Summary
تصف هذه الورقة النمذجة الإقفارية -reperfusion (I / R) في جنين فرخ لمدة 3 أيام باستخدام خطاف مخصص لإبرة العمود الفقري لفهم أفضل لتطوير I / R والعلاج. هذا النموذج بسيط وسريع وغير مكلف.
Abstract
اضطرابات نقص التروية والتشويش (I/R)، مثل احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية وأمراض الأوعية الدموية الطرفية، هي عدد قليل من الأسباب الرئيسية للمرض والوفاة. العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي متاحة حاليا لدراسة آلية I / R في الأمراض أو الأنسجة التالفة. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم الإبلاغ عن أي نموذج للكشف عن المخدرات، مما سيسمح بفهم أفضل لآليات البحث والتطوير والفحص الأسرع للأدوية. تصف هذه الورقة نمذجة I/R باستخدام خطاف مخصص لإبرة العمود الفقري في جنين فرخ لمدة 3 أيام لفهم آليات تطوير I/R وعلاجها. يمكن استخدام نموذجنا للتحقيق في الحالات الشاذة في مستويات الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. هذه الطريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة. ويمكن استخدام النموذج الحالي بشكل مستقل أو بالاشتراك مع النماذج الموجودة في المختبر وفي الجسم الحي I /R.
Introduction
تم ربط إصابة الأنسجة الإقفارية إلى عدد من الأمراض، بما في ذلك النوبات القلبية والسكتة الدماغية والصدمات النفسية وأمراض الأوعية الدموية الطرفية1،2،3،4،5. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدم وجود فهم شامل لتطور المرض وعدم وجود نموذج بحثي فعال. تحدث الإصابة الإقفارية عندما يتم قطع إمدادات الدم إلى منطقة معينة من الأنسجة. ونتيجة لذلك ، تنخر الأنسجة الإقفارية في نهاية المطاف ، على الرغم من أن المعدل يختلف اعتمادا على الأنسجة. وبالتالي، قد تساعد استعادة إمدادات الدم على التخفيف من الضرر. ومع ذلك، فقد لوحظ، في بعض الحالات، أن التروية يسبب تلف الأنسجة أكثر من نقص التروية وحده لا 6،7،8. لذلك ، فهم الآليات الجزيئية والخلوية للتشويش الإقفاري مطلوب لتطوير تدخل علاجي فعال. حاليا، لا يعرف أي علاج فعال لإصابات I/R. وقد أدى هذا التفاوت إلى إنشاء نماذج تجريبية جديدة، تتراوح بين النماذج المختبرية والنماذج الحية، لمعالجة المشكلة القائمة9,10,11,12,13.
تستخدم أجنة الفرخ (Gallus gallus domesticus) على نطاق واسع في الأبحاث بسبب سهولة الوصول إليها ، ومقبولتها الأخلاقية ، وحجمها الكبير نسبيا (مقارنة بالأجنة الأخرى) ، وانخفاض التكلفة ، والنمو السريع14. استخدمنا جنين فرخ في 72 ساعة من التنمية لإنشاء في أوفو I / R عن طريق انسداد والإفراج عن الشريان الزئني الأيمن بمساعدة إبرة العمود الفقري. أطلقنا عليه اسم نموذج هوك-I/R الإقفارية-إعادة التروية (الشكل 1). النموذج المستخدمة في هذه الدراسة قادر على محاكاة بدقة جميع العمليات المصب، بما في ذلك المسارات التأكسدية والالتهابية، والتي ترتبط في كثير من الأحيان مع الضرر I/R15،16،17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أصدرت اللجنة المؤسسية الأخلاقية الحيوانية في كلية ومستشفى لوكناو الطبية في إيرا تنازلا مكتوبا ينص على أنه لم تكن هناك حاجة إلى موافقة رسمية لإجراء هذه التجارب وفقا للجنة لغرض مراقبة والإشراف على التجارب على الحيوانات (CPCSEA). ومع ذلك، تم اتباع إجراءات التشغيل القياسية لتقليل أي احتمال للضائقة الجنينية.
1. إعداد المخزن المؤقت (الجدول 1)
- إعداد حل رينغر
- لإعداد الحل رينغر، حل 0.72 غرام من NaCl (123 mM)، 0.017 غرام من CaCl2 (1.53 mM)، 0.037 غرام من KCl (4.96 mM) في 70 مل من H2O المقطر العقيم، مع حجم نهائي قدره 100 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. السماح لها تذوب تماما وautclave. ثم، فلتر من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، aliquot إلى كميات ذات استخدام واحد (حوالي 10 مل) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد المالحة العادية (0.9٪ كلوريد الصوديوم، NaCl).
- في 70 مل من H2O المقطر المعقم، حل 0.9 غرام من NaCl (154 mM). تشكل حجم إلى 100 مل. الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 0.1 N HCl أو 0.1 N NaOH إذا لزم الأمر. جعل 10 مل aliquots في أنبوب الطرد المركزي 15 مل معقمة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الإيثانول بنسبة 70٪ (v/v).
- مزيج 70 مل من الإيثانول النقي (مول. wt. 46.07 غرام / لتر) إلى 30 مل من H2O العقيمة. إعداد حسب الحاجة أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة. ليست هناك حاجة للتعقيم.
- إعداد 1x الفوسفات العازلة المالحة (1x PBS).
- إعداد 100 مل من برنامج تلفزيوني 1x بإضافة 0.144 غرام من Na2HPO4·7H2O (5.37 mM), 0.8 غرام من NaCl (136.8 mM), 0.2 غرام من KCl (26.8 mM), 0.2 غرام من KH2PO4 (14). 6 م م) إلى 70 مل من الماء المقطر. حل وتصنع وحدة التخزين إلى 100 مل وautclave لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية. جعل درجة الحموضة إلى 7.4، إضافة بضع قطرات من 0.1 N HCl أو 0.1 N NaOH، إذا لزم الأمر. جعل aliquots من 10 مل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل معقمة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
2. اليوم الأول
- ترتيب جميع الأدوات اللازمة لتعقيم البيض (70٪ الإيثانول، تنظيف مناديل، رف البيض، وعلامة OHP).
- تنظيف البيض لمدة 0 يوم مع الإيثانول 70٪ باستخدام مناديل ورق الأنسجة. استخدمي بويضة لمدة 0 يوم فقط، حيث أن البويضات القديمة قد لا تؤدي إلى جنين.
- اكتب التاريخ الحالي على البيض مع علامة OHP.
- ضع البيض في حاضنة البيض على درجة حرارة 36-37 درجة مئوية ومستوى رطوبة من 60٪ -65٪. احتضان البيض لمدة 24 ساعة القادمة.
3. اليوم الثاني
- ترتيب المعدات اللازمة لسحب 5-6 مل من الألبومين (مقص حافة حادة، 5 مل حقنة، 18 G إبرة، متخلص حقنة، وشريط لاصق).
- مسح مقص الجراحية مع الإيثانول 70٪ أو تعقيم باستخدام الأوتوكلاف بعد مسح لهم مع الإيثانول 70٪.
- الآن خذ البيضة من حاضنة البيض 37 درجة مئوية للطبقات.
- ضع البيضة على رف بيض نظيف.
- إرفاق قطعة صغيرة من شريط لاصق (الحجم: حوالي 1 بوصة طول × العرض) إلى حافة البيض.
- جعل ثقب صغير في حافة قشر البيض باستخدام مقص حافة حادة مدببة. أدخل حقنة سعة 5 مل بزاوية تقريبية تبلغ 75 درجة.
ملاحظة: تأتي حقنة 5 مل مع إبرة 24 G x 1 (معقمة)، ولكن من الجيد استبدال إبرة 24 G x 1 بإبرة 18 G x 1.5 (معقمة). الإبرة 18 G x 1.5 هو 1.25 × 38 ملم في العرض. لذلك، فإنه سيتم تسهيل إزالة الألبومين. - بعد إدخال الإبرة في كيس الصفار ، اسحب ببطء 5-6 مل من الألبومين.
ملاحظة: هذا يوفر الجنين مع سرير التي يمكن أن تنمو. سحب الألبوم يمنع تجاوز الألبومين أثناء إنشاء نافذة. وأخيرا، يتم التخفيف من خطر تلف الجنين أثناء النوافذ عن طريق القضاء على 5-6 مل من الألبومين. - بعد إزالة الألبومين، إعادة ختم الفتحة بشريط لاصق وترك البيض لاحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
4. اليوم الرابع
- إعداد الحل رينغر، 0.9٪ المالحة العادية، و 1x برنامج تلفزيوني كما هو موضح في القسم 1 من البروتوكول. ثم، أوتوكلاف الحلول الثلاثة. بعد الالاستعباد التلقائي ، ضع الحل المعني في درجة حرارة الغرفة.
- أخرج البيضة من حاضنة البيض 37 درجة مئوية وقطع القشرة إلى شكل دائري. قبل قطع قشر البيض، قم بتغطية المنطقة ليتم قطعها بشريط لاصق.
ملاحظة: تغطي منطقة النافذة بشريط لاصق يمنع كسر قشر البيض إلى أماكن غير مرغوب فيها. ومع ذلك، إذا كنت اقتحام مكان غير مرغوب فيه، ختم المنطقة مع شريط لاصق. تغطية الأماكن التي سيتم قطعها بشريط لاصق يمنع قطع قذيفة من السقوط على كيس صفار. - خلق ثقب صغير في قشر البيض مع مقص حافة مدببة بحدة في المكان الذي يرغب في النوافذ والبدء في قطع فتحة دائرية. تعرف هذه العملية باسم الإطارات.
ملاحظة: تأكد من أن القطع الدائري كبير بما يكفي للسماح بسهولة الوصول إلى الجنين من أي اتجاه. إذا لزم الأمر، تغيير وضعية البويضة لاستيعاب وضع الجنين. - بعد ذلك، باستخدام مجهر جراحي للتكبير/التصغير ستيريو، حدد موقع الشريان الزفير الأيمن (RVA).
ملاحظة: تخضع أجنة الدجاج عادة لتوجس الصدر (جنبا إلى جنب مع ثني عنق الرحم، وما إلى ذلك) أثناء تطورها، بحيث يكون الجانب الأيسر من الرأس ضد الصفار في مرحلة 72 ساعة. أكثر caudally، حيث الشرايين الهوتيلين الخروج من الجسم، والجنين ليست ملتوية كثيرا، وهذا الجزء من الجسم يكمن الجانب البطني وصولا الى صفار. لذا ، بالنظر مباشرة ، فإن حق الجنين هو على يمين الباحث. - بمجرد تحديد موقع RVA، قم بإنشاء ثقبين صغيرين على الجانبين الأيسر والأيمن من RVA باستخدام إبرة 26 G (الشكل 2).
- ضع مسبار تصوير تدفق الدم دوبلر فوق RVA. تأكد من وضع مسبار تصوير تدفق الدم دوبلر 5 ± 1 مم من موقع نقص التروية ونحو النهاية البعيدة لل RVA. اتخاذ قراءة تدفق لمدة 2 دقيقة و 30 ق (أو أطول إذا رغبت في ذلك). وستكون هذه هي مرحلة القراءة normoxic.
- في غضون ذلك ، وذلك باستخدام الأنف plier والملقط مسنن ، العفن يدويا حافة الإبرة الشوكية في شكل هوك (الشكل 3). القيام بذلك عن طريق الانحناء حافة الإبرة الشوكية لحوالي 1 ملم. وهناك حجم أكبر تجعل من الصعب إدراج وإزالة إبرة العمود الفقري أثناء إجراء الإدخال / R.
- أدخل الإبرة الشوكية مباشرة أسفل الشريان الزاني الأيمن باستخدام ميكرومانيبولاتور.
ملاحظة: أدخل الإبرة الشوكية بحذر شديد لتجنب إتلاف ال RVA أو أي شرايين مجاورة. التقنية المثلى هي ضبط الخطاف المصمم خصيصا للإبرة الشوكية فوق الجانب الأيمن من ثقب RVA تماما ، يليه إدخال حافة الإبرة الشوكية المصممة خصيصا تدريجيا في كيس الصفار بمساعدة ميكرومانيبواتور تحت إشراف مجهر جراحي للتكبير ستيريو من خلال الثقب الأيمن. مرة واحدة في خطاف الإبرة الشوكية في كيس صفار, ضبط تدريجيا هوك تحت RVA بحيث يتم وضع حافة بالضبط تحت الثقب الأيسر. الآن هو الوقت المناسب لرفع الإبرة الشوكية. - الآن، بمساعدة من micromanipulator، رفع تدريجيا الشريان حتى تدفق الدم دوبلر يشير إلى انخفاض الحد الأدنى من 80٪ في تدفق الشرايين.
- بمجرد أن يتم تحقيق انخفاض بنسبة 80٪ أو أكثر في تدفق دوبلر، اترك الإبرة الشوكية مرفوعة (سحب الشريان إلى الأعلى) لمدة 5 دقائق. وستكون هذه هي فترة نقص التروية في RVA.
ملاحظة: من المهم مراقبة تدفق دوبلر خلال فترة نقص التروية. إذا تم العثور على قدر كبير من التقلبات، قم بإنهاء الاختبارات. - بعد فترة نقص التروية 5 دقائق، وإطلاق سراح تدريجيا الشريان لاستعادة مستويات تدفق الدم الطبيعية. تأكد من أن قراءة مقياس تدفق الدم دوبلر تعرض قيما مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها أثناء normoxia. وستكون هذه هي فترة إعادة التروية في RVA (الشكل 4).
- بعد إجراء I / R ، ضع بضع قطرات (2-3) من برنامج تلفزيوني 1x على الجنين ومشاهدته لمدة 2-3 دقائق.
ملاحظة: استخدام برنامج تلفزيوني 1x يساعد على منع الجنين من الجفاف. - وأخيرا، إعادة ختم النافذة بشريط لاصق ووضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض لمدة 5 ساعات و 55 دقيقة.
- بعد 5 ساعات و 55 دقيقة، خذ البيضة من حاضنة البيض، وضعها على رف البيض، إعادة فتح النافذة، واتبع بروتوكول العلاج المصب.
5. العلاجات
- لعلاج الشرايين بالأدوية أو المنشطات أو المثبطات ، اقتطع RVA بعد ساعة واحدة من عملية I / R.
- بالنسبة للدراسات المصبية، قم أولا بإزالة الجنين من قشر البيض عن طريق وضعه على طبق بيتري معقم عيار 90 ملم.
- بمجرد إطلاق الجنين في طبق بيتري ، اقتطع RVA باستخدام القزحية العينية تحت إشراف مجهر جراحي للتكبير ستيريو.
- تأكد من أن بعد استئصال RVA يصل إلى 15 ± 1 مم (بعيدا عن الجذع) و5 ± 1 مم لكل منهما على الجانب الأيسر والأي من الشريان الأيمن و2 ± 1 مم باتجاه الجذع.
ملاحظة: يمكن استخدام مسطرة لقياس المساحة التي سيتم استئصالها (اختياري). - بعد استئصال RVA، وغسله مع برنامج تلفزيوني 1x في طبق بيتري عقيمة تحتوي على 1x PBS.
- بالنسبة للعلاجات المطلوبة، ضع الشريان في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل (معقم) مليء ب 500 ميكرولتر من محلول رينغر. ضع RVA في أنبوب الطرد المركزي وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة و 55 دقيقة.
ملاحظة: اعتمادا على العلاجات، إما استخدام الحل رينجر دون أي علاج، أو العلاج مع الحجم المطلوب وتركيز المخدرات، المنشط، أو المانع. - بعد 5 ساعة و 55 دقيقة من الحضانة، أخرج RVA من حاضنة المختبر 37 درجة مئوية، والمضي قدما في العلاجات المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام تقنية تصوير تدفق الدم دوبلر لتقييم فعالية نموذجنا. باختصار، قارنا البيانات من مجموعة التحكم مع البيانات من مجموعة RVA لتحديد نجاح إنشاء لدينا. يصور الشكل 4A تدفقا نموذجيا مرتبطا بحيوان التحكم، بينما يصور الشكل 4B النتائج التي تم الحصول عليها من RVA. يمثل العدد 1-8 الأحداث المختلفة المقترنة بمراحل I/R. باختصار، العددية 1-3 تتوافق مع مرحلة normoxia، في حين أن الانخفاض الحاد في تدفق في النقطتين 3 و 4 يمثل الأحداث المرتبطة بانخفاض تدفق الدم في RVA. وبمجرد تحقيق انخفاض بنسبة 80٪ أو أكثر، تم ترك RVA مرفوعا لمدة 5 دقائق قادمة. كانت هذه هي مرحلة نقص التروية (رقمية 4-5). بعد رفع 5 دقائق من RVA، تم إصدار RVA، الذي يمثله رقمية 6 و 7. يمثل التدفق من النقطة 7 فصاعدا مرحلة التروية ، والتي تحدث بعد أن حققت RVA مستويات تدفق الدم الطبيعية ، والتي كانت مرحلة التروية. أظهرت هذه التجربة بالذات فعالية نمذجة I/R في جنين الفرخ المتطور لمدة 3 أيام.
للتحقق من فائدة نموذجنا، درسنا أنماط التعبير عن البروتينات والحمض النووي الريبي من خلال ELISA، النشاف الغربي، qRT-PCR، وتحليل الكهربائي هلام. باختصار، قسمنا البيض المطور لمدة 3 أيام إلى ثلاث مجموعات تجريبية: التحكم، I/R، والعلاجات + I/R. لوحظ اختلاف كبير في التعبير عن البروتينات والجينات وسلامة الحمض النووي بين مجموعات I/R والتحكم الخاصة بها. وكما هو موضح أدناه، فإن العلاج من تعاطي المخدرات لمجموعة I/R قد حسن بشكل فعال النتيجة التي لوحظت في هذه المجموعة مقارنة بالمجموعة المعالجة بال I/R وحدها؛ وهذا يتفق مع منشورنا السابق الذي يستند إليه هذا البروتوكول1. واتبعت إجراءات مختبرية موحدة بالنسبة إلى ELISA18، والنشاف الغربي19، وQRT-PCR20، وكهرومورفوريسيس هلام21، وهي غير مشمولة في هذه الورقة (الشكل 5، الشكل 6، الشكل 7، الشكل 8).
يحفز الارتجاف الإقفاري العديد من العمليات، بما في ذلك تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الضارة بالأنسجة. الآثار الضارة الناجمة عن استجابة أنظمة الدفاع عن الجسم المضادة للأكسدة الجوهرية لROS هي سمة مهمة من إصابات I / R. فحصنا أنشطة البروتينات التنظيمية للأوكسجين 150 (ORP150)، وأول أكسيد السيتوبلازمي superoxide dismutase 1 (SOD1)، والكاتالاس في الأوعية الإقفارية. بالمقارنة مع مجموعة التحكم، رفع I/R نشاط ORP150، SOD1 السيتوبلازمي، والكاتالاس (الشكل 5A-C). ومع ذلك, مكملات مع N-أسيتيل-L-سيستين (NAC), وquencher ROS, التخفيف من الإجهاد التأكسدي للمجموعة I/R.
لتقييم إمكانات نموذجنا الالتهابية، استخدمنا ELISA لفحص التعبير IL-1β و TNF-α (الشكل 6). تم التعبير عن كل من interleukins في مجموعة I / R بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، مما يشير إلى أن نموذجنا لديه القدرة على استخدامه في التحقيقات الالتهابية. بعد ذلك ، اختبرنا التعبير عن مستقبلات NOD الشبيهة بالبروتين المحتوي على مجال البرين 3 (NLRP3) inflammasome pathway22،23 ، والجزيء المؤيد للالتهابات ، NF-kβ24،25 ، والتي تشارك في تضخيم الالتهاب ، لتأكيد فائدة هذا النموذج للدراسات الالتهابية. واستجابة ل I/R المتولدة في RVA، وجد هذا التحقيق أدلة على تنشيط الاشتعال NLRP3 (الشكل 7A)، وكذلك NF-kβ (الشكل 7B). ومع ذلك ، فإن العلاج مع Naringenin ، وهو دواء معروف مضاد للالتهابات ، حسن الآثار الالتهابية ، كما لوحظ في المجموعات المعالجة بالمخدرات.
الإقفارية-reperfusion ينشط مسارات موت الخلايا البرنامجية26,27,28. درسنا آثار I / R على موت الخلايا المبرمج ومسارات autophagy في جنين الفرخ. يصور الشكل 8A تأثير I/R على caspase-3 و zVAD-fmk. يوضح الشكل 8B-D أن مجموعة I/R كان لديها تعبير أعلى عن LC3II وكذلك نسبة LC3II/I (علامة autophagosomes) و Beclin1 (منظم كبير ل autophagy في خلايا الثدييات) و Atg7 (مطلوب ل autophagy القاعدي) من مجموعة التحكم ، على التوالي ، عند مستويات البروتين. في المقابل، يظهر الشكل 8E تأثير I/R على مستويات الحمض النووي الريبي. إضافة 3-MA، مثبط autophagy، ومع ذلك، عكس النتائج. وتشير هذه النتائج إلى أن النموذج يمكن استخدامه للتحقيق في عمليات موت الخلايا المختلفة (على سبيل المثال، النخر). ويبين الشكل 9 مدى كفاءة دراسة التغيرات على مستوى الحمض النووي باستخدام نموذج هوك-I/R.
وأخيرا، نقارن النتائج من نموذج هوك-I/R ونموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) لمعرفة مدى فعالية نموذجنا بالمقارنة مع النماذج الأخرى. لتلخيص, وكان RVAs I /R المعالجة مستويات أعلى من البروتين الأبوبتوتيك مشقوق كاسباس-3, البروتينات autophagy Beclin1 و Atg7, والتهابات بين اليوكينز TNF-α وIFN-Ƴ من السيطرة RVAs. ومن المثير للاهتمام، سواء تحليل الإجهاد الالتهابي أو مسارات الموت الخلوية، أنتجت نموذج هوك-I/R نتائج مشابهة للغاية لتلك التي حصل عليها نموذج MCAO (الشكل 10).
الشكل 1: رسم تخطيطي لإعداد نموذجي لنموذج الإقفارية للفرخ هوك-I/R. تظهر الصورة متطلبات تجربة التجريب على جنين هوك-I/R الإقفارية- إعادة التروية، مثل المجهر الجراحي للتكبير الاستريو، ومقياس تدفق الدم دوبلر بالليزر، والميكرومانيبولاتور، والإبرة الشوكية، وأجنة الفرخ المطورة بدقة 72 ساعة، ومصدر إضاءة". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة تمثيلية لموقع عرض جنين فرخ لمدة 3 أيام من الانسداد ومنطقة استئصال الأنسجة. (أ) يظهر المثلث موقع استئصال الأنسجة للنشاف الغربي والحمض النووي الريبي وعزل الحمض النووي. تمثل النجمة والنقاط موقع الانسداد والثقوب التي تم إنشاؤها على الجانب الأيسر والأي من اليمين من RVA لإدخال الإبرة تحت الشريان لرفعها ، على التوالي. كما يتم توفير صورة مكبرة لمنطقة استخراج الأنسجة معها. يمثل التدوين A العين، ويمثل B القلب، ويمثل C يسار الشريان الهوتيلي، ويمثل C يمين الشريان الهوتيلي. (ب) تمثيل تخطيطي للجانب الأيمن من جنين الفرخ يوضح مساحة استئصال الأنسجة بالقرب من RVA. يمثل الخط المستقيم RVA الخارجة من جذع الجنين. النجم على الخط العمودي يرمز إلى موقف الليزر دوبلر تدفق الدم التحقيق. يشير التقاطع إلى موقع الانسداد. تم استئصال الشرايين حتى 15 ± 1 مم (بعيدا عن الجذع) و5 ± 1 مم لكل منهما على الجانب الأيسر والأي من الشريان الأيمن ، و2 ± 1 مم باتجاه الجذع. جميع القياسات تظهر مسافات من موقع الانسداد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صورة تمثيلية لإبرة العمود الفقري مع هوك حسب الطلب.
الشكل 4: تمثيل إشارة مقياس تدفق الدم دوبلر ليزر نموذجي. تم قياس إشارة مقياس تدفق الدم ليزر دوبلر نموذجية على شريان جنين فرخ لمدة 3 أيام من بويضة مجموعة التحكم (A). الأحداث عند خط الأساس (1) ، أثناء normoxia (2) ، الرفع المسبق الفوري ل RVA (3) ، الرفع الفوري بعد RVA (4) ، أثناء نقص التروية (5) ، الإفراج الفوري قبل RVA (6) ، فور ما بعد التروية (7) ، أثناء التروية (8) في المجموعة المعالجة الإقفارية كما سجلها مقياس تدفق الدم Laser Doppler (B). اعتمد هذا الرقم من فوزية وآخرين، 2018 (الحدود في علم الصيدلة؛ بموجب ترخيص CC-BY)1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأثير نقص التروية- إعادة التروية على التعبير عن البروتينات علامة الإجهاد التأكسدي. تم استخدام النشاف الغربي لتحديد مستويات التعبير ORP150 و SOD1 و catalase. (أ) تم زيادة التعبير ORP150 بعد الضرر I / R. خفضت NAC ، وهو مثبط pan-ROS ، ORP150 إلى مستوى مماثل لمستوى التحكم. (ب) بعد I/R، تم رفع تعبير SOD1. وبالمثل انخفض التعبير SOD1 بعد العلاج NAC. (ج) تسبب حدث I/R في التعبير عن الكاتالاس. أظهرت RVA المعالجة بال I/R والمعرضة ل NAC انخفاضا في مستويات الكاتالاسي. واستخدمت هيئة GAPDH (A وC) β-Actin (B) كضوابط داخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تقدير IL-1β و TNF-α باستخدام ELISA. تم استخدام ELISA لتحديد IL-1β و TNF-α، وكشفت النتائج أن هناك زيادة في التعبير IL-1β و TNF-α، والتي تم تخفيفها بإضافة نارينجينين. لهذه الدراسة، تم تطبيق ANOVA تليها اختبار نيومان-كيولس. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SD، n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: أدى تأثير نقص التروية على التعبير عن بروتينات علامة الالتهاب. (أ) أدى علاج I/R إلى زيادة التعبير عن NLRP3. حضانة I / R تعامل RVA مع Naringenin انخفض التعبير عن NLRP3. (ب) وعلى غرار NLRP3، ازداد أيضا التعبير عن NF-kβ بعد العلاج بال I/R. العلاج من نارينجينين خفضت التعبير عن NF-kβ. تم استخدام GAPDH كرقابة داخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تأثير نقص التروية على الحالة المبرمجة والتوائية لخلايا RVA. (أ) لاستكشاف تحريض موت الخلايا المبرمج بواسطة عملية I/R ، تم تقييم التعبير عن كاسباس 3 المشقوق باستخدام النشاف الغربي. بعد الضرر I / R ، تم زيادة مستوى كاسباس 3 المشقوق. ومع ذلك ، فإن العلاج مع zVAD-fmk ، وهو مثبط موت الخلايا المبرمج ، انخفض تعبير caspase 3 المشقوق. (B-D) لتقييم تحريض autophagy بعد I / R ، تم تحديد التعبير عن LC3II / I ، Beclin1 ، و Atg7. بعد I / R ، زاد التعبير عن جميع علامات autophagic ، في حين أن التعرض ل RVA المعالجة I / R لمثبط autophagy 3-MA قلل من التعبير عن جميع البروتينات للسيطرة على المستويات. وكعنصر مراقبة داخلي، تم استخدام GAPDH. (ه) تم استخدام qRT-PCR لتأكيد تحريض autophagy وتحديد مستويات التعبير Ambra1 و Atg7 مرنا. وأظهرت كل من الجينات زيادة كبيرة في التعبير في مجموعة I / R بالمقارنة مع السيطرة، والتي أعيدت إلى مستويات شبه طبيعية بعد العلاج NAC. تم استخدام GAPDH كرقابة داخلية لتجارب qRT-PCR. للتجربة (E) ، تم تطبيق ANOVA ، تليها اختبار نيومان-كيول. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SD، n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تأثير نقص التروية على تلف الحمض النووي. لتحديد ما إذا كان I / R يحفز نيكز الحمض النووي، فحصنا تلف الحمض النووي باستخدام الكهربائي هلام. وقد أدى التحلل الجيني للحمض النووي إلى تدهور الحمض النووي، كما يظهر من خلال التلطيخ في عينة I/R. العلاج NAC من I / R التالفة RVA خفض تلف الحمض النووي. تم استخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: مقارنة بين نموذج هوك - I / R مقابل نموذج MCAO. وأجريت مقارنة بين البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة طراز Hook-I/R والبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة نموذج MCAO. (أ) كان التعبير عن البروتين الأبوبتوتيكي كاسباس-3 والبروتينات الذاتية التناسل Beclin1 و Atg7 أعلى في المعالجة بالبروتينات المعالجة RVAs عند مقارنتها بالتعبير عن نفس البروتينات في RVAs التحكم، والتي كانت متفقة مع النتائج التي تم الحصول عليها في تجارب MCAO. (ب) تبين أن مستويات α TNF وIFN-Ƴ مرتفعة في كل من مجموعات RVA وMCAO بالمقارنة مع الضوابط الخاصة بكل منهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم المواد/المعدات | تركيز | الأوتوكلاف | خزن | ||
| الكواشف لحل رينغر | |||||
| كلوريد الصوديوم | 123 مليون متر | ||||
| كلوريد البوتاسيوم | 4.96 مليون متر | ||||
| كلوريد الكالسيوم | 1.53 مليون متر | ||||
| المياه المقطرة العقيمة | 100 مل | ||||
| الرقم الهيدروجيني | 7.4 | 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية | ر.ت. | ||
| الكواشف ل 0.9٪ ملحي طبيعي | |||||
| كلوريد الصوديوم | 154 متر م | ||||
| المياه المقطرة العقيمة | 100 مل | ||||
| الرقم الهيدروجيني | 7.4 | 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية | ر.ت. | ||
| الكواشف ل70٪ الإيثانول | |||||
| 70٪ إيثانول | 70 مل | ||||
| المياه المقطرة العقيمة | 30 مل | غير مطلوب | ر.ت. | ||
| الكواشف ل1x الفوسفات العازلة المالحة | |||||
| كلوريد الصوديوم | 136.8 مليون متر | ||||
| كلوريد البوتاسيوم | 26.8 مليون متر | ||||
| فوسفات البوتاسيوم أحادي اللامائية | 14.6 مليون متر | ||||
| دي الصوديوم هيدروجين فوسفات الهيبتاهيدرات | 5.37 مليون متر | ||||
| المياه المقطرة العقيمة | 100 مل | 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية | ر.ت. | ||
الجدول 1: وصفة الحلول المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهدف من البحوث الإقفارية-reperfusion هو خلق استراتيجيات علاجية تمنع موت الخلايا وتعزيز الانتعاش29,30. للتغلب على القيود الحالية في أبحاث I / R ، قمنا بتصميم نموذج جنين هوك I / R لإنتاج نموذج I / R موثوق به وقابل للاستنساخ. على حد علمنا، لدينا هو أول نموذج I / R من أي وقت مضى خلق في جنين فرخ لمدة 3 أيام للتجارب الروتينية I / R، إلى جانب دراسة إشارات الإجهاد (على سبيل المثال، الإجهاد التأكسدي والالتهابي). ونظرا لفوائد الحجم وإمكانية الوصول في اليوم الثالث من التطور31، تم استخدام جنين الفرخ في مرحلة نمو تبلغ 72 ساعة، بسبب ارتفاع إنتاج النموذج، وبساطة استخدامه، وقدرته على التكيف مع التحليل الروتيني32. باختصار ، في اليوم التنموي 3 ، فإن فرخ ovo هو نموذج عالي التحكم ، ولكن يمكن الوصول إليه وشفاف بشكل معقول داخل البيضة التي يمكن استخدامها لتصور علم وظائف الأعضاء الطبيعي ، وأمراض الأمراض ، وآثار العلاج التجريبي. حجمها الضخم يجعلها مفيدة بشكل خاص لدراسة تكوين وسلوك الجنين أثناء علم وظائف الأعضاء الطبيعي وكذلك الإجهاد33. على الرغم من أن أجنة الفرخ الأكبر سنا (تلك المحتضنة لمدة 4 أيام أو أكثر) يمكن استخدامها ، وقد جربنا نقطة زمنية لاحقة ، فإن استخدام الأجنة القديمة كأنظمة نموذجية محدود بشدة بسبب حقيقة أن كيس الصفار ينمو سميكا جدا بعد 3 أيام من التطور بحيث يصعب إجراء العمليات الجراحية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين لم يتم تشكيل RVA بشكل كامل في نافذة زمنية مبكرة (لنقل ، في اليوم 1 أو 2) ، يمكن أن تؤدي النوافذ إلى المسخ34. وإلى جانب القيود المرتبطة بنقطة نمو مبكرة أو متأخرة، يعمل جنين فرخ 72 ساعة كنموذج مثالي للبحث في عملية I/R لأن أجنة الفرخ لمدة 3 أيام لديها نظام دورة الدموية المحدد جيدا30.
فهم الفيزيولوجيا المرضية لإصابة I / R هو هدف رئيسي لتصميم نموذج I / R. حاليا، لا يوجد أي العلاجية مفيدة سريريا للحد من تلف نقص التروية-reperfusion1،35. ونتيجة لذلك، اقترحت مجموعة واسعة من نماذج المختبر وفي الجسم الحي. وفي هذا السياق، اقترح لأول مرة وضع نماذج ل I/R في جنين فرخ نامي لمدة 3 أيام في أوفو. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن انسداد تدفق الدم الشرياني يسبب تغييرات مرضية في النماذج التجريبية التي تشبه تلك التي شوهدت في humans36,37,38، لذلك كنا نأمل أن نموذجنا سوف تفعل الشيء نفسه (مثل هذا الإجهاد التأكسدي والالتهابي لوحظ في نماذج الجسم الحي أو في المرضى). مع نتائج دراستنا، تبين أن الفرضية المذكورة أعلاه صحيحة.
يتم التحكم في دوران الدم من الأجنة إلى كيس الصفار عن طريق الأوعية الهوتيلينية في أجنة الفرخ39. تحصل الأجنة على العناصر الغذائية من الصفار والأوكسجين المنتشر من الهواء عبر الدورة الدموية الواهية. وبالتالي، تقييد أي من الأوعية الهوتيلين التي يمكن أن تعطل التغذية ونقل الأكسجين. واستنادا إلى هذه الحقائق، تم استحثاث نقص التروية عن طريق منع إمدادات الدم إلى RVA لمدة 5 دقائق، تليها إعادة التروية لمدة 5 ساعات و55 دقيقة إضافية. ويمكن استخدام النموذج المقترح لدراسة مجموعة من مختلف عمليات الأمراض المرتبطة بالبحث والتطوير واختبار مجموعة متنوعة من الأدوية وأهدافها. يمكن استخدام النموذج الحالي لدراسة التغيرات في الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات. لديها القدرة على إعطاء إنتاج عالية. وإلى جانب بساطته وقدرته على التكيف مع التحليل المنتظم، يمكن للنموذج أيضا أن يحقق في توجيه الخلايا الجذعية على المدى القصير، والذي سيتم التحقيق فيه في الدراسات المستقبلية.
بالمقارنة مع النماذج في المختبر ، نموذجنا سهل الاستخدام، وفعال من حيث التكلفة، وينمو بسرعة، فضلا عن كونه بريئا أخلاقيا32. وجود microvasculature، والجهاز المناعي، والتقييمات الفسيولوجية كلها فوائد على النماذج في المختبر في حين منخفضة التكلفة، وفعالية الوقت، وليس المشاكل الأخلاقية هي مزايا أكثر في نماذج فيفو40. المزايا المذكورة أعلاه تشير إلى أن نموذجنا له تأثير مماثل لنماذج I/R الأخرى المستخدمة حاليا (الشكل 10). ومن أوجه القصور المحتملة عدم قدرة النموذج الحالي على تحديد المنطقة العقائدية. قد يكون التقييم المباشر للشجرة علامة بيولوجية قيمة للضرر الذي توسطت فيه I/R وطريقة لرسم خرائط لآثار أدوية العلاج المختلفة. وهكذا، سعينا إلى تحديد مساحة المنطقة العفاريت ولكن لم نتمكن من القيام بذلك بسبب الهيكل الدقيق للفراخ 72 ح المتقدمة. ولذلك، يلزم إجراء بحوث إضافية لتقييم الاستراتيجيات والمسارات لعمليات البحث والتطوير تقييما شاملا.
وخلاصة الأمر، يمكن استخدام النموذج الحالي للتحقيق في مختلف مسارات الأمراض المرتبطة بالبحث والتطوير وفحص مجموعة متنوعة من الأدوية وأهدافها. ونظرا لارتفاع قابلية النسخ، وفعالية التكلفة، والبساطة، نتوقع أن يكون نموذجنا موردا قيما للعلوم الأساسية والبحوث التحويلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ونود أن نعرب عن امتناننا لهاري شانكار على إسهاماته الهامة أثناء التصوير والتحرير، والسيد باقر حسين على الصوت، والسيد أصغر رضوي على تحرير الفيديو، والسيد محمد حيدر لتصوير الفيديو، والسيد محمد دانمركي صديقي للمساعدة خلال التجارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
