Summary
Her præsenterer vi en standardiseret SAH-musemodel, induceret af endovaskulær filamentperforering, kombineret med magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) 24 timer efter operationen for at sikre det korrekte blødningssted og udelukke andre relevante intraknale patologier.
Abstract
Den endovaskulære filamentperforeringsmodel til at efterligne subarachnoid blødning (SAH) er en almindeligt anvendt model - teknikken kan dog forårsage en høj dødelighed samt et ukontrollabelt volumen SAH og andre intraknale komplikationer såsom slagtilfælde eller intrakraniel blødning. I denne protokol præsenteres en standardiseret SAH-musemodel, induceret af endovaskulær filamentperforering kombineret med magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) 24 timer efter operationen for at sikre det korrekte blødningssted og udelukke andre relevante intrakniale patologier. Kort fortalt bliver C57BL/6J-mus anæstesis med en intraperitoneal ketamin/xylazin (70 mg/16 mg/kg legemsvægt) injektion og placeres i liggende stilling. Efter midterlinjehalssnit udsættes den fælles halspulsåre (CCA) og carotisbifurcation, og en 5-0 ikke-absorberbar monofilament polypropylensutur indsættes retrograd i den ydre halspulsåre (ECA) og fremføres til den fælles halspulsåre. Derefter invagineres glødetråden i den indre halspulsåre (ICA) og skubbes fremad for at perforere den forreste cerebrale arterie (ACA). Efter genopretning efter operationen gennemgår mus en 7,0 T MR 24 timer senere. Blødningsmængden kan kvantificeres og gradueres via postoperativ MR, hvilket muliggør en robust eksperimentel SAH-gruppe med mulighed for at udføre yderligere undergruppeanalyser baseret på blodmængde.
Introduction
Subarachnoid blødning (SAH) er forårsaget af brud på en intrakraniel aneurisme og udgør en livstruende nødsituation forbundet med betydelig sygelighed og dødelighed, der tegner sig for ca. 5% af slagtilfælde 1,2. SAH-patienter med svær hovedpine, neurologisk dysfunktion og progressiv bevidsthedsforstyrrelse3. Omkring 30 % af SAH-patienterne dør inden for de første 30 dage efter den førsteblødningshændelse 4. Klinisk oplever 50% af patienterne forsinket hjerneskade (DBI) efter tidlig hjerneskade. DBI er kendetegnet ved forsinket cerebral iskæmi og forsinkede neurologiske underskud. Nuværende undersøgelser har vist, at de synergistiske virkninger af flere forskellige faktorer fører til tab af neurologisk funktion, herunder ødelæggelse af blod-hjerne-barrieren, sammentrækning af små arterier, mikrocirkulationsdysfunktion og trombose 5,6.
Et unikt aspekt af SAH er, at patogenesen stammer fra en ekstraparenkymal placering, men derefter fører til skadelige kaskader inde i parenchymen: patologien begynder med akkumulering af blod i det subarachnoide rum, hvilket udløser en lang række intraparenkymale virkninger, såsom neuroinflammation, neuronal og endotelcelleapopottose, kortikal spredning depolarisering og hjerneødemdannelse7, 8.
Klinisk forskning er begrænset af flere faktorer, hvilket gør dyremodellen til et kritisk element i konsekvent og præcist at efterligne sygdommens patomekanismeistiske ændringer. Forskellige SAH-modelprotokoller er blevet foreslået, f.eks. autolog blodinjektion i cisterna magna (ACM). Også en modificeret metode med en dobbelt injektion af autologt blod i cisterna magna og optisk chiasm cistern (APC) henholdsvis 9,10. Mens autolog blodinjektion er en enkel måde at simulere den patologiske proces med vasospasme og inflammatoriske reaktioner efter subarachnoid blødning, er den følgende stigning i intrakranielt tryk (ICP) relativt langsom, og ingen bemærkelsesværdige ændringer i permeabiliteten af blod-hjernebarrieren induceres11,12. En anden metode, den periarterielle blodplacering, der normalt anvendes i store SAH-modeller (f.eks. Aber og hunde), involverer at placere antikoaguleret autologt blod eller sammenlignelige blodprodukter omkring karret. Diameterændringerne i arterien kan observeres med et mikroskop, der tjener som indikator for cerebral vasospasme efter SAH13.
Barry et al. beskrev først en endovaskulær perforeringsmodel i 1979, hvor basilararterien udsættes efter fjernelse af kraniet; arterien punkteres derefter med wolframmikroelektroder ved hjælp af en mikroskopisk stereotaktisk teknik14. I 1995 ændrede Bederson og Veelken Zea-Longa-modellen for cerebral iskæmi og etablerede den endovaskulære perforering, som løbende er blevet forbedret lige siden15,16. Denne metode er baseret på det faktum, at mus og mennesker deler et lignende intrakranielt vaskulært netværk, kendt som Willis-cirklen.
Til postoperativ evaluering og klassificering af SAH i musemodellen er der foreslået forskellige tilgange. Sugawara et al. udviklede en karakterskala, der har været meget udbredt siden 200817. Denne metode vurderer sværhedsgraden af SAH baseret på morfologiske ændringer. For denne metode skal musens hjernevævsmorfologi imidlertid undersøges under direkte syn, og musen skal derfor ofres til vurdering. Desuden er der etableret flere metoder til bestemmelse af SAH-sværhedsgrad in vivo. Tilgange spænder fra simpel neurologisk scoring til overvågning af intrakranielt tryk (ICP) til forskellige radiologiske billeddannelsesteknikker. Desuden er MR-klassificering blevet vist som et nyt, ikke-invasivt værktøj til at klassificere SAH-sværhedsgrad, der korrelerer med neurologisk score18,19.
Her præsenteres en protokol for en SAH-model forårsaget af endovaskulær perforering kombineret med postoperativ MR. I et forsøg på at etablere et system til objektivering af blødningsmængden i en in vivo-indstilling udviklede vi også et system til SAH-klassificering og kvantificering af total blodvolumen baseret på 7,0 T højopløselig T2-vægtet MR. Denne tilgang sikrer korrekt induktion af SAH og udelukkelse af andre patologier såsom slagtilfælde, hydrocephalus eller intracerebral blødning (ICH) og komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenterne blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat af Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlin, Tyskland (G0063/18). I denne undersøgelse blev C57Bl/6J hanmus (8-12 uger gamle) med en vægt på 25 ± 0,286 g (gennemsnitlig ± s.e.m.) anvendt.
1. Tilberedning af dyr
- Inducere anæstesi ved at injicere ketamin (70 mg/kg) og xylazin (16 mg/kg) intraperitonealt. Oprethold normal kropstemperatur, hvilket bidrager til hurtig induktion af dyb anæstesi. Test for tilstrækkelig sedation med en smertestimulus, såsom en tåklemme, og kontroller fraværet af en reaktion.
- Barber forsigtigt musens nakkehår med en barbermaskine, rengør det med 70% ethanol efterfulgt af betadin / chlorhexidin, og påfør 1% lidokain på hudoverfladen for lokal smertekontrol.
- Placer musen i liggende stilling. Brug tape til at fastgøre lemmer og hale, og stræk forsigtigt halsens hud til den modsatte side af operationen. Samtidig hæve nakken lidt.
- Brug oftalmisk salve (f.eks. 5% dexpanthenol) for at forhindre dehydrering af øjnene under operationen.
2. SAH induktion
Figur 1: Trinvise billeder af kirurgisk teknik. (A) Afbildning af den eksponerede højre halspulsåreanatomi: CCA og dens opdeling i ICA og ECA identificeres, samt de små grene af Revisionsretten (OA og STA). (B) Revisionsretten mobiliseres fra det omgivende væv og ligeres med to suturer, inden den skæres. En tredje ligering skal placeres løst nær bifurkationen uden at okkludere den. C) ICA og CCA er midlertidigt okkluderet (med enten ligation eller clips) for at forhindre overdreven blødning, når Revisionsretten skæres omhyggeligt. D) Filamentet indsættes i Revisionsretten og fremrykkes til CCA. Den forudbestemte ligering skal strammes omhyggeligt, så der ikke forekommer blodudslip, men det er stadig muligt at fremme glødetråden. E) ICA og CCA genåbnes, og Revisionsrettens stub skal tilpasses kranieretningen. Ved at skubbe glødetråden ~9 mm fremad i ICA nås ACA-MCA-bifurkationen, og beholderen perforeres derefter ved at skubbe glødetråden ~3 mm længere. F) Glødetråden trækkes tilbage efter at have sikret en tidsmæssig religation af CCA'en. Revisionsrettens forudbestemte ligering afgrænses hurtigt, og CCA genåbnes for at muliggøre reperfusion. Forkortelser: ACA = forreste cerebrale arterie, CCA = fælles halspulsåre, ECA = ekstern halspulsåre, MCA = midterste cerebrale arterie, ICA = indre halspulsåre, OA = occipital arterie, PPA = pterygopalatinarterie, STA = overlegen skjoldbruskkirtelarterie. Skalabjælke = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Åbn nakkehuden med en steril skalpel, fra hagen til den øverste kant af brystbenet (1,5 cm), og adskil spytkirtlerne direkte fra deres omgivende bindevæv.
- Adskil muskelgruppen langs den ene side [i dette tilfælde højre side] af luftrøret, og udsluk den fælles halspulsåre (CCA) kappe dækket af nærende blodkar og venuler. CCA og vagalnerven er placeret i nærheden af hinanden.
- Dissocier CCA og efterlad en fri 8-0 silkesutur omkring CCA uden at ligere den på forhånd. Vær opmærksom på beskyttelsen af vagalnerven, da den let beskadiges (figur 1A).
- En tredobbelt bifurcation af CCA, ICA og Revisionsretten er synlig langs den nederste bageste tredjedel af diastasen. Dissekere den distale ende af ECA og ligere beholderen dobbelt så langt distasalt som muligt.
- Frakobl REVISIONSRETTEN midt i det to gange ligerede segment, og skab en karstub.
- Forudarranger en ligation for glødetråden omkring ECA-stubben, luk den ikke, før en vellykket filamentindsættelse er afsluttet.
- Brug en sutur eller et mikroklip til midlertidigt at okkludere ICA og CCA (figur 1B).
- Lav et lille snit (ca. halvdelen af REVISIONSRETTENs diameter) i Revisionsretten ved hjælp af en mikrovaskulær saks. Indsæt et 5-0 (alternativt 4-0) prolenefilament i Revisionsretten og fremrykke det i CCA.
- Luk ligaturen på ECA lidt, mens mikroklemmen på ICA og CCA løsnes (figur 1C).
- Træk forsigtigt tilbage på glødetråden, og juster ECA-stubben i kranial retning, og invaginer filamentet gennem bifurkationen i ICA (figur 1D).
- Ret glødetrådspidsen medialt i en vinkel på ~30° til trakeal midterlinjen og ~30° til det vandrette plan. Skub glødetråden fremad inde i ICA. Efter at have nået ACA-MCA-bifurcationen opstår der modstand (~ 9 mm).
- Fremryk glødetråden 3 mm yderligere, perforer den rigtige ACA. Træk straks glødetråden tilbage til ECA-stubben, så blodet kan strømme ind i det subarachnoide rum.
- Hold glødetråden i denne position i ca. 10 s (figur 1E). Tilstedeværelsen af muskelrystelser, ipsilateral miosis, gispende efter vejret, ændret hjerterytme og urininkontinens kan være understøttende bevis for vellykket operation.
- Luk CCA midlertidigt for at undgå overskydende blodtab. Træk filamentet ud med det samme, og ligte ECA med den forudbestemte sutur. Genåbn CCA og tillad reperfusion og yderligere effusion af blod i det subarachnoide rum (figur 1F).
- Efter kontrol af blødningslækage desinficeres huden omkring såret for at forhindre postoperative hudinfektioner og suturere såret med en ikke-absorberbar 4-0 polyesterfibersutur.
- Placer musen i en termisk kasse, indtil bevidstheden er genvundet. Vent, indtil dyret er helt vågent, og sørg for, at det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde streng liggende. Returner ikke dyr til selskab med andre mus, før de er fuldt genoprettet.
- Administrer 200-300 mg/kg legemsvægt paracetamol til postoperativ smertelindring.
- Kontroller musene dagligt efter operationen.
3. MR-måling
- 24 timer efter operationen skal du udføre MR ved hjælp af en gnaverscanner (Table of Materials) og en dedikeret musehovedresonator - her blev der anvendt en 20 mm transmittere/modtage kvadraturvolumenresonator.
- Placer musen på et opvarmet cirkulerende vandtæppe for at sikre en konstant kropstemperatur på ~ 37 ° C. Anæstesi med 2,5 % isofluran i en O2/N2O-blanding (30 %/70 %) og vedligehold med 1,5-2 % isofluran via ansigtsmaske under kontinuerlig ventilationsovervågning.
- Udfør først en hurtig referencescanning, der erhverver 3 ortogonale skivepakker (Tri-Pilot-Multi, FLASH med gentagelsestid TR / ekkotid TE = 200 ms / 3 ms, 1 gennemsnit, flipvinkel FA = 30 °, synsfelt FOV = 28 mm x 28 mm, matrix MTX = 256 x 256, skivetykkelse 1 mm, samlet anskaffelsestid TA = 30 s).
- Brug derefter en T2-vægtet 2D turbo spin-ekkosekvens med høj opløsning til billeddannelse (billeddannelsesparametre TR / TE = 5505 ms / 36 ms, RARE faktor 8, 6 gennemsnit, 46 sammenhængende aksiale skiver med en skivetykkelse på 0,35 mm for at dække hele hjernen, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 minutter).
- Hvis resultatet er uklart, skal du bruge en yderligere respirationsudløst T2*vægtet gradientekkosekvens med samme isodistance som T2w-scanningen (2D FLASH, TR/TE = 600 ms/6,3 ms, FA = 30°, 1 gennemsnit, 20 aksiale skiver med 0,35 mm tykkelse, FOV og MTX identiske med T2w, TA = 5-10 min afhængigt af respirationshastigheden).
- Overfør dataene til DICOM-billedformatet, og brug ImageJ-software til SAH-klassificering og volumen af blodpropper. Nærmere oplysninger om kvantificeringen er anført som en trinvis vejledning i det supplerende materiale (supplerende figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dødelighed
Til denne undersøgelse blev i alt 92 C57Bl/6J-hanmus i alderen 8-12 uger udsat for SAH-operation; i disse observerede vi en samlet dødelighed på 11,9% (n = 12). Dødeligheden forekom udelukkende inden for de første 6-24 timer efter operationen, hvilket tyder på perioperativ dødelighed samt SAH-blødning i sig selv som de mest sandsynlige medvirkende faktorer.
SAH blødningsgrad
I alt 50 mus modtog MR 24 timer postoperativt for at bekræfte SAH og sikre påvisning af andre samtidig forekommende patologier, herunder subakut iskæmisk slagtilfælde og hydrocephalus. De resterende dyr blev brugt til tidligere scanninger for at vælge den passende tid til postoperativ MR. Blandt de 50 undersøgte mus på 24 timers tidspunkt var n = 7 dyr, der ikke præsenterede SAH (blødningsgrad 0) og n = 5 mus, hvor yderligere slagtilfælde og/eller ICH (blødningsgrad IV) blev påvist. SAH-blødningsgraden blev kvantificeret på grundlag af T2-vægtede MR-scanninger som følger (figur 2A,B):
grad 0: ingen SAH eller blødning identificeret (14%)
klasse I: SAH tykkelse ≤0,80 mm (24%)
klasse II: SAH-tykkelse >0,8 og <1,6 mm (28%)
klasse III: SAH-tykkelse ≥1,6 mm (24%)
grad IV: SAH med enten ICH og/eller slagtilfælde (10%).
Figur 2: SAH-klassificeringssystem med tilsvarende blodvolumen og MR-billeder. (A) T2-vægtede MR-aksiale sektioner, der viser repræsentative billeder, der kategoriserer SAH-kvalitet. Grad 0: ingen SAH eller blødning identificeret (14%); klasse I: SAH-tykkelse ≤0,80 mm; klasse II: SAH-tykkelse >0,8 og <1,6 mm; klasse III: SAH-tykkelse ≥1,6 mm; grad IV: SAH med enten ICH og/eller slagtilfælde. (B) Cirkeldiagram, der viser fordelingen af SAH-kvalitet i forsøgsmusene. (C,E) Beregnet SAH-blødningsvolumen baseret på formlen V = A1 + A2 + ... + Ax) · d, hvorved blødningsområdet bestemmes via ImageJ på hvert diasafsnit, og summen af alle blødningsområder multipliceres med den tilsvarende MR-diastykkelse. (D) Samlet blødningsvolumen for hver SAH-klasse baseret på Kothari abc/2-volumenestimatet. Værdier udtrykkes som middelværdi ± SEM. Forkortelser: ICH = intracerebral blødning, MR = magnetisk resonansbilleddannelse. Skalabjælke = 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Blødning volumen
For grad I-III blev blødningsvolumen kvantificeret ved to forskellige metoder:
Metode A: Det samlede blødningsvolumen blev beregnet ud fra abc/2-volumenestimeringen af Kathari et al., en ændring af ligningen for ellipsoidvolumen, som er blevet anvendt bredt i den kliniske indstilling til at estimere ICH-volumen (figur 2D)20.
Metode B: Det beregnede SAH-blødningsvolumen blev estimeret ud fra formlen V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, hvorved blødningsområdet blev bestemt via ImageJ på hvert diasafsnit, og summen af alle blødningsområder blev ganget med den tilsvarende MR-glidetykkelse (»Ai« svarer til blødningsområdet på skiven »i«, »x« er det samlede antal skiver, »d« svarer til skivetykkelsen). Denne metode tog hensyn til formens uregelmæssighed (figur 2C,E). Forventeligt viste metode B et større værdiområde i hver undergruppe. Begge metoder viste imidlertid en signifikant forskel i de tilsvarende blødningskvaliteter, der var baseret på den aksiale SAH-tykkelse og er beskrevet i det følgende afsnit. Supplerende figur 2 viser SAH-volumenet for alle undergrupper; forventeligt var klasse IV af heterogen karakter, da den også indeholdt samtidig forekommende ICH.
Statistisk analyse og tal
Data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism til statistiske analyser. Envejs ANOVA-analyser blev brugt til at sammenligne flere grupper. Værdierne vises som midler ± standardfejl og p-værdier på p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Elementer i figur 1 og figur 2 blev sammensat ved hjælp af BioRender.com.
Supplerende figur 1: En trinvis vejledning til kvantificering af blødningsvolumen med ImageJ. Importer billederne med ImageJ, og indtast "Strg + I" for at vise de dimensionelle data. Indstil derefter skalaen for billedet. Identificer alle de billeder, hvor SAH kan ses. For metode A skal skiven identificeres med det største blødningsområde, og den kraniokaudale længde (=a) samt den mediolaterale længde (=b) af de to ortogonale akser, der spænder over det ellipsoide SAH-volumen. Den ventrodorsale dimension (=c) af den ellipsoide form kan estimeres ud fra skivetykkelsen og antallet af skiver, hvorpå SAH ses [c = skivetykkelse x antal skiver]. Beregn volumenet baseret på formlen:V= abc/2. For metode B måles blødningsområderne på hver skive separat og beregnes derefter volumenet baseret på formlen: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, hvorved d = skivetykkelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Blødningsvolumener af alle undergrupper. A) Blødningsvolumen (mm3) i hver undergruppe baseret på metode A ved hjælp af formlen V= abc/2. (B) Blødningsvolumener (mm3) af de tilsvarende undergrupper ved anvendelse af metode B (formel V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d; d= skivetykkelse). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenfattende præsenteres en standardiseret SAH-musemodel induceret af endovaskulær filamentperforeringsoperation med mindre invasion, kort operativ tid og acceptabel dødelighed. MR udføres 24 timer postoperativt for at sikre det korrekte blødningssted og udelukkelse af andre relevante intrakniale patologier. Desuden klassificerede vi forskellige SAH-blødningsgrader og målte blødningsvolumener, hvilket tillod yderligere undergruppeanalyser baseret på blødningskvalitet.
Tilstrækkelig positionering af musen påvirker succesen med den korrekte perforering. Musens hals skal strækkes lidt til den modsatte side af operationen, hvor hovedet er lidt forhøjet. Dette afslører trifurkationen og gør punkteringsstien lettere tilgængelig. Hvis fremrykningen af glødetråden mislykkes, kan det være nyttigt at trække glødetråden lidt tilbage til trifurkationen og justere hovedets position, indtil det er muligt at komme videre uden modstand.
Intraoperativ nervebeskyttelse er kritisk. Forstyrrelser i vagalnerven og cervikal plexus kan forårsage ændringer i åndedræts- og hjerterytmer, og nogle mus kan endda dø på grund af ondartede arytmier. Hvis disse symptomer opstår, er det vigtigt at sætte proceduren på pause i et par minutter, indtil vejrtrækningen og pulsen stabiliseres.
Reduktion af intraoperativt blodtab er afgørende for at forbedre musens overlevelse. Baseret på vores erfaring anvendes dobbelt suturligation bedst tæt på Revisionsretten. Vi afbryder ECA midt i de to ligationer for at forhindre blodtilstrømning fra den distale ECA-stub. Når glødetråden indsættes i REVISIONSRETTEN, skal den forudbestemte sutur ligeres for at forhindre blodudslip fra snittet. Det er vigtigt ikke at ligere beholderen for tæt, da dette forhindrer korrekt glødetrådsfremskridt.
Passende dybde af filamentindsættelse er afgørende for en vellykket SAH-induktion. På grund af alderen på de anvendte mus (8-12 uger) indsætter vi glødetråden ~ 9 mm inde i ICA og stopper, når der opstod modstand, og avancerede derefter ~ 3 mm yderligere til perforering. Indsættelse af glødetråden, der ikke er dyb nok, kan resultere i utilstrækkelig perforering, hvilket ikke forårsager SAH, mens overdreven indsættelse kan føre til slagtilfælde og / eller ICH (figur 3). Samtidig skal musenes oprindelige anatomi og vaskulære strukturer bevares så godt som muligt under operationen. For eksempel bør den occipitale arterie (OA) eller overlegne skjoldbruskkirtelarterie (STA) og nærende blodkar på skeden bevares så meget som muligt.
Figur 3: Musens hjerneanatomi og makroskopiske billeder af SAH. A) Skematisk vaskulær anatomi for mus, der viser stedet for filamentperforering. (B) Klassisk makroskopisk billede af vellykket induktion af SAH. Før fjernelse af hjernen blev der udført en perfusion på 1x PBS. (C) Makroskopisk billede af musen, hvor glødetråden blev skubbet for dybt, hvilket forårsagede ICH. Forkortelser: ACA = forreste cerebrale arterie, ECA = ekstern halspulsåre, CCA = fælles halspulsåre, ICA = intern halspulsåre, ICH = intracerebral blødning, L = venstre, MCA = midterste cerebrale arterie, PPA = pterygopalatinarterie, R = højre. Skalabjælke = 3 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Den endovaskulære perforeringsmodel er en almindeligt anvendt dyremodel til at studere SAH, men midlerne til at sikre blødningskvalitet og udelukke andre patologier såsom slagtilfælde eller intracerebral blødning er ikke tilstrækkeligt standardiseret i litteraturen21. Ligesom enhver operativ dyremodel afhænger succesraten og robustheden af SAH-induktion af kirurgens erfaring.
I øjeblikket er den endovaskulære perforeringsmodel en af de mest populære metoder til eksperimentel SAH-induktion hos mus. Denne tilgang kræver ikke kraniotomi og ligner nøjagtigt de processer, der finder sted hos mennesker, der lider af aneurysmal SAH22. Fordelene omfatter tæt efterligning af patofysiologien efter aneurysmal SAH, hvad angår akutte og forsinkede reaktioner23. Derudover har dødeligheden i denne model vist sig at være den samme som i kliniske undersøgelser hos patienter, der lider af aneurysmal SAH23. I sammenligning med blodinjektionsmodeller efterlignes ændringer i blod-hjernebarrierepermeabilitet nærmere, og højere vasospasmehastigheder opnås i filamentperforering11,24. Blodinjektionsmodeller er mere invasive og udgør derfor en større risiko for vævsskade sammenlignet med den mindre invasive endovaskulære perforeringsmodel. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at en stor fordel ved blodinjektionsmetoder er det let kontrollerede blodvolumen23. Standardiseringen af injektionshastigheden er vigtig at overveje, da ændringer af ICP er stærkt afhængige af injektionshastigheden23. Bortset fra disse klassiske modeller udgør kombinationen af elastaseinjektion for at inducere aneurismedannelse og hypertension ved ensidig nefrektomi, der i sidste ende fører til aneurismebrud, en interessant model til at studere subarachnoid blødning i en mere patofysiologisk realistisk indstilling25. Integration af sådanne teknikker med genetisk modificerede mus vil være af interesse for fremtidige undersøgelser.
Tidligere SAH-klassificeringssystemer til filamentperforeringsmodellen er baseret på mængden af synligt subarachnoidt blod i forskellige hjernesegmenter, efter at musen er blevet ofret17. Derfor tillader disse klassificeringssystemer ikke langsigtede undersøgelser, når blodet allerede er blevet resorberet på offertidspunktet. I den kliniske indstilling klassificeres SAH baseret på klinisk præsentation samt SAH-tykkelse på billeddannelse, svarende til klinisk resultat 1,26,27,28. Derfor tilføjede vi i et forsøg på at klassificere blødningssværhedsgraden noninvasivt en standardiseret MR-opfølgningsundersøgelse til klasse SAH radiografisk, hvorved klassificeringen var baseret på allerede eksisterende menneskelige karakterskalaer, der tilpassede klassificeringssystemet i et tidligere offentliggjort MR-klassificeringssystem i SAH-mus af Egashira et al.18. Denne tilgang sikrer også kvantificering af total blodvolumen og udelukkelse af dyr med andre samtidig forekommende intrakniale patologier (f.eks. Slagtilfælde, ICH, hydrocephalus). Nogle undersøgelser foreslog intrakranielt tryk (ICP), cerebral perfusion og blodtryksovervågning som bevis for vellykket SAH-induktion, hvilket kan være yderligere nyttige værktøjer29. Indirekte måder at klassificere sværhedsgraden af SAH og potentiel intraparenkymal skade omfatter kombination af kliniske fund med histologisk farvning for celledødsmarkører såsom p53, TUNEL eller caspase-3. Imidlertid kan disse indirekte værktøjer såsom ICP-overvågning såvel som neurologiske ikke skelne pænt andre patologier såsom slagtilfælde, intrakraniel blødning eller hydrocephalus. På trods af fordelene ved MR-klassificering er der en stor ulempe ved denne tilgang med hensyn til dens gennemførlighed: MR er ikke så bredt tilgængelig for laboratorier som andre metoder. Dette begrænser den brede introduktion af MR-klassificeringssystemer i eksperimentel SAH. Når det er tilgængeligt, tilføjer det præsenterede MR-klassificeringssystem imidlertid et værktøj til at standardisere eksperimentelle SAH-modeller, hvilket letter reproducerbarheden og sammenligneligheden af eksperimenterne23. I denne undersøgelse var der på trods af observerede kliniske ændringer under operationen stadig en 14% rate af mus uden tegn på SAH på postoperativ MR. Muligvis led mus i denne undergruppe af mikroblødninger, der ikke kunne påvises på MR (svarende til SAH-patienter med negativ CT, men tilstedeværelsen af xanthochromia i lændehvirvelpunktering). Disse mus blev udelukket i denne forsøgsopstilling til yderligere analyser. Den tekniske årsag til disse "no-bleeds" på MR kan være utilstrækkelig filamentindsættelse, hvilket resulterer i ingen perforering (f.eks. ved forkert placering i OA eller pterygopalatinarterie (PPA)). Derudover kan det vellykkede perforerede kar lukke igen efter tilbagetrækning af glødetråden, hvilket forhindrer SAH.
Sammenfattende præsenteres en standardiseret model for eksperimentel aneurysmal SAH ved endovaskulær perforering kombineret med MR-billeddannelse 24 timer efter operationen for at bekræfte og klassificere blødningen og udelukke andre relevante intraknale patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter
Acknowledgments
SL blev støttet af det kinesiske stipendieråd. KT blev støttet af BIH-MD-stipendiet fra Berlin Institute of Health og Sonnenfeld-Stiftung. RX støttes af BIH-Charité Clinician Scientist Program, finansieret af Charité -Universitätsmedizin Berlin og Berlin Institute of Health. Vi anerkender støtte fra den tyske forskningsfond (DFG) og Open Access Publication Fund of Charité - Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
- Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
- Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
- Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
- de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
- Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
- Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
- Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
- Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
- Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
- Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
- Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
- Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
- Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
- Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
- Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
- Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
- Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
- Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
- Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).
