Summary
Hier präsentieren wir ein standardisiertes SAH-Mausmodell, induziert durch endovaskuläre Filamentperforation, kombiniert mit Magnetresonanztomographie (MRT) 24 h nach der Operation, um die korrekte Blutungsstelle zu gewährleisten und andere relevante intrakranielle Pathologien auszuschließen.
Abstract
Das endovaskuläre Filamentperforationsmodell zur Nachahmung von Subarachnoidalblutungen (SAH) ist ein häufig verwendetes Modell - die Technik kann jedoch eine hohe Sterblichkeitsrate sowie ein unkontrollierbares Volumen von SAH und anderen intrakraniellen Komplikationen wie Schlaganfall oder intrakranielle Blutung verursachen. In diesem Protokoll wird ein standardisiertes SAH-Mausmodell vorgestellt, das durch endovaskuläre Filamentperforation induziert wird, kombiniert mit Magnetresonanztomographie (MRT) 24 Stunden nach der Operation, um die korrekte Blutungsstelle sicherzustellen und andere relevante intrakranielle Pathologien auszuschließen. Kurz gesagt, C57BL / 6J-Mäuse werden mit einer intraperitonealen Ketamin / Xylazin-Injektion (70 mg / 16 mg / kg Körpergewicht) betäubt und in Rückenlage gebracht. Nach dem Mittellinienhalsschnitt werden die gemeinsame Halsschlagader (CCA) und die Carotis-Bifurkation freigelegt, und eine 5-0 nicht resorbierbare monofile Polypropylennaht wird retrograd in die äußere Halsschlagader (ECA) eingeführt und in die gemeinsame Halsschlagader vorgeschoben. Dann wird das Filament in die innere Halsschlagader (ICA) eindringt und nach vorne gedrückt, um die vordere Hirnarterie (ACA) zu perforieren. Nach der Genesung von der Operation unterziehen sich die Mäuse 24 Stunden später einer 7,0-T-MRT. Das Blutungsvolumen kann über die postoperative MRT quantifiziert und abgestuft werden, was eine robuste experimentelle SAH-Gruppe mit der Möglichkeit ermöglicht, weitere Subgruppenanalysen basierend auf der Blutmenge durchzuführen.
Introduction
Die Subarachnoidalblutung (SAH) wird durch den Bruch eines intrakraniellen Aneurysmas verursacht und stellt einen lebensbedrohlichen Notfall dar, der mit einer erheblichen Morbidität und Mortalität verbunden ist und ca. 5% der Schlaganfälle ausmacht 1,2. SAH-Patienten mit starken Kopfschmerzen, neurologischen Funktionsstörungen und fortschreitenden Bewusstseinsstörungen3. Rund 30% der SAH-Patienten sterben innerhalb der ersten 30 Tage nach dem ersten Blutungsereignis4. Klinisch erleben 50% der Patienten eine verzögerte Hirnverletzung (DBI) nach einer frühen Hirnverletzung. DBI ist gekennzeichnet durch verzögerte zerebrale Ischämie und verzögerte neurologische Defizite. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die synergistischen Effekte mehrerer verschiedener Faktoren zum Verlust der neurologischen Funktion führen, einschließlich der Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, der Kontraktion kleiner Arterien, mikrozirkulatorischer Dysfunktion und Thrombose 5,6.
Ein einzigartiger Aspekt von SAH ist, dass die Pathogenese von einer extraparenchymalen Stelle ausgeht, dann aber zu schädlichen Kaskaden innerhalb des Parenchyms führt: Die Pathologie beginnt mit der Ansammlung von Blut im Subarachnoidalraum, die eine Vielzahl von intraparenchymalen Effekten auslöst, wie Neuroinflammation, neuronale und Endothelzellapoptose, kortikale Ausbreitungsdepolarisation und Hirnödembildung7, 8.
Die klinische Forschung ist durch mehrere Faktoren begrenzt, was das Tiermodell zu einem kritischen Element macht, um die pathomechanistischen Veränderungen der Krankheit konsistent und genau nachzuahmen. Verschiedene SAH-Modellprotokolle wurden vorgeschlagen, z.B. autologe Blutinjektion in die Cisterna magna (ACM). Auch eine modifizierte Methode mit einer doppelten Injektion von autologem Blut in die Cisterna magna und die optische Chiasmzisterne (APC) bzw. 9,10. Während die autologe Blutinjektion eine einfache Möglichkeit ist, den pathologischen Prozess des Vasospasmus und der Entzündungsreaktionen nach Subarachnoidalblutungen zu simulieren, ist der folgende Anstieg des intrakraniellen Drucks (ICP) relativ langsam, und es werden keine nennenswerten Veränderungen der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke induziert11,12. Eine andere Methode, die periarterielle Blutplatzierung, die normalerweise in großen SAH-Modellen (z. B. Affen und Hunden) verwendet wird, besteht darin, antikoaguliertes Eigenblut oder vergleichbare Blutprodukte um das Gefäß herum zu platzieren. Die Durchmesseränderungen der Arterie können mit einem Mikroskop beobachtet werden, das als Indikator für den zerebralen Vasospasmus nach SAH13 dient.
Barry et al. beschrieben erstmals 1979 ein endovaskuläres Perforationsmodell, bei dem die Arteria basilaris nach Entfernung des Schädels freigelegt wird; Die Arterie wird dann mit Wolfram-Mikroelektroden punktiert, wobei eine mikroskopische stereotaktische Technik14 verwendet wird. 1995 modifizierten Bederson und Veelken das Zea-Longa-Modell der zerebralen Ischämie und etablierten die endovaskuläre Perforation, die seit15,16 kontinuierlich verbessert wurde. Diese Methode basiert auf der Tatsache, dass Mäuse und Menschen ein ähnliches intrakranielles Gefäßnetzwerk teilen, das als Kreis von Willis bekannt ist.
Für die postoperative Auswertung und Einstufung von SAH im Mausmodell wurden verschiedene Ansätze vorgeschlagen. Sugawara et al. entwickelten eine Notenskala, die seit 2008 weit verbreitet ist17. Diese Methode bewertet den Schweregrad von SAH basierend auf morphologischen Veränderungen. Für diese Methode muss jedoch die Morphologie des Hirngewebes der Maus unter direkter Sicht untersucht werden, und daher muss die Maus für die Beurteilung geopfert werden. Darüber hinaus wurden mehrere Methoden zur Bestimmung des SAH-Schweregrads in vivo etabliert. Die Ansätze reichen von der einfachen neurologischen Bewertung über die Überwachung des intrakraniellen Drucks (ICP) bis hin zu verschiedenen radiologischen Bildgebungsverfahren. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die MRT-Einstufung ein neues, nicht-invasives Werkzeug zur Einstufung des SAH-Schweregrads ist, das mit dem neurologischen Score18,19 korreliert.
Hier wird ein Protokoll für ein SAH-Modell vorgestellt, das durch endovaskuläre Perforation verursacht wird, kombiniert mit postoperativer MRT. In einem Versuch, ein System zur Objektivierung der Blutungsmenge in einer In-vivo-Umgebung zu etablieren, entwickelten wir auch ein System zur SAH-Einstufung und Quantifizierung des Gesamtblutvolumens basierend auf einer hochauflösenden T2-gewichteten MRT von 7,0 T. Dieser Ansatz gewährleistet die korrekte Induktion von SAH und den Ausschluss anderer Pathologien wie Schlaganfall, Hydrocephalus oder intrazerebraler Blutung (ICH) und Komplikationen.
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Protocol
Die Experimente wurden nach den Richtlinien und Vorschriften des Landesamtes für Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlin, Deutschland (G0063/18), durchgeführt. In dieser Studie wurden C57Bl/6J männliche (8-12 Wochen alte) Mäuse mit einem Gewicht von 25 ± 0,286 g (durchschnittlich ± s.e.m.) verwendet.
1. Tierpräparation
- Induzieren Sie eine Anästhesie, indem Sie Ketamin (70 mg/kg) und Xylazin (16 mg/kg) intraperitoneal injizieren. Halten Sie eine normale Körpertemperatur aufrecht und tragen Sie zur schnellen Einführung einer tiefen Anästhesie bei. Testen Sie eine angemessene Sedierung mit einem Schmerzreiz, wie z. B. einer Zehenklemme, und überprüfen Sie das Fehlen einer Reaktion.
- Rasieren Sie vorsichtig die Nackenhaare der Maus mit einem Rasierer, reinigen Sie sie mit 70% Ethanol, gefolgt von Betadin / Chlorhexidin, und tragen Sie 1% Lidocain auf die Hautoberfläche zur lokalen Schmerzkontrolle auf.
- Stellen Sie die Maus in Rückenlage. Verwenden Sie Klebeband, um die Gliedmaßen und den Schwanz zu fixieren, und dehnen Sie die Haut des Halses sanft auf die gegenüberliegende Seite der Operation. Heben Sie gleichzeitig den Hals leicht an.
- Verwenden Sie Augensalbe (z. B. 5% Dexpanthenol), um eine Austrocknung der Augen während der Operation zu verhindern.
2. SAH-Induktion
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Bilder der Operationstechnik. (A) Darstellung der exponierten Anatomie der rechten Halsschlagader: Die CCA und ihre Verzweigung in ICA und ECA werden ebenso identifiziert wie die kleinen Zweige der ECA (OA und STA). (B) Die ECA wird aus dem umgebenden Gewebe mobilisiert und mit zwei Nähten ligiert, bevor sie geschnitten wird. Eine dritte Ligatur muss lose in der Nähe der Bifurkation platziert werden, ohne sie zu verschließen. (C) Die ICA und CCA werden vorübergehend (entweder mit Ligatur oder Clips) verschlossen, um übermäßige Blutungen zu verhindern, wenn die ECA sorgfältig eingeschnitten wird. D) Das Filament wird in den EuRH eingefügt und in das CCA aufgenommen. Die vorarrangierte Ligatur muss vorsichtig angezogen werden, damit kein Bluterguss auftritt, aber das Vorrücken des Filaments möglich bleibt. (E) Die ICA und CCA werden wieder geöffnet, und der ECA-Stumpf muss in eine Schädelrichtung angepasst werden. Durch Drücken des Filaments ~ 9 mm nach vorne in die ICA wird die ACA-MCA-Bifurkation erreicht, und das Gefäß wird dann perforiert, indem das Filament ~ 3 mm weiter gedrückt wird. (F) Das Filament wird zurückgezogen, nachdem eine zeitliche Religation des CCA sichergestellt wurde. Die vorab vereinbarte Ligatur der ECA wird schnell verschlossen, und die CCA wird wieder geöffnet, um eine Reperfusion zu ermöglichen. Abkürzungen: ACA = Arteria cerebralis anterior, CCA = gemeinsame Halsschlagader, ECA = Arteria carotis externe, MCA = mittlere Hirnarterie, ICA = Arteria carotis interna, OA = Arteria occipitalis, PPA = Arteria pterygopalatine, STA = Arteria thyreoidea superior. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Öffnen Sie die Halshaut mit einem sterilen Skalpell vom Kinn bis zum oberen Rand des Brustbeins (1,5 cm) und trennen Sie die Speicheldrüsen stumpf von ihrem umgebenden Bindegewebe.
- Trennen Sie die Muskelgruppe entlang einer Seite [in diesem Fall der rechten Seite] der Luftröhre und legen Sie die Scheide der gemeinsamen Halsschlagader (CCA) frei, die mit nährenden Blutgefäßen und Venolen bedeckt ist. Der CCA und der Vagusnerv befinden sich in unmittelbarer Nähe zueinander.
- Dissoziieren Sie die CCA und lassen Sie ein freies 8-0 Seidennaht um den CCA, ohne ihn vorher zu befestigen. Achten Sie auf den Schutz des Vagusnervs, da er leicht beschädigt wird (Abbildung 1A).
- Eine dreifache Verzweigung der CCA, der ICA und der ECA ist entlang des unteren hinteren Drittels der Diastase sichtbar. Sezieren Sie das distale Ende des ECA und ligrieren Sie das Gefäß doppelt so weit wie möglich.
- Trennen Sie die ECA in der Mitte des doppelt ligierten Segments, wodurch ein Gefäßstumpf entsteht.
- Ordnen Sie eine Ligatur für das Filament um den ECA-Stumpf vor, schließen Sie sie nicht bis zum erfolgreichen Einsetzen des Filaments.
- Verwenden Sie eine Naht oder einen Mikroclip, um die ICA und CCA vorübergehend zu verschließen (Abbildung 1B).
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (etwa die Hälfte des ECA-Durchmessers) in der ECA mit einer Mikrogefäßschere. Fügen Sie ein 5-0 (alternativ 4-0) Prolene-Filament in die ECA ein und schieben Sie es in die CCA.
- Schließen Sie die Ligatur auf der ECA leicht, während Sie den Mikroclip am ICA und CCA lösen (Abbildung 1C).
- Ziehen Sie das Filament vorsichtig zurück und stellen Sie den ECA-Stumpf in Schädelrichtung ein, wobei Sie das Filament durch die Bifurkation in die ICA eindringen (Abbildung 1D).
- Richten Sie die Filamentspitze medial in einem Winkel von ~30° zur trachealen Mittellinie und ~30° zur horizontalen Ebene. Schieben Sie das Filament im ICA nach vorne. Nach Erreichen der ACA-MCA-Bifurkation trifft man auf Widerstand (~9 mm).
- Schieben Sie das Filament 3 mm weiter vor, perforieren Sie den richtigen ACA. Ziehen Sie das Filament sofort in den ECA-Stumpf zurück, damit Blut in den Subarachnoidalraum fließen kann.
- Halten Sie das Filament etwa 10 s in dieser Position (Abbildung 1E). Das Vorhandensein von Muskelzittern, ipsilateraler Miose, Atemgassen, verändertem Herzrhythmus und Harninkontinenz kann ein Beweis für eine erfolgreiche Operation sein.
- Schließen Sie die CCA vorübergehend, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden. Ziehen Sie das Filament sofort heraus und ligiieren Sie die ECA mit der vorgefertigten Naht. Öffnen Sie die CCA erneut und lassen Sie die Reperfusion und den weiteren Erguss von Blut in den Subarachnoidalraum zu (Abbildung 1F).
- Nach der Überprüfung auf Blutungsleckagen desinfizieren Sie die Haut, die die Wunde umgibt, um postoperative Hautinfektionen zu verhindern, und nähen Sie die Wunde mit einer nicht resorbierbaren 4-0-Polyesterfasernaht.
- Legen Sie die Maus in eine Thermobox, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Warten Sie, bis das Tier vollständig wach ist, und stellen Sie sicher, dass es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Geben Sie die Tiere erst dann in die Gesellschaft anderer Mäuse zurück, wenn sie vollständig genesen sind.
- Verabreichen Sie 200-300 mg / kg Körpergewicht Paracetamol zur postoperativen Schmerzlinderung.
- Überprüfen Sie die Mäuse täglich nach der Operation.
3. MRT-Messung
- Führen Sie 24 Stunden nach der Operation eine MRT mit einem Nagetierscanner (Table of Materials) und einem speziellen Mauskopfresonator durch - hier wurde ein 20 mm Sende- / Empfangsquadraturvolumenresonator verwendet.
- Legen Sie die Maus auf eine beheizte Umlaufwasserdecke, um eine konstante Körpertemperatur von ~37 °C zu gewährleisten. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 2,5 % Isofluran in einem O2/N2O-Gemisch (30 %/70 %) und halten Sie mit 1,5-2 % Isofluran über Gesichtsmaske unter kontinuierlicher Beatmungsüberwachung aufrecht.
- Führen Sie zunächst einen schnellen Referenzscan durch, indem Sie 3 orthogonale Slice-Pakete erfassen (Tri-Pilot-Multi, FLASH mit Wiederholungszeit TR/Echo-Zeit TE = 200 ms/3 ms, 1 Durchschnitt, Flip-Winkel FA = 30°, Sichtfeld FOV = 28 mm x 28 mm, Matrix MTX = 256 x 256, Schichtdicke 1 mm, Gesamterfassungszeit TA = 30 s).
- Verwenden Sie dann eine hochauflösende T2-gewichtete 2D-Turbo-Spin-Echo-Sequenz für die Bildgebung (Bildgebungsparameter TR/TE = 5505 ms/36 ms, RARE-Faktor 8, 6 Mittelwerte, 46 zusammenhängende axiale Scheiben mit einer Schichtdicke von 0,35 mm, um das gesamte Gehirn abzudecken, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 min).
- Wenn das Ergebnis unklar ist, verwenden Sie eine zusätzliche durch Atmung ausgelöste T2*-gewichtete Gradientenechosequenz mit dem gleichen Isoabstand wie der T2w-Scan (2D-BLITZ, TR/TE = 600 ms/6,3 ms, FA = 30°, 1 Durchschnitt, 20 axiale Scheiben mit 0,35 mm Dicke, FOV und MTX identisch mit T2w, TA = 5-10 min je nach Atemfrequenz).
- Übertragen Sie die Daten in das DICOM-Bildformat und verwenden Sie die ImageJ-Software für die SAH-Sortierung und Volumetrie von Blutgerinnseln. Details zur Quantifizierung sind als Schritt-für-Schritt-Anleitung im Ergänzungsmaterial aufgeführt (Ergänzende Abbildung 1).
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Representative Results
Sterblichkeit
Für diese Studie wurden insgesamt 92 männliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen einer SAH-Operation unterzogen; In diesen beobachteten wir eine Gesamtsterblichkeitsrate von 11,9% (n = 12). Die Mortalität trat ausschließlich innerhalb der ersten 6-24 Stunden nach der Operation auf, was auf die perioperative Mortalität sowie die SAH-Blutung selbst als die wahrscheinlichsten beitragenden Faktoren hindeutet.
SAH Blutungsgrad
Insgesamt 50 Mäuse erhielten eine MRT 24 h postoperativ, um SAH zu bestätigen und die Erkennung anderer gleichzeitig auftretender Pathologien, einschließlich subakutem ischämischem Schlaganfall und Hydrocephalus, sicherzustellen. Die verbleibenden Tiere wurden für frühere Scans verwendet, um die geeignete Zeit für die postoperative MRT auszuwählen. Unter den 50 untersuchten Mäusen zum 24-Stunden-Zeitpunkt waren n = 7 Tiere, die keine SAH (Blutungsgrad 0) aufwiesen, und n = 5 Mäuse, bei denen ein zusätzlicher Schlaganfall und/oder ICH (Blutungsgrad IV) nachgewiesen wurde. Der SAH-Blutungsgrad wurde basierend auf T2-gewichteten MRT-Scans wie folgt quantifiziert (Abbildung 2A,B):
Grad 0: keine SAH oder Blutung festgestellt (14%)
Klasse I: SAH-Dicke ≤0,80 mm (24%)
Klasse II: SAH-Dicke >0,8 und <1,6 mm (28%)
Klasse III: SAH-Dicke ≥1,6 mm (24%)
Grad IV: SAH mit ICH und/oder Schlaganfall (10%).
Abbildung 2: SAH-Bewertungssystem mit entsprechendem Blutvolumen und MRT-Bildern. (A) T2-gewichtete MRT-axiale Schnitte, die repräsentative Bilder zur Kategorisierung der SAH-Qualität darstellen. Grad 0: keine SAH oder Blutung festgestellt (14%); Klasse I: SAH-Dicke ≤0,80 mm; Klasse II: SAH-Dicke >0,8 und <1,6 mm; Klasse III: SAH-Dicke ≥1,6 mm; Grad IV: SAH mit entweder ICH und/oder Schlaganfall. (B) Kreisdiagramm, das die Verteilung des SAH-Grades bei den Versuchsmäusen zeigt. (C,E) Berechnetes SAH-Blutungsvolumen basierend auf der Formel V = A 1 + A 2 + ... + Ax) · d, wobei die Blutungsfläche über ImageJ auf jedem Objektträgerabschnitt bestimmt wird und die Summe aller Blutungsbereiche mit der entsprechenden MRT-Objektträgerdicke multipliziert wird. (D) Gesamtblutungsvolumen jeder SAH-Qualität auf der Grundlage der Kothari abc/2-Volumenschätzung. Die Werte werden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. Abkürzungen: ICH = intrazerebrale Blutung, MRT = Magnetresonanztomographie. Maßstabsleiste = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Blutungsvolumen
Für Grad I-III wurde das Blutungsvolumen mit zwei verschiedenen Methoden quantifiziert:
Methode A: Das Gesamtvolumen der Blutung wurde auf der Grundlage der abc/2-Volumenschätzung von Kathari et al. berechnet, einer Modifikation der Gleichung für das Ellipsoidvolumen, die im klinischen Umfeld häufig zur Schätzung des ICH-Volumens verwendet wurde (Abbildung 2D)20.
Methode B: Das berechnete SAH-Blutungsvolumen wurde auf der Grundlage der Formel V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) geschätzt · d, wobei die Blutungsfläche über ImageJ auf jedem Objektträgerabschnitt bestimmt und die Summe aller Blutungsbereiche mit der entsprechenden MRT-Objektträgerdicke multipliziert wurde ('A i' entspricht der Blutungsfläche auf Scheibe 'i', 'x' ist die Gesamtzahl der Scheiben, 'd' entspricht der Schichtdicke). Diese Methode berücksichtigte die Unregelmäßigkeit der Form (Abbildung 2C,E). Erwartungsgemäß zeigte Methode B in jeder Untergruppe einen größeren Wertebereich. Beide Verfahren zeigten jedoch einen signifikanten Unterschied in den entsprechenden Entlüftungsgraden, die auf der axialen SAH-Dicke basierten und im folgenden Absatz beschrieben werden. Ergänzende Abbildung 2 zeigt den SAH-Band aller Untergruppen; Erwartungsgemäß war Grad IV heterogener Natur, da er auch gleichzeitig auftretende ICH enthielt.
Statistische Auswertung und Zahlen
Die Daten wurden mit GraphPad Prism für statistische Analysen analysiert. Einweg-ANOVA-Analysen wurden verwendet, um mehrere Gruppen zu vergleichen. Die Werte werden als Mittelwerte ± Standardfehlern angezeigt und p-Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Elemente von Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden unter Verwendung von BioRender.com zusammengesetzt.
Ergänzende Abbildung 1: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Quantifizierung des Beschnittvolumens mit ImageJ. Importieren Sie die Bilder mit ImageJ und geben Sie "Strg+I" ein, um die Dimensionsdaten anzuzeigen. Stellen Sie dann den Maßstab für das Bild ein. Identifizieren Sie alle Bilder, in denen SAH zu sehen ist. Für Methode A identifizieren Sie die Scheibe mit der größten Blutungsfläche und messen die kraniokaudale Länge (=a) sowie die mediolaterale Länge (=b) der beiden orthogonalen Achsen, die das ellipsoide SAH-Volumen überspannen. Die ventrodorsale Dimension (=c) der Ellipsoidform kann basierend auf der Schichtdicke und der Anzahl der Scheiben, auf denen SAH zu sehen ist, geschätzt werden [c = Schichtdicke x Anzahl der Scheiben]. Berechnen Sie das Volumen basierend auf der Formel:V= abc/2. Für Methode B messen Sie die Blutungsbereiche auf jeder Scheibe separat und berechnen Sie dann das Volumen basierend auf der Formel: V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) · d, wobei d= Scheibendicke ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Blutungsvolumen aller Untergruppen. (A) Blutungsvolumen (mm3) in jeder Untergruppe basierend auf Methode A unter Verwendung der Formel V= abc/2. (B) Blutungsvolumen (mm3) der entsprechenden Untergruppen nach Methode B (Formel V = (A 1 + A 2 + ... + Ax) · d; d= Scheibendicke). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein standardisiertes SAH-Mausmodell, das durch endovaskuläre Filamentperforationsoperationen induziert wird, mit geringer Invasion, kurzer Operationszeit und akzeptablen Mortalitätsraten präsentiert wird. Die MRT wird 24 h postoperativ durchgeführt, um die korrekte Blutungsstelle und den Ausschluss anderer relevanter intrakranieller Pathologien zu gewährleisten. Darüber hinaus klassifizierten wir verschiedene SAH-Blutungsgrade und maßen Blutungsvolumina, was weitere Subgruppenanalysen basierend auf dem Blutungsgrad ermöglichte.
Eine ausreichende Positionierung der Maus beeinflusst den Erfolg der richtigen Perforation. Der Hals der Maus sollte leicht auf die gegenüberliegende Seite der Operation gestreckt werden, wobei der Kopf leicht angehoben sein sollte. Dies legt die Trifurkation frei und macht den Einstichweg leichter zugänglich. Wenn das Vorrücken des Filaments fehlschlägt, kann es hilfreich sein, das Filament leicht in die Trifurkation zurückzuziehen und die Position des Kopfes anzupassen, bis ein Vorrücken ohne Widerstand möglich ist.
Der intraoperative Nervenschutz ist entscheidend. Störungen des Vagusnervs und des Plexus cervicalis können Veränderungen des Atem- und Herzrhythmus verursachen, und einige Mäuse können sogar aufgrund von malignen Arrhythmien sterben. Wenn diese Symptome auftreten, ist es wichtig, den Eingriff für einige Minuten zu unterbrechen, bis sich die Atmung und die Herzfrequenz stabilisiert haben.
Die Verringerung des intraoperativen Blutverlustes ist entscheidend für die Verbesserung des Überlebens von Mäusen. Basierend auf unserer Erfahrung wird die doppelte Nahtligatur am besten in der Nähe der ECA angewendet. Wir trennen die ECA in der Mitte der beiden Ligaturen, um einen Blutrückfluss aus dem distalen ECA-Stumpf zu verhindern. Wenn das Filament in die ECA eingeführt wird, sollte die vorarrangierte Naht ligiert werden, um einen Bluterguss aus dem Schnitt zu verhindern. Es ist wichtig, das Gefäß nicht zu fest zu verfilzen, da dies eine ordnungsgemäße Filamentvorschub behindert.
Eine angemessene Tiefe der Filamenteinführung ist für eine erfolgreiche SAH-Induktion unerlässlich. Aufgrund des Alters der verwendeten Mäuse (8-12 Wochen) führen wir das Filament ~ 9 mm in den ICA ein und stoppen, wenn Widerstand auftritt, und fahren dann ~ 3 mm weiter für die Perforation vor. Das Einführen des Filaments, das nicht tief genug ist, könnte zu einer unzureichenden Perforation führen, was zu keiner SAH führen kann, während ein übermäßiges Einführen zu Schlaganfall und/oder ICH führen kann (Abbildung 3). Gleichzeitig müssen die ursprünglichen Anatomie und Gefäßstrukturen der Mäuse während der Operation so gut wie möglich erhalten bleiben. Zum Beispiel sollten die Arteria occipitalis (OA) oder die obere Schilddrüsenarterie (STA) und die nährenden Blutgefäße auf der Scheide so weit wie möglich erhalten bleiben.
Abbildung 3: Anatomie des Maushirns und makroskopische Bilder von SAH. (A) Schematische vaskuläre Anatomie der Maus, die den Ort der Filamentperforation zeigt. (B) Klassisches makroskopisches Bild der erfolgreichen Induktion von SAH. Vor der Entfernung des Gehirns wurde eine Perfusion von 1x PBS durchgeführt. (C) Makroskopische Ansicht der Maus, bei der das Filament zu tief gedrückt wurde, was zu ICH führte. Abkürzungen: ACA = Arteria cerebralis anterior, ECA = Arteria carotis externe, CCA = gemeinsame Halsschlagader, ICA = Arteria carotis interna, ICH = intrazerebrale Blutung, L = links, MCA = Arteria cerebralis middle, PPA = Arteria pterygopalatine, R = rechts. Maßstabsleiste = 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das endovaskuläre Perforationsmodell ist ein häufig verwendetes Tiermodell zur Untersuchung von SAH, aber die Mittel zur Sicherstellung des Blutungsgrades und zum Ausschluss anderer Pathologien wie Schlaganfall oder intrazerebraler Blutung sind in der Literatur nicht ausreichend standardisiert21. Wie bei jedem operativen Tiermodell hängen die Erfolgsrate und Robustheit der SAH-Induktion von der Erfahrung des Chirurgen ab.
Derzeit ist das endovaskuläre Perforationsmodell eine der beliebtesten Methoden der experimentellen SAH-Induktion bei Mäusen. Dieser Ansatz erfordert keine Kraniotomie und ähnelt genau den Prozessen, die bei Menschen ablaufen, die an einem aneurysmatischen SAH22 leiden. Zu den Vorteilen gehört die enge Nachahmung der Pathophysiologie nach aneurysmatischer SAH in Bezug auf akute und verzögerte Reaktionen23. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Mortalitätsraten in diesem Modell denen klinischer Studien bei Patienten mit aneurysmaler SAH23 ähnlich sind. Im Vergleich zu Blutinjektionsmodellen werden Veränderungen der Blut-Hirn-Schrankenpermeabilität genauer nachgeahmt, und bei der Filamentperforation werden höhere Vasospasmusraten erreicht11,24. Blutinjektionsmodelle sind invasiver und stellen daher im Vergleich zum weniger invasiven endovaskulären Perforationsmodell ein höheres Risiko für Gewebeschäden dar. Dennoch ist zu beachten, dass ein großer Vorteil von Blutinjektionsmethoden das leicht kontrollierbare Blutvolumen23 ist. Die Standardisierung der Einspritzgeschwindigkeit ist wichtig zu berücksichtigen, da Änderungen des ICP stark von der Injektionsgeschwindigkeit23 abhängen. Abgesehen von diesen klassischen Modellen stellt die Kombination von Elastase-Injektion zur Induktion von Aneurysmabildung und Bluthochdruck durch einseitige Nephrektomie, die letztendlich zu einer Aneurysmaruptur führt, ein interessantes Modell zur Untersuchung von Subarachnoidalblutungen in einer pathophysiologisch realistischeren Umgebungdar 25. Die Integration solcher Techniken mit gentechnisch veränderten Mäusen wird für zukünftige Studien von Interesse sein.
Bisherige SAH-Bewertungssysteme für das Filamentperforationsmodell basieren auf der Menge an sichtbarem Subarachnoidalblut in verschiedenen Gehirnsegmenten, nachdem die Maus geopfert wurde17. Folglich erlauben diese Bewertungssysteme keine Langzeitstudien, wenn das Blut zum Zeitpunkt der Verkrippung bereits resorbiert wurde. Im klinischen Umfeld wird SAH basierend auf dem klinischen Erscheinungsbild sowie der SAH-Dicke in der Bildgebung bewertet, was dem klinischen Ergebnis 1,26,27,28 entspricht. In einem Versuch zur nichtinvasiven Klassifizierung der Blutungsschwere haben wir daher eine standardisierte MRT-Follow-up-Untersuchung hinzugefügt, um SAH röntgenografisch zu bewerten, wobei die Einstufung auf bereits vorhandenen menschlichen Bewertungsskalen basierte, wobei das Bewertungssystem eines zuvor veröffentlichten MRT-Bewertungssystems bei SAH-Mäusen von Egashira et al.18 angepasst wurde. Dieser Ansatz gewährleistet auch die Quantifizierung des Gesamtblutvolumens und den Ausschluss von Tieren mit anderen gleichzeitig auftretenden intrakraniellen Pathologien (z. B. Schlaganfall, ICH, Hydrocephalus). Einige Studien schlugen intrakraniellen Druck (ICP), zerebrale Perfusion und Blutdrucküberwachung als Beweis für eine erfolgreiche SAH-Induktion vor, was zusätzliche hilfreiche Werkzeuge sein könnten29. Indirekte Möglichkeiten, den Schweregrad von SAH und potenziellen intraparenchymalen Schäden zu bewerten, umfassen die Kombination klinischer Befunde mit histologischen Färbungen für Zelltodmarker wie p53, TUNEL oder Caspase-3. Diese indirekten Werkzeuge wie die ICP-Überwachung sowie die neurologischen unterscheiden jedoch möglicherweise nicht genau zwischen anderen Pathologien wie Schlaganfall, intrakraniellen Blutungen oder Hydrocephalus. Trotz der Vorteile der MRT-Einstufung gibt es einen großen Nachteil dieses Ansatzes in Bezug auf seine Machbarkeit: Die MRT ist für Labore nicht so weit verbreitet wie andere Methoden. Dies schränkt die breite Einführung von MRT-Bewertungssystemen in der experimentellen SAW ein. Wenn verfügbar, fügt das vorgestellte MRT-Bewertungssystem jedoch ein Werkzeug zur Standardisierung experimenteller SAH-Modelle hinzu, wodurch die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Experimenteerleichtert wird 23. In dieser Studie gab es trotz beobachteter klinischer Veränderungen während der Operation immer noch eine Rate von 14% an Mäusen ohne Hinweise auf SAH im postoperativen MRT. Möglicherweise litten Mäuse in dieser Untergruppe an Mikroblutungen, die im MRT nicht nachweisbar waren (ähnlich wie SAH-Patienten mit negativem CT, aber dem Vorhandensein von Xanthochromie bei der Lumbalpunktion). Diese Mäuse wurden in diesem Versuchsaufbau für weitere Analysen ausgeschlossen. Der technische Grund für diese "No-Bleeds" bei der MRT könnte eine unzureichende Filamentinsertion sein, die zu keiner Perforation führt (z. B. durch falsche Platzierung in OA oder Pterygopalatine Arterie (PPA)). Darüber hinaus kann sich das erfolgreich perforierte Gefäß nach dem Zurückziehen des Filaments wieder schließen, wodurch SAH verhindert wird.
Zusammenfassend wird ein standardisiertes Modell für experimentelle aneurysmatische SAH durch endovaskuläre Perforation vorgestellt, kombiniert mit MR-Bildgebung 24 h nach der Operation, um die Blutung zu bestätigen und zu bewerten und andere relevante intrakranielle Pathologien auszuschließen.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte
Acknowledgments
SL wurde vom Chinese Scholarship Council unterstützt. KT wurde durch das BIH-MD-Stipendium des Berliner Instituts für Gesundheitsforschung und der Sonnenfeld-Stiftung gefördert. RX wird durch das BIH-Charité Clinician Scientist Program gefördert, das von der Charité-Universitätsmedizin Berlin und dem Berliner Institut für Gesundheitsforschung gefördert wird. Wir bedanken uns für die Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und des Open-Access-Publikationsfonds der Charité - Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
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