Summary
这里我们提出了一个标准化的SAH小鼠模型，由血管内丝穿孔诱导，术后24小时结合磁共振成像（MRI），以确保正确的出血部位并排除其他相关的颅内病变。
Abstract
模仿蛛网膜下腔出血（SAH）的血管内丝穿孔模型是一种常用的模型 - 然而，该技术可导致高死亡率以及无法控制的SAH体积和其他颅内并发症，如中风或颅内出血。在该协议中，提出了由血管内丝穿孔诱导的标准化SAH小鼠模型，并在手术后24小时结合磁共振成像（MRI）以确保正确的出血部位并排除其他相关的颅内病变。简而言之，用腹腔内氯胺酮/ 甲苯噻嗪（70mg / 16mg / kg体重）注射液麻醉C57BL / 6J小鼠并置于仰卧位。中线颈部切口后，暴露颈总动脉（CCA）和颈动脉分叉，以逆行方式将5-0不可吸收的单丝聚丙烯缝合线插入颈外动脉（ECA）并推进到颈总动脉。然后，将细丝插入颈内动脉 （ICA） 并向前推入脑前动脉 （ACA）。手术恢复后，小鼠在24小时后接受7.0 T MRI。出血量可以通过术后MRI进行量化和分级，从而实现强大的实验性SAH组，并可选择根据血量进行进一步的亚组分析。
Introduction
蛛网膜下腔出血 （SAH） 是由颅内动脉瘤破裂引起的，可构成危及生命的急症，与大量发病率和死亡率相关，约占卒中1，2 的 5%。SAH 患者表现为严重头痛、神经功能障碍和进行性意识障碍3.大约30%的SAH患者在初始出血事件4之后的前30天内死亡。临床上，50% 的患者在早期脑损伤后出现延迟性脑损伤 （DBI）。DBI 的特征是脑缺血延迟和神经功能缺损延迟。目前的研究表明，几种不同因素的协同作用导致神经功能丧失，包括血脑屏障的破坏，小动脉的收缩，微循环功能障碍和血栓形成5，6。
SAH的一个独特方面是发病机制起源于实质外位置，但随后导致实质内有害的级联反应：病理学始于蛛网膜下腔内血液的积聚，引发多种实质内效应，例如神经炎症，神经元和内皮细胞凋亡，皮质扩散去极化和脑水肿形成7，8.
临床研究受到几个因素的限制，这使得动物模型成为一致和准确地模仿疾病病理变化的关键因素。已经提出了不同的SAH模型方案，例如，将自体血液注射到大水箱（ACM）中。此外，改良方法将自体血液分别注射到大水箱和视交叉水箱（APC）中9，10。虽然自体血液注射是模拟蛛网膜下腔出血后血管痉挛和炎症反应病理过程的简单方法，但随后颅内压（ICP）的升高相对较慢，并且没有诱导血脑屏障通透性显着变化11，12。另一种方法，动脉周围血液放置，通常用于大型SAH模型（例如，猴子和狗），涉及在血管周围放置抗凝自体血液或类似的血液制品。可以用显微镜观察动脉的直径变化，作为SAH13后脑血管痉挛的指标。
Barry等人于1979年首次描述了血管内穿孔模型，其中基底动脉在取出颅骨后暴露;然后用钨微电极刺穿动脉，使用微观立体定向技术14。1995年，Bederson和Veelken修改了脑缺血的Zea-Longa模型，建立了血管内穿孔，自15，16以来一直在不断改进。这种方法是基于这样一个事实，即小鼠和人类共享一个相似的颅内血管网络，称为威利斯的圆圈。
对于小鼠模型中SAH的术后评估和分级，已经提出了不同的方法。Sugawara等人开发了一种自2008年以来被广泛使用的分级量表17。该方法根据形态学变化评估SAH的严重程度。然而，对于这种方法，必须在直接视觉下检查小鼠的脑组织形态，因此，必须牺牲小鼠进行评估。此外，已经建立了几种测定体内SAH严重程度 的方法 。方法范围从简单的神经学评分到颅内压监测（ICP），再到各种放射成像技术。此外，MRI 分级已被证明是一种新的非侵入性工具，用于对 SAH 严重程度进行分级，与神经系统评分18，19 相关。
在这里，提出了由血管内穿孔引起的SAH模型的方案，并结合术后MRI。为了建立一个系统来客观化 体内 出血量，我们还开发了一个基于7.0 T高分辨率T2加权MRI的总血容量SAH分级和定量的系统。这种方法可确保正确诱导 SAH 并排除其他病症，如卒中、脑积水或脑出血 （ICH） 和并发症。
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Protocol
实验是根据德国柏林的Landesamt fuer Gesundheit und Soziales（LaGeSo）制定的指南和法规进行的（G0063/18）。在这项研究中，使用了C57Bl / 6J雄性（8-12周龄）小鼠，体重为25±0.286克（平均±s.e.m.）。
1. 动物准备
- 腹腔注射氯胺酮（70mg / kg）和甲苯噻嗪（16mg / kg）诱导麻醉。保持正常的体温，有助于快速诱导深度麻醉。通过疼痛刺激（例如脚趾捏合）测试足够的镇静剂，并验证是否没有反应。
- 用剃须刀小心地剃掉小鼠的颈部毛发，用70%乙醇清洁，然后用betadine/氯己定清洁，并在皮肤表面涂抹1%利多卡因以控制局部疼痛。
- 将鼠标置于仰卧位。用胶带固定四肢和尾巴，轻轻地将颈部皮肤拉伸到手术的另一侧。同时，稍微抬高颈部。
- 使用眼药软膏（例如，5%右泛醇）以防止手术过程中眼睛脱水。
2. 电磁超声抗原感应
图1：手术技术的分步图像。（A）暴露的右颈动脉解剖结构的描述：识别CCA及其分叉为ICA和ECA，以及ECA的小分支（OA和STA）。（B） 非洲经委会从周围组织中动员起来，在切割之前用两根缝线连接。第三个结扎需要松散地放置在分叉附近，而不会阻塞它。（C）当ECA被仔细切开时，ICA和CCA被暂时闭塞（用结扎或夹子），以防止ECA过度出血。（D） 将长丝插入非洲经委会并推进到共同国家评估中。必须仔细收紧预先安排的结扎，以免发生血液积液，但仍可推进细丝。（E） 重新开放ICA和CCA，非洲经委会的残端需要调整到颅骨方向。通过将灯丝向前推~9mm进入ICA，将达到ACA-MCA分岔，然后通过将灯丝进一步推约3mm来穿孔容器。（F）在确保CCA的时间再连接后，将细丝取出。ECA的预先排列的结扎很快被阻塞，并且CCA被重新打开以允许再灌注。缩写：ACA =脑前动脉，CCA =颈总动脉，ECA =颈外动脉，MCA =大脑中动脉，ICA =颈内动脉，OA =枕动脉，PPA =翼腭动脉，STA =甲状腺上动脉。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看此图的大图。
- 用无菌手术刀打开颈部皮肤，从下巴到胸骨上边缘（1.5厘米），并钝地将唾液腺与周围的结缔组织分开。
- 沿着气管的一侧（在这种情况下是右侧）分离肌肉群，暴露出覆盖着滋养血管和小静脉的颈总动脉（CCA）鞘。CCA和迷走神经彼此靠近。
- 解散CCA并留下免费的8-0CCA周围的丝绸缝合线，无需提前将其绑扎。注意迷走神经的保护，因为它很容易受损（图1A）。
- CCA、ICA 和 ECA 的三重分岔在透析的下三分之一处可见。解剖 ECA 的远端，并尽可能远地将血管铰接两倍。
- 在两次连接段的中点断开 ECA，形成血管残端。
- 在ECA残端周围预先安排一根细丝结扎，在成功插入细丝之前不要关闭它。
- 使用缝合线或微夹暂时遮挡ICA和CCA（图1B）。
- 使用微血管剪刀在ECA中做一个小切口（大约是ECA直径的一半）。将5-0（或4-0）prolene长丝插入ECA并将其推进到CCA中。
- 稍微关闭ECA上的连字，同时松开ICA和CCA上的微夹（图1C）。
- 轻轻拉回牙丝，在颅方向上调整ECA残端，将细丝通过分叉进入ICA（图1D）。
- 将灯丝尖端向内侧指向气管中线约 30°，与水平面成 ~30° 角。在 ICA 内向前推灯丝。到达ACA-MCA分岔后，遇到阻力（~9 mm）。
- 将灯丝进一步推进 3 mm，穿孔正确的 ACA。立即将细丝抽取到 ECA 残端，让血液流入蛛网膜下腔。
- 将灯丝保持在此位置约10秒（图1E）。肌肉震颤、同侧瞳孔缩小、气喘吁吁、心律改变和尿失禁的存在可能是手术成功的支持证据。
- 暂时关闭CCA以避免过量失血。立即拔出灯丝，并用预先安排的缝合线连接ECA。重新打开CCA并允许再灌注和进一步将血液积液到蛛网膜下腔（图1F）。
- 检查出血泄漏后，对伤口周围的皮肤进行消毒，以防止术后皮肤感染，并用不可吸收的4-0聚酯纤维缝合线缝合伤口。
- 将鼠标放在热盒中，直到恢复意识。等到动物完全清醒，并确保它恢复了足够的意识来维持胸骨卧位。在完全恢复之前，不要将动物送回其他小鼠的陪伴下。
- 给予200-300mg体重对乙酰氨基酚用于术后疼痛缓解。
- 手术后每天检查小鼠。
3. 核磁共振测量
- 手术后24小时，使用啮齿动物扫描仪（材料表）和专用的小鼠头谐振器进行MRI - 这里使用20 mm发射/接收正交体积谐振器。
- 将小鼠放在加热的循环水毯上，以确保体温恒定至〜37°C。 在 O2/N2O 混合物 （30%/70%） 中用 2.5% 异氟醚诱导麻醉，并在连续通气监测下通过面罩维持 1.5-2% 异氟醚。
- 首先执行快速参考扫描，采集 3 个正交切片包（Tri-Pilot-Multi，重复时间 TR/回波时间 TE = 200 ms/3 ms 的 FLASH，1 个平均值，翻转角度 FA = 30°，视场 FOV = 28 mm x 28 mm，矩阵 MTX = 256 x 256，切片厚度 1 mm，总采集时间 TA = 30 s）。
- 然后使用高分辨率T2加权2D涡轮自旋回波序列进行成像（成像参数TR / TE = 5505 ms / 36 ms，RARE因子8，6平均值，46个连续轴向切片，切片厚度为0.35 mm以覆盖整个大脑，FOV = 25.6 mm x 25.6 mm，MTX = 256 x 256，TA = 13分钟）。
- 如果结果不清楚，请使用额外的呼吸触发T2 *加权梯度回波序列，其等高度与T2w扫描相同（2D FLASH，TR / TE = 600 ms / 6.3 ms，FA = 30°，1个平均，20个轴向切片，厚度为0.35 mm，FOV和MTX与T2w相同，TA = 5-10分钟，具体取决于呼吸速率）。
- 将数据转换为DICOM图像格式，并使用ImageJ软件进行血凝块的SAH分级和体积测定。有关定量的详细信息在补充材料中被列为分步指南（补充图1）。
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Representative Results
死亡率
对于这项研究，共有92只年龄在8-12周之间的雄性C57Bl / 6J小鼠接受SAH手术;在这些中，我们观察到总死亡率为11.9%（n = 12）。死亡率仅发生在手术后的前6-24小时内，表明围手术期死亡率以及SAH出血本身是最可能的促成因素。
SAH出血等级
共有50只小鼠在术后24小时接受MRI以确认SAH并确保检测其他共同发生的病症，包括亚急性缺血性中风和脑积水。其余的动物用于早期扫描，以选择术后MRI的足够时间。在24小时时间点检查的50只小鼠中，n = 7只未出现SAH（出血等级0）的动物和n = 5只检测到额外中风和/或ICH（出血等级IV）的小鼠。根据T2加权MRI扫描对SAH出血分级进行量化，如下所示（图2A，B）：
0 级：未发现 SAH 或出血 （14%）
I 级：SAH 厚度 ≤0.80 毫米 （24%）
II级：SAH厚度>0.8和<1.6毫米（28%）
III级：SAH厚度≥1.6毫米（24%）
IV 级：伴有 ICH 和/或卒中 （10%）的 SAH。
图 2：SAH 分级系统，具有相应的血容量和 MRI 图像。（A） T2 加权 MRI 轴向切片描绘了对 SAH 分级进行分类的代表性图像。0级：未发现SAH或出血（14%）;I级：SAH厚度≤0.80毫米;II级：SAH厚度>0.8和<1.6毫米;III级：SAH厚度≥1.6毫米;IV 级：SAH 伴有 ICH 和/或卒中。（B）饼图显示SAH等级在实验小鼠中的分布。（C，E）根据公式V = A1 + A 2 + ... + Ax） 计算出的SAH出血量·d，通过ImageJ确定每个载玻片上的出血区域，并将所有出血区域的总和乘以相应的MRI载玻片厚度。（D） 基于 Kothari abc/2 体积估计的每种 SAH 等级的总出血量。缩写：ICH = 脑出血，MRI = 磁共振成像。 ±比例尺 = 5 mm。请点击此处查看此图的大图。
出血量
对于I-III级，出血量通过两种不同的方法量化：
方法A：根据Kathari等人的abc/2体积估计计算总出血量，这是对椭圆体体积方程的修改，该方程在临床环境中被广泛用于估计ICH体积（图2D）20。
方法B：根据公式V = （A1 + A 2 + ... + Ax）估计计算的SAH出血量·d，通过ImageJ确定每个载玻片上的出血区域，并将所有出血区域的总和乘以相应的MRI载玻片厚度（“Ai”对应于切片“i”上的出血区域，“x”是切片总数，“d”对应于切片厚度）。这种方法考虑了形状的不规则性（图2C，E）。预计，方法B在每个子组中显示更大的值范围。然而，这两种方法都显示出基于轴向SAH厚度的相应出血等级的显着差异，并在以下段落中进行了描述。 补充图2显示了所有子组的SAH体积;预计，IV级具有异质性，因为它也含有共同发生的ICH。
统计分析和数字
使用GraphPad Prism对数据进行分析以进行统计分析。单因素方差分析用于比较多个组。这些值显示为标准误差±均值，p < 0.05 的 p 值被认为具有统计显著性。 图1和 图2的元素是使用 BioRender.com 组成的。
补充图1：使用ImageJ量化出血量的分步指南。 使用 ImageJ 导入图像，然后输入“Strg+I”以显示尺寸数据。然后设置图像的比例。识别可以看到 SAH 的所有图像。对于方法A，确定出血面积最大的切片，并测量跨越椭球体SAH体积的两个正交轴的颅尾长度（= a） 以及中外长 （=b ）。椭圆体形状的腹侧尺寸 （=c） 可以根据切片厚度和可见SAH的切片数量[c = 切片厚度x切片数]来估计。根据公式计算体积：V= abc/2。 对于方法B，分别测量每个切片上的出血区域，然后根据公式计算体积： V = （A1 + A2 + ... + Ax） · d，通过它 d= 切片厚度。 请点击此处下载此文件。
补充图2：所有亚组的出血量。（A）基于方法A的每个亚组的出血量（mm3），使用公式V = abc / 2。（B） 使用方法 B（公式 V = （A1 + A 2 + ... + Ax） 的相应亚组的出血量 （mm3） ·d;d = 切片厚度）。请点击此处下载此文件。
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Discussion
综上所述，血管内丝穿孔操作诱导的标准化SAH小鼠模型具有轻微的浸润，手术时间短和可接受的死亡率。术后24小时进行MRI，以确保正确的出血部位并排除其他相关的颅内病变。此外，我们对不同的SAH出血等级进行了分类并测量了出血量，从而可以根据出血等级进行进一步的亚组分析。
鼠标的充分定位会影响正确穿孔的成功。小鼠的脖子应略微伸展到手术的另一侧，头部略微抬高。这暴露了三叉，使穿刺路径更容易接近。如果灯丝的推进失败，将灯丝稍微拉到三叉并调整头部的位置，直到没有任何阻力即可前进是有帮助的。
术中神经保护至关重要。迷走神经和颈丛的紊乱可引起呼吸和心律的变化，一些小鼠甚至可能因恶性心律失常而死亡。如果出现这些症状，必须暂停手术几分钟，直到呼吸和心率稳定。
减少术中失血对于提高小鼠的存活率至关重要。根据我们的经验，双缝合线连接最好在ECA附近应用。我们在两个结扎的中间断开ECA，以防止血液从远端ECA残端回流。当细丝插入ECA时，应结扎预先排列的缝合线以防止切口出血。至关重要的是不要将血管太紧，因为这会阻碍适当的细丝推进。
适当的细丝插入深度对于成功的 SAH 诱导至关重要。由于所用小鼠的年龄（8-12周），我们将细丝插入ICA内部约9毫米，并在遇到阻力时停止，然后进一步推进〜3毫米进行穿孔。插入的灯丝不够深可能导致穿孔不足，导致没有SAH，而过度插入可能导致行程和/或ICH（图3）。同时，在手术过程中需要尽可能保留小鼠的原始解剖结构和血管结构。例如，枕动脉 （OA） 或甲状腺上动脉 （STA） 以及鞘上的滋养血管应尽可能保留。
图3：小鼠大脑解剖结构和SAH的宏观图像。（A）小鼠血管解剖示意图，显示丝穿孔部位。（B）成功诱导SAH的经典宏观图像。在切除大脑之前，进行了1x PBS的灌注。（C）鼠标的宏观视图，其中细丝被推得太深，导致ICH。缩写：ACA =脑前动脉，ECA =颈外动脉，CCA =颈总动脉，ICA =颈内动脉，ICH =脑出血，L =左，MCA =脑中动脉，PPA =翼腭动脉，R =右。比例尺 = 3 mm 。请点击此处查看此图的大图。
血管内穿孔模型是研究SAH的常用动物模型，但确保出血分级和排除其他病理如中风或脑出血的手段在文献中不够标准化21。就像任何手术动物模型一样，SAH诱导的成功率和稳健性取决于外科医生的经验。
目前，血管内穿孔模型是小鼠实验性SAH诱导的最常用方法之一。这种方法不需要开颅手术，并且准确地类似于患有动脉瘤SAH22的人类发生的过程。优点包括密切模仿动脉瘤性 SAH 后病理生理学，关于急性和迟发反应23。此外，该模型中的死亡率已被证明与患有动脉瘤性SAH23的患者的临床研究相似。与血液注射模型相比，血脑屏障通透性的变化更接近于模拟，并且在细丝穿孔中实现了更高的血管痉挛率11，24。与侵入性较小的血管内穿孔模型相比，血液注射模型更具侵入性，因此具有更大的组织损伤风险。尽管如此，应该注意的是，血液注射方法的一个主要优点是易于控制的血容量23。注射速度的标准化是重要的考虑因素，因为ICP的变化在很大程度上取决于注射速度23。除了这些经典模型外，弹性蛋白酶注射通过单侧肾切除术诱导动脉瘤形成和高血压，最终导致动脉瘤破裂，为在更病理生理学上更现实的设置25中研究蛛网膜下腔出血提供了一个有趣的模型。将这些技术与转基因小鼠相结合将是未来研究的兴趣。
先前用于细丝穿孔模型的SAH分级系统是基于小鼠被处死后不同脑节段可见的蛛网膜下腔血液的量17。因此，这些分级系统不允许在牺牲时血液已被吸收时进行长期研究。在临床环境中，根据临床表现以及成像时的 SAH 厚度对 SAH 进行分级，对应于临床结局1，26，27，28。因此，为了无创地对出血严重程度进行分类，我们在SAH放射学分级上添加了标准化的MRI随访检查，通过该分级基于预先存在的人类分级量表，调整了Egashira等人先前发表的SAH小鼠MRI分级系统的分级系统。这种方法还可以确保量化总血容量，并排除与其他颅内病变（例如，卒中、ICH、脑积水）共存的动物。一些研究提出颅内压（ICP），脑灌注和血压监测作为成功诱导SAH的证据，这可能是额外的有用工具29。对 SAH 的严重程度和潜在的实质内损伤进行分级的间接方法包括将临床发现与细胞死亡标志物（如 p53、TUNEL 或半胱天冬酶-3）的组织学染色相结合。然而，这些间接工具（如颅内压监测）以及神经系统可能无法整齐地区分其他病理，例如卒中、颅内出血或脑积水。尽管MRI分级具有优势，但这种方法的可行性有一个主要缺点：MRI不像其他方法那样广泛用于实验室。这限制了MRI分级系统在实验SAH中的广泛引入。然而，当可用时，所提出的MRI分级系统增加了一个工具来标准化实验SAH模型，因此促进了实验的可重复性和可比性23。在这项研究中，尽管在手术过程中观察到临床变化，但在术后MRI上，没有SAH证据的小鼠仍有14%的发生率。可能，该亚组中的小鼠患有微出血，在MRI上无法检测到（类似于CT阴性的SAH患者，但在腰椎穿刺中存在黄染）。这些小鼠被排除在该实验设置中以进行进一步分析。MRI 上出现这些“无出血”的技术原因可能是细丝插入不足，导致无穿孔（例如，不正确地放入 OA 或翼腭动脉 （PPA））。此外，成功穿孔的容器可能会在灯丝拔出后再次关闭，从而防止SAH。
综上所述，提出了血管内穿孔实验性动脉瘤SAH的标准化模型，并在术后24 h结合MR成像，以确认出血并对出血进行分级，并排除其他相关的颅内病变。
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Disclosures
无利益冲突
Acknowledgments
SL得到了中国国家留学基金委的支持。KT得到了柏林卫生研究所和Sonnenfeld-Stiftung的BIH-MD奖学金的支持。RX由BIH-Charité临床科学家计划提供支持，该计划由Charité-Universitätsmedizin Berlin和柏林卫生研究所资助。我们感谢德国研究基金会（DFG）和柏林夏里特医学院开放获取出版基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
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