h senare. Blödningsvolymen kan kvantifieras och graderas via postoperativ MR, vilket möjliggör en robust experimentell SAH-grupp med möjlighet att utföra ytterligare subgruppsanalyser baserade på blodmängd.
Introduction
Subaraknoidalblödning (SAH) orsakas av bristning av ett intrakraniellt aneurysm och utgör en livshotande nödsituation, förknippad med betydande sjuklighet och dödlighet, som står för cirka 5% av stroke 1,2. SAH-patienter med svår huvudvärk, neurologisk dysfunktion och progressiv medvetandestörning3. Omkring 30 % av SAH-patienterna dör inom de första 30 dagarna efter den förstablödningshändelsen 4. Kliniskt upplever 50% av patienterna försenad hjärnskada (DBI) efter tidig hjärnskada. DBI kännetecknas av fördröjd cerebral ischemi och fördröjda neurologiska underskott. Aktuella studier har visat att de synergistiska effekterna av flera olika faktorer leder till förlust av neurologisk funktion, inklusive förstörelse av blod-hjärnbarriären, sammandragning av små artärer, mikrocirkulationsdysfunktion och trombos 5,6.
En unik aspekt av SAH är att patogenesen härstammar från en extraparenkymal plats men sedan leder till skadliga kaskader inuti parenkymen: patologin börjar med ackumulering av blod i subaraknoidutrymmet, vilket utlöser en mängd intraparenkymala effekter, såsom neuroinflammation, neuronal och endotelcellapoptos, kortikal spridning av depolarisering och hjärnödembildning7, 8.
Klinisk forskning begränsas av flera faktorer, vilket gör djurmodellen till ett kritiskt element för att konsekvent och exakt efterlikna de patomekanistiska förändringarna av sjukdomen. Olika SAH-modellprotokoll har föreslagits, t.ex. autolog blodinjektion i cisterna magna (ACM). Dessutom en modifierad metod med en dubbel injektion av autologt blod i cisterna magna respektive optisk chiasmcistern (APC) 9,10. Medan autolog blodinjektion är ett enkelt sätt att simulera den patologiska processen med vasospasm och inflammatoriska reaktioner efter subaraknoidalblödning, är följande ökning av intrakraniellt tryck (ICP) relativt långsam, och inga anmärkningsvärda förändringar i permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären induceras 11,12. En annan metod, periarterial blodplacering, som vanligtvis används i stora SAH-modeller (t.ex. apor och hundar), innebär att man placerar antikoagulerat autologt blod eller jämförbara blodprodukter runt kärlet. Diameterförändringarna i artären kan observeras med ett mikroskop, som fungerar som en indikator för cerebral vasospasm efter SAH13.
beskrev först en endovaskulär perforeringsmodell 1979 där basilarartären exponeras efter att skallen har tagits bort; artären punkteras sedan med volframmikroelektroder med användning av en mikroskopisk stereotaktisk teknik14. 1995 modifierade Bederson och Veelken Zea-Longa-modellen av cerebral ischemi och etablerade den endovaskulära perforeringen, som kontinuerligt har förbättrats sedan15,16. Denna metod är baserad på det faktum att möss och människor delar ett liknande intrakraniellt vaskulärt nätverk, känt som Willis cirkel.
För postoperativ utvärdering och gradering av SAH i musmodellen har olika tillvägagångssätt föreslagits. utvecklade en betygsskala som har använts i stor utsträckning sedan 200817. Denna metod bedömer svårighetsgraden av SAH baserat på morfologiska förändringar. För denna metod måste dock musens hjärnvävnadsmorfologi undersökas under direkt syn, och därför måste musen offras för bedömning. Dessutom har flera metoder för att bestämma SAH-svårighetsgrad in vivo fastställts. Tillvägagångssätten sträcker sig från enkel neurologisk poängsättning till övervakning av intrakraniellt tryck (ICP) till olika radiologiska avbildningstekniker. Dessutom har MR-gradering visats som ett nytt, icke-invasivt verktyg för att gradera SAH-svårighetsgrad, vilket korrelerar med neurologisk poäng18,19.
Här presenteras ett protokoll för en SAH-modell orsakad av endovaskulär perforering, kombinerat med postoperativ MR. I ett försök att etablera ett system för att objektifiera blödningsmängden i en in vivo-miljö utvecklade vi också ett system för SAH-gradering och kvantifiering av total blodvolym baserat på 7,0 T högupplöst T2-viktad MR. Detta tillvägagångssätt säkerställer korrekt induktion av SAH och uteslutning av andra patologier såsom stroke, hydrocephalus eller intracerebral blödning (ICH) och komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes i enlighet med de riktlinjer och föreskrifter som fastställts av Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlin, Tyskland (G0063/18). I denna studie användes C57Bl/6J manliga (8-12 veckor gamla) möss med en vikt av 25 ± 0,286 g (genomsnittlig ± s.e.m.).
1. Förberedelse av djur
- Inducera anestesi genom att injicera ketamin (70 mg/kg) och xylazin (16 mg/kg) intraperitonealt. Behåll normal kroppstemperatur, vilket bidrar till snabb induktion av djupbedövning. Testa för adekvat sedering med smärtstimulans, såsom en tånypa, och verifiera frånvaron av en reaktion.
- Raka försiktigt musens nackhår med en rakhyvel, rengör det med 70% etanol följt av betadin / klorhexidin och applicera 1% lidokain på hudytan för lokal smärtkontroll.
- Placera musen i ryggläge. Använd tejp för att fixa lemmarna och svansen, försiktigt sträcka halsens hud till motsatt sida av operationen. Höj samtidigt nacken något.
- Använd oftalmisk salva (t.ex. 5% dexpanthenol) för att förhindra uttorkning av ögonen under operationen.
2. SAH-induktion
Figur 1: Steg-för-steg-bilder av kirurgisk teknik. (A) Avbildning av den exponerade högra halspulsådernatomin: CCA och dess förgrening i ICA och ECA identifieras, liksom eca:s små grenar (OA och STA). (B) ECA mobiliseras från den omgivande vävnaden och ligeras med två suturer innan den skärs. En tredje ligering måste placeras löst nära bifurkationen utan att täppa till den. (C) ICA och CCA ockluderas tillfälligt (med antingen ligering eller klämmor) för att förhindra överdriven blödning när revisionsrätten skärs noggrant. D) Glödtråden förs in i ECA och förs in i CCA. Den förutbestämda ligeringen måste dras åt försiktigt så att ingen blodutgjutning inträffar men det är möjligt att flytta fram glödtråden. (E) ICA och CCA öppnas igen, och revisionsrättens stubbe måste anpassas till en kranial riktning. Genom att trycka filamentet ~ 9 mm framåt i ICA kommer ACA-MCA-bifurkationen att nås, och kärlet perforeras sedan genom att skjuta filamentet ~ 3 mm längre. F) Glödtråden dras upp efter det att en tidsmässig religering av CCA har säkerställts. Revisionsrättens förutbestämda ligering täpps snabbt till, och CCA öppnas igen för att möjliggöra reperfusion. Förkortningar: ACA = främre cerebral artär, CCA = vanlig halspulsåder, ECA = yttre halspulsåder, MCA = mellersta hjärnartären, ICA = inre halspulsådern, OA = occipitallorartär, PPA = pterygopalatinartär, STA = överlägsen sköldkörtelartär. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Öppna nackhuden med en steril skalpell, från hakan till bröstbenets övre kant (1,5 cm) och separera spottkörtlarna från deras omgivande bindväv.
- Separera muskelgruppen längs ena sidan [i detta fall höger sida] av luftstrupen och exponera den gemensamma halspulsådern (CCA) manteln täckt med närande blodkärl och venules. CCA och vagalnerven ligger i närheten av varandra.
- Dissociera CCA och lämna en fri 8-0 silke sutur runt CCA utan att ligatera den i förväg. Var uppmärksam på skyddet av vagalnerven, eftersom den lätt skadas (Figur 1A).
- En trippel förgrening av CCA, ICA och ECA är synlig längs den nedre bakre tredjedelen av diastasen. Dissekera eca:s distala ände och lirera fartyget två gånger så långt som möjligt.
- Koppla bort ECA vid mittpunkten för det två gånger ligerade segmentet och skapa en fartygsstubbe.
- Förordna en ligering för glödtråden runt ECA-stubben, stäng den inte förrän filamentet har satts in.
- Använd en sutur eller mikroklämma för att tillfälligt täppa till ICA och CCA (figur 1B).
- Gör ett litet snitt (ungefär hälften av ECA-diametern) i ECA med hjälp av mikrovaskulär sax. Sätt in en 5-0 (alternativt 4-0) prolenfilament i ECA och för in den i CCA.
- Stäng ligaturen på ECA något medan du lossar mikroklämman på ICA och CCA (figur 1C).
- Dra försiktigt tillbaka filamentet och justera ECA-stubben i kranialriktningen och invaginera filamentet genom förgreningen i ICA (figur 1D).
- Rikta glödtrådens spets medialt i en vinkel på ~30° mot luftstrupens mittlinje och ~30° mot horisontalplanet. Skjut filamentet framåt inuti ICA. Efter att ha nått ACA-MCA-bifurkationen uppstår motstånd (~ 9 mm).
- Flytta filamentet 3 mm längre och perforera rätt ACA. Dra omedelbart ut filamentet till ECA-stubben, så att blodflödet kan strömma in i subaraknoidutrymmet.
- Håll glödtråden i detta läge i ca 10 s (figur 1E). Förekomsten av muskelskakningar, ipsilateral mios, kippande efter andan, förändrad hjärtrytm och urininkontinens kan vara stödjande bevis på framgångsrik operation.
- Stäng tillfälligt CCA för att undvika överskott av blodförlust. Dra ut glödtråden direkt och ligate ECA med den förutbestämda suturen. Öppna CCA igen och tillåt reperfusion och ytterligare effusion av blod i subaraknoidutrymmet (figur 1F).
- Efter att ha kontrollerat blödningsläckage, desinficera huden som omger såret för att förhindra postoperativa hudinfektioner och suturera såret med en icke-absorberbar 4-0 polyesterfibersutur.
- Placera musen i en termisk låda tills medvetandet återfås. Vänta tills djuret är helt vaket och se till att det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Återvänd inte djur till andra mösss företag förrän de är helt återställda.
- Administrera 200-300 mg/kg kroppsvikt paracetamol för postoperativ smärtlindring.
- Kontrollera mössen dagligen efter operationen.
3. MR-mätning
- 24 timmar efter operationen, utför MR med hjälp av en gnagareskanner (Materialtabell) och en dedikerad mushuvudresonator - här användes en 20 mm sändnings- / mottagningskvadraturvolymresonator.
- Placera musen på en uppvärmd cirkulerande vattenfilt för att säkerställa en konstant kroppstemperatur på ~37 °C. Inducera anestesi med 2,5 % isofluran i en O2/N2O-blandning (30%/70%) och bibehålla med 1,5-2 % isofluran via ansiktsmask under kontinuerlig ventilationsövervakning.
- Utför först en snabb referensskanning som förvärvar 3 ortogonala skivpaket (Tri-Pilot-Multi, FLASH med repetitionstid TR / ekotid TE = 200 ms / 3 ms, 1 genomsnitt, vändvinkel FA = 30 °, synfält FOV = 28 mm x 28 mm, matris MTX = 256 x 256, skivtjocklek 1 mm, total anskaffningstid TA = 30 s).
- Använd sedan en högupplöst T2-viktad 2D turbo spin-echo-sekvens för avbildning (avbildningsparametrar TR / TE = 5505 ms / 36 ms, RARE-faktor 8, 6 medelvärden, 46 sammanhängande axiella skivor med en skivtjocklek på 0,35 mm för att täcka hela hjärnan, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 min).
- Om resultatet är oklart, använd en ytterligare andningsutlöst T2 * viktad gradientekosekvens med samma isodistans som T2w-skanningen (2D FLASH, TR / TE = 600 ms / 6,3 ms, FA = 30 °, 1 genomsnitt, 20 axiella skivor med 0,35 mm tjocklek, FOV och MTX identiska med T2w, TA = 5-10 min beroende på andningshastigheten).
- Överför data till DICOM-bildformatet och använd ImageJ-programvaran för SAH-gradering och volymsättning av blodproppar. Detaljer om kvantifieringen listas som en steg-för-steg-guide i tilläggsmaterialet (kompletterande figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dödlighet
För denna studie utsattes totalt 92 manliga C57Bl/6J-möss i åldern 8-12 veckor för SAH-operation; i dessa observerade vi en total dödlighet på 11,9% (n = 12). Dödligheten inträffade uteslutande inom de första 6-24 timmarna efter operationen, vilket tyder på perioperativ dödlighet samt SAH-blödning i sig som de mest troliga bidragande faktorerna.
SAH blödningsgrad
Totalt 50 möss fick MRI 24 h postoperativt för att bekräfta SAH och säkerställa detektering av andra samtidiga patologier, inklusive subakut ischemisk stroke och hydrocephalus. De återstående djuren användes för tidigare skanningar för att välja lämplig tid för postoperativ MR. Bland de 50 undersökta mössen vid 24 timmars tidpunkt var n = 7 djur som inte uppvisade SAH (blödningsgrad 0) och n = 5 möss där ytterligare stroke och/eller ICH (blödningsgrad IV) påvisades. SAH-blödningsgraden kvantifierades baserat på T2-viktade MR-undersökningar enligt följande (figur 2A,B):
grad 0: ingen SAH eller blödning identifierad (14 %)
grad I: SAH tjocklek ≤0,80 mm (24%)
grad II: SAH tjocklek >0,8 och <1,6 mm (28%)
grad III: SAH tjocklek ≥1,6 mm (24%)
grad IV: SAH med antingen ICH och/eller stroke (10%).
Figur 2: SAH-graderingssystem med motsvarande blodvolym och MR-bilder. Grad 0: ingen SAH eller blödning identifierad (14%); grad I: SAH tjocklek ≤0,80 mm; grad II: SAH tjocklek >0,8 och <1,6 mm; grad III: SAH tjocklek ≥1,6 mm; grad IV: SAH med antingen ICH och/eller stroke. (B) Cirkeldiagram som visar fördelningen av SAH-kvalitet hos de experimentella mössen. (C,E) Beräknad SAH-blödningsvolym baserat på formeln V = A1 + A2 + ... + Ax) · d, genom vilken blödningsområdet bestäms via ImageJ på varje bildsektion, och summan av alla blödningsområden multipliceras med motsvarande MR-glidtjocklek. (D) Total blödningsvolym för varje SAH-grad baserat på Kothari abc/2-volymuppskattningen. Värden uttrycks som medelvärde ± SEM. Förkortningar: ICH = intracerebral blödning, MRI = magnetisk resonanstomografi. Skalstreck = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Blödningsvolym
För grad I-III kvantifierades blödningsvolymen med två olika metoder:
Metod A: Den totala blödningsvolymen beräknades baserat på volymuppskattningen abc/2 av Kathari et al., en modifiering av ekvationen för ellipsoidvolym som har använts i stor utsträckning i klinisk miljö för att uppskatta ICH-volymen (figur 2D)20.
Metod B: Den beräknade SAH-blödningsvolymen uppskattades baserat på formeln V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, genom vilken blödningsområdet bestämdes via ImageJ på varje bildsektion och summan av alla blödningsområden multiplicerades med motsvarande MRI-bildtjocklek ("Ai" motsvarar blödningsområdet på skiva "i", "x" är det totala antalet skivor, "d" motsvarar skivtjockleken). Denna metod tog hänsyn till formens oregelbundenhet (figur 2C,E). Förväntat visade metod B ett större värdeintervall i varje undergrupp. Båda metoderna visade emellertid en signifikant skillnad i motsvarande blödningsgrader som baserades på den axiella SAH-tjockleken och beskrivs i följande stycke. Kompletterande figur 2 visar SAH-volymen för alla undergrupper; förväntat var grad IV av heterogen karaktär eftersom den också innehöll samtidig ICH.
Statistisk analys och siffror
Data analyserades med hjälp av GraphPad Prism för statistiska analyser. Envägs ANOVA-analyser användes för att jämföra flera grupper. Värdena visas som medel ± standardfel och p-värden på p < 0,05 ansågs statistiskt signifikanta. Elementen i figur 1 och figur 2 komponerades med hjälp av BioRender.com.
Kompletterande figur 1: En steg-för-steg-guide för att kvantifiera blödningsvolymen med ImageJ. Importera bilderna med ImageJ och ange "Strg + I" för att visa dimensionella data. Ställ sedan in skalan för bilden. Identifiera alla bilder där SAH kan ses. För metod A, identifiera skivan med det största blödningsområdet och mät den kraniokudala längden (= a) samt den mediolaterala längden (= b) för de två ortogonala axlarna som spänner över ellipsoid SAH-volymen. Ellipsoidformens ventrodorsala dimension (=c) kan uppskattas baserat på skivtjockleken och antalet skivor på vilka SAH ses [c = skivtjocklek x antal skivor]. Beräkna volymen baserat på formeln:V= abc/2. För metod B mäter du blödningsområdena på varje skiva separat och beräknar sedan volymen baserat på formeln: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, med vilken d= skivtjocklek. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Blödningsvolymer för alla undergrupper. (A) Blödningsvolym (mm3) i varje undergrupp baserad på metod A med formeln V= abc/2. (B) Blödningsvolymer (mm3) för motsvarande undergrupper med metod B (formel V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d; d= skivtjocklek). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammanfattningsvis presenteras en standardiserad SAH-musmodell inducerad av endovaskulär filamentperforeringsoperation med mindre invasion, kort operativ tid och acceptabla dödlighetsnivåer. MR utförs 24 h postoperativt för att säkerställa rätt blödningsställe och uteslutning av andra relevanta intrakraniella patologier. Dessutom klassificerade vi olika SAH-blödningsgrader och mätte blödningsvolymer, vilket möjliggjorde ytterligare subgruppsanalyser baserade på blödningsgrad.
Tillräcklig positionering av musen påverkar framgången för rätt perforering. Musens nacke ska sträckas något till motsatt sida av operationen, med huvudet något förhöjt. Detta exponerar trifurkationen och gör punkteringsvägen lättare tillgänglig. Om det inte går att avancera filamentet kan det vara till hjälp att dra tillbaka glödtråden något till trifurkationen och justera huvudets position tills det är möjligt att avancera utan motstånd.
Intraoperativt nervskydd är avgörande. Störningar i vagalnerven och cervikal plexus kan orsaka förändringar i andnings- och hjärtrytmer, och vissa möss kan till och med dö på grund av maligna arytmier. Om dessa symtom uppstår är det viktigt att pausa proceduren i några minuter tills andningen och hjärtfrekvensen stabiliseras.
Att minska intraoperativ blodförlust är avgörande för att förbättra mössens överlevnad. Baserat på vår erfarenhet tillämpas dubbel suturligering bäst nära revisionsrätten. Vi kopplar bort ECA i mitten av de två ligationerna för att förhindra blodåterflöde från den distala ECA-stubben. När glödtråden sätts in i ECA bör den förutbestämda suturen ligeras för att förhindra blodutgjutning från snittet. Det är viktigt att inte lira kärlet för hårt eftersom detta hindrar korrekt filamentutveckling.
Lämpligt djup på filamentinsättningen är avgörande för framgångsrik SAH-induktion. På grund av åldern på de använda mössen (8-12 veckor) sätter vi in filamentet ~ 9 mm inuti ICA och stannar när motstånd uppstod och avancerade sedan ~ 3 mm ytterligare för perforering. Att sätta in glödtråden som inte är tillräckligt djup kan leda till otillräcklig perforering och orsaka ingen SAH, medan överdriven insättning kan leda till slag och /eller ICH (figur 3). Samtidigt måste mössens ursprungliga anatomi och kärlstrukturer bevaras så bra som möjligt under operationen. Till exempel bör den occipitala artären (OA) eller överlägsen sköldkörtelartär (STA) och närande blodkärl på manteln behållas så mycket som möjligt.
Figur 3: Mushjärnans anatomi och makroskopiska bilder av SAH. (A) Schematisk mus vaskulär anatomi som visar platsen för filamentperforering. (B) Klassisk makroskopisk bild av framgångsrik induktion av SAH. Innan hjärnan togs bort utfördes en perfusion av 1x PBS. (C) Makroskopisk vy av musen där filamentet trycktes för djupt, vilket orsakade ICH. Förkortningar: ACA = främre hjärnartär, ECA = yttre halspulsåder, CCA = vanlig halspulsåder, ICA = inre halspulsåder, ICH = intracerebral blödning, L = vänster, MCA = mellersta hjärnartären, PPA = pterygopalatinartär, R = höger. Skalstreck = 3 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Den endovaskulära perforeringsmodellen är en vanligt förekommande djurmodell för att studera SAH men medlen för att säkerställa blödningsgrad och utesluta andra patologier såsom stroke eller intracerebral blödning är inte tillräckligt standardiserade i litteraturen21. Precis som alla operativa djurmodeller beror framgångsgraden och robustheten hos SAH-induktion på kirurgens erfarenhet.
För närvarande är den endovaskulära perforeringsmodellen en av de mest populära metoderna för experimentell SAH-induktion hos möss. Detta tillvägagångssätt kräver inte kraniotomi och liknar exakt de processer som äger rum hos människor som lider av aneurysmal SAH22. Fördelarna inkluderar nära imitation av patofysiologin efter aneurysmal SAH, avseende akuta och fördröjda reaktioner23. Dessutom har dödligheten i denna modell visat sig likna den i kliniska studier på patienter som lider av aneurysmal SAH23. I jämförelse med blodinjektionsmodeller efterliknas förändringar i blod-hjärnbarriärpermeabilitet närmare, och högre frekvenser av vasospasm uppnås vid filamentperforering11,24. Blodinjektionsmodeller är mer invasiva och utgör därför en större risk för vävnadsskador jämfört med den mindre invasiva endovaskulära perforeringsmodellen. Icke desto mindre bör det noteras att en stor fördel med blodinjektionsmetoder är den lättkontrollerade blodvolymen23. Standardiseringen av injektionshastigheten är viktig att överväga eftersom förändringar av ICP är starkt beroende av injektionshastigheten23. Bortsett från dessa klassiska modeller utgör kombinationen av elastasinjektion för att inducera aneurysmbildning och hypertoni genom ensidig nefrektomi, vilket i slutändan leder till aneurysmbrott, en intressant modell för att studera subaraknoidalblödning i en mer patofysiologiskt realistisk miljö25. Att integrera sådana tekniker med genetiskt modifierade möss kommer att vara av intresse för framtida studier.
Tidigare SAH-graderingssystem för filamentperforeringsmodellen baseras på mängden synligt subaraknoidblod i olika hjärnsegment efter att musen har offrats17. Följaktligen tillåter dessa betygssystem inte långtidsstudier när blodet redan har resorberats vid tidpunkten för avlivningen. I klinisk miljö graderas SAH baserat på klinisk presentation samt SAH-tjocklek vid avbildning, motsvarande kliniskt utfall 1,26,27,28. Därför, i ett försök att klassificera blödningens svårighetsgrad icke-invasivt, lade vi till en standardiserad MR-uppföljningsundersökning till grad SAH röntgenmässigt, genom vilken betygsättningen baserades på redan existerande mänskliga betygsskalor och anpassade betygssystemet för ett tidigare publicerat MRI-betygssystem hos SAH-möss av Egashira et al.18. Detta tillvägagångssätt säkerställer också kvantifiering av total blodvolym och uteslutning av djur med andra samtidiga intrakraniella patologier (t.ex. stroke, ICH, hydrocephalus). Vissa studier föreslog intrakraniellt tryck (ICP), cerebral perfusion och blodtrycksövervakning som bevis på framgångsrik SAH-induktion, vilket kan vara ytterligare användbara verktyg29. Indirekta sätt att gradera svårighetsgraden av SAH och potentiell intraparenkymal skada inkluderar att kombinera kliniska fynd med histologisk färgning för celldödsmarkörer som p53, TUNEL eller caspase-3. Dessa indirekta verktyg som ICP-övervakning såväl som neurologiska kanske inte skiljer snyggt andra patologier som stroke, intrakraniell blödning eller hydrocefalus. Trots fördelarna med MR-klassificering finns det en stor nackdel med detta tillvägagångssätt när det gäller dess genomförbarhet: MR är inte lika allmänt tillgänglig för laboratorier som andra metoder. Detta begränsar det breda införandet av MR-graderingssystem i experimentell SAH. När det är tillgängligt lägger dock det presenterade MR-betygssystemet till ett verktyg för att standardisera experimentella SAH-modeller, vilket underlättar reproducerbarhet och jämförbarhet av experimenten23. I denna studie, trots observerade kliniska förändringar under operationen, fanns det fortfarande en 14% frekvens av möss utan tecken på SAH på postoperativ MRI. Möjligen led möss i denna undergrupp av mikrohemorbrationer, som inte kan detekteras på MR (liknande SAH-patienter med negativ CT men närvaron av xanthochromia vid lumbalpunktion). Dessa möss uteslöts i denna experimentella installation för ytterligare analyser. Den tekniska orsaken till dessa "no-bleeds" på MRI kan vara otillräcklig filamentinsättning, vilket resulterar i ingen perforering (t.ex. genom felaktig placering i OA eller pterygopalatinartär (PPA)). Dessutom kan det framgångsrikt perforerade kärlet stängas igen efter att glödtråden har dragits tillbaka, vilket förhindrar SAH.
Sammanfattningsvis presenteras en standardiserad modell för experimentell aneurysmal SAH genom endovaskulär perforering, kombinerad med MR-avbildning 24 timmar efter operation för att bekräfta och gradera blödningen och för att utesluta andra relevanta intrakraniella patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter
Acknowledgments
SL stöddes av det kinesiska stipendierådet. KT stöddes av BIH-MD-stipendiet från Berlin Institute of Health och Sonnenfeld-Stiftung. RX stöds av BIH-Charité Clinician Scientist Program, finansierat av Charité -Universitätsmedizin Berlin och Berlin Institute of Health. Vi erkänner stöd från den tyska forskningsstiftelsen (DFG) och Open Access Publication Fund of Charité - Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
- Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
- Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
- Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
- de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
- Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
- Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
- Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
- Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
- Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
- Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
- Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
- Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
- Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
- Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
- Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
- Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
- Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
- Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
- Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).
