Summary
Dette dokumentet beskriver iskemi-reperfusjon (I / R) modellering i en 3-dagers kylling embryo ved hjelp av en spinal nål tilpasset krok for bedre å forstå I / R utvikling og behandling. Denne modellen er enkel, rask og billig.
Abstract
Iskemi og reperfusjonsforstyrrelser (I/R), som hjerteinfarkt, hjerneslag og perifer vaskulær sykdom, er noen av de ledende årsakene til sykdom og død. Mange in vitro - og in vivo-modeller er for tiden tilgjengelige for å studere I / R-mekanismen i sykdom eller skadet vev. Til dags dato er det imidlertid ikke rapportert noen i ovo I/R-modellen, noe som vil gi en bedre forståelse av I/R-mekanismer og raskere legemiddelscreening. Dette dokumentet beskriver I/ R-modellering ved hjelp av en spinalnål tilpasset krok i et 3-dagers kyllingembryo for å forstå I / R-utviklings- og behandlingsmekanismer. Vår modell kan brukes til å undersøke uregelmessigheter ved DNA-, RNA- og proteinnivået. Denne metoden er enkel, rask og billig. Den nåværende modellen kan brukes uavhengig eller sammen med eksisterende in vitro - og in vivo I/R-modeller.
Introduction
Iskemi-reperfusjonsvevsskade har vært knyttet til en rekke patologier, inkludert hjerteinfarkt, iskemisk slag, traumer og perifer vaskulær sykdom1,2,3,4,5. Dette skyldes først og fremst mangel på en helhetlig forståelse av sykdomsprogresjonen og mangelen på en effektiv forskningsmodell. Iskemisk skade oppstår når blodtilførselen til et bestemt område av vevet er avskåret. Som et resultat nekroterer iskemisk vev til slutt, selv om hastigheten varierer avhengig av vevet. Derfor kan gjenoppretting av blodtilførselen bidra til å redusere skaden. Det har imidlertid blitt observert, i noen tilfeller, at reperfusjon forårsaker mer vevsskade enn iskemi alene gjør6,7,8. Derfor er det nødvendig å forstå molekylære og cellulære mekanismer for iskemireperfusjon for å utvikle en effektiv terapeutisk inngrep. Foreløpig er det ikke kjent noen effektiv behandling for I/R-skader. Denne forskjellen har ført til opprettelsen av nye eksperimentelle modeller, alt fra in vitro til in vivo-modeller, for å løse det eksisterende problemet9,10,11,12,13.
Chick embryoer (Gallus gallus domesticus) er mye brukt i forskning på grunn av deres enkle tilgang, etiske akseptabilitet, relativt stor størrelse (sammenlignet med andre embryoer), lav pris og rask vekst14. Vi brukte et kyllingembryo ved 72 timers utvikling for å skape en i ovo I / R ved å okkludere og frigjøre riktig vitelline arterie ved hjelp av en spinal nål. Vi kalte den Hook-I/R iskemi-reperfusjonsmodellen (figur 1). Modellen som brukes i denne studien er i stand til nøyaktig å simulere alle nedstrømsprosesser, inkludert oksidative og inflammatoriske veier, som ofte er forbundet med I / R-skade15,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Ethical Committee ved Era's Lucknow Medical College and Hospital utstedte en skriftlig fraskrivelse som sa at det ikke var nødvendig med formell godkjenning for å gjennomføre disse eksperimentene i samsvar med komiteen for kontroll og tilsyn med eksperimenter på dyr (CPCSEA). Standard driftsprosedyrer ble imidlertid fulgt for å minimere ethvert potensial for embryonal nød.
1. Bufferforberedelse (tabell 1)
- Forbered Ringers løsning
- For å klargjøre Ringers løsning oppløses 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) i 70 ml steril destillert H2O, med et sluttvolum på 100 ml. Juster pH til 7,4. La det oppløses helt og autoklaver. Deretter filtrerer du gjennom et 0,22 μm filter, aliquot i engangsmengder (ca. 10 ml) og lagres ved romtemperatur.
- Forbered normal saltvann (0,9% natriumklorid, NaCl).
- I 70 ml steril destillert H2O oppløses 0,9 g NaCl (154 mM). Utgjør volumet til 100 ml. Autoklav i 15 min ved 121 °C. Juster pH til 7,4 med 0,1 N HCl eller 0,1 N NaOH om nødvendig. Lag 10 ml aliquots i et 15 ml sterilt sentrifugerør og oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered 70% etanol (v / v).
- Bland 70 ml rent etanol (Mol. wt. 46,07 g/l) til 30 ml steril H2O. Forbered etter behov eller oppbevar ved romtemperatur. Det er ikke behov for sterilisering.
- Forbered 1x fosfatbuffer saltvann (1x PBS).
- Forbered 100 ml 1x PBS ved å tilsette 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14. 6 mM) til 70 ml destillert vann. Løs opp og utgjør volumet til 100 ml og autoklaver i 15 min ved 121 °C. Ta pH til 7.4, og legg om nødvendig til et par dråper 0,1 N HCl eller 0,1 N NaOH. Lag aliquots på 10 ml i et 15 ml sterilt sentrifugerør og oppbevar ved romtemperatur.
2. Dag 1
- Ordne alle verktøyene som er nødvendige for eggsterilisering (70% etanol, rengjøringsservietter, et eggstativ og en OHP-markør).
- Rengjør 0-dagers eggene med 70% etanol ved hjelp av vevspapirservietter. Bruk bare et 0-dagers egg, da eldre egg kanskje ikke gir opphav til et embryo.
- Skriv gjeldende dato på egg med en OHP-markør.
- Legg eggene i en egginkubator satt til en temperatur på 36-37 °C og et fuktighetsnivå på 60%-65%. Inkuber eggene i de neste 24 timer.
3. Dag 2
- Ordne nødvendig utstyr for tilbaketrekking av 5-6 ml albumin (saks med skarp kant, 5 ml sprøyte, 18 G nål, sprøytekaster og tape).
- Tørk av den kirurgiske saksen med 70% etanol eller steriliser ved hjelp av en autoklav etter å ha tørket dem med 70% etanol.
- Ta nå egget fra 37 °C egginkubatoren for lagdeling.
- Legg egget på et rent eggstativ.
- Fest et lite stykke tape (størrelse: ca 1-tommers lengde x bredde) til eggets kant.
- Lag et lite hull i kanten av eggeskallet ved hjelp av skarp spiss kant saks. Sett inn en 5 ml sprøyte i en omtrentlig vinkel på 75°.
MERK: 5 ml sprøyte leveres med en 24 G x 1 kanyle (steril), men det er godt å erstatte 24 G x 1 kanylen med en 18 G x 1,5 nål (steril). 18 G x 1,5 kanylen har en bredde på 1,25 x 38 mm. Derfor vil det lette fjerningen av albumin. - Etter å ha satt nålen inn i eggeplommesekken, trekker du sakte ut 5-6 ml albumin.
MERK: Dette gir embryoet en seng som det kan vokse på. Tilbaketrekking av albumin forhindrer overspill av albumin mens du oppretter et vindu. Til slutt reduseres risikoen for at embryoet blir skadet under vindu ved å eliminere 5-6 ml albumin. - Etter å ha fjernet albuminet, reseal åpningen med tape og la eggene inkubere ved 37 °C i 48 timer.
4. Dag 4
- Klargjør Ringetelefonens løsning, 0,9 % normal saltløsning og 1x PBS som beskrevet i avsnitt 1 i protokollen. Deretter autoklaverer du de tre løsningene. Etter autoklavering, plasser den respektive løsningen ved romtemperatur.
- Ta ut egget fra egginkubatoren på 37 °C og skjær skallet i sirkulær form. Før du kutter eggeskallet, dekk området som skal kuttes med tape.
MERK: Å dekke vindusområdet med tape forhindrer brudd på eggeskallet på uønskede steder. Men hvis du bryter deg inn på et uønsket sted, forsegler du området med tape. Å dekke stedene som skal kuttes med tape forhindrer at skallstykker faller på eggeplommesekken. - Lag et lite hull i eggeskallet med en skarpt spiss kant saks på stedet der vinduet er ønsket og begynn å kutte en sirkulær åpning. Denne prosessen kalles vindu.
MERK: Sørg for at det sirkulære kuttet er stort nok til å gi enkel tilgang til embryoet fra alle retninger. Endre om nødvendig eggposisjonen for å imøtekomme embryoets posisjon. - Deretter, ved hjelp av et stereozoom kirurgisk mikroskop, finn riktig vitelline arterie (RVA).
MERK: Kyllingembryoer gjennomgår vanligvis thoracic torsjon (sammen med cervical flexure, etc.) som de utvikler, slik at venstre side av hodet er mot eggeplommen på 72 h scenen. Mer kaudalt, hvor vitelline arteriene går ut av kroppen, er embryoet ikke mye vridd, og denne delen av kroppen ligger ventral side ned mot eggeplommen. Så, ser direkte, er retten til embryoet til høyre for forskeren. - Når RVA er plassert, lag to små hull på venstre og høyre side av RVA ved hjelp av en 26 G nål (figur 2).
- Plasser Doppler blodstrømsavbildningssonden over RVA. Forsikre deg om at Doppler blodstrømsavbildningssonde er plassert 5 ± 1 mm fra iskemistedet og mot den distale enden av RVA. Ta en fluxavlesning i 2 min og 30 s (eller lenger om ønskelig). Dette vil være den normoksiske faseavlesningen.
- I mellomtiden, ved hjelp av en nese tang og tannede tang, manuelt forme spinal nålens kant i form av en krok (figur 3). Gjør dette ved å bøye kanten av ryggnålen i ca. 1 mm. En større størrelse vil gjøre det vanskeligere å sette inn og fjerne ryggnålen under I / R-prosedyren.
- Sett inn ryggnålen rett under høyre vitelline arterie ved hjelp av en mikromanipulator.
MERK: Sett inn ryggnålen med stor forsiktighet for å unngå å skade RVA eller tilstøtende arterier. Den optimale teknikken er å justere spinalnålens spesialdesignede krok nøyaktig over høyre side av RVA-hullet, etterfulgt av gradvis å sette inn spinalnålens spesialdesignede kant i eggeplommesekken ved hjelp av en mikromanipulator under veiledning av et stereozoomkirurgisk mikroskop gjennom høyre hull. Når ryggnålens krok er i eggeplommesekken, justerer du gradvis kroken under RVA slik at kanten er nøyaktig plassert under venstre hull. Nå er det på tide å løfte ryggnålen. - Nå, ved hjelp av mikromanipulatoren, løft arterien gradvis til Doppler-blodstrømsstrømmen indikerer en minimal reduksjon på 80% i arteriell strømning.
- Når en nedtrekk på 80% eller mer i Doppler flux er oppnådd, la spinal nålen løftes (trekker arterien oppover) i 5 min. Dette vil være perioden med iskemi i RVA.
MERK: Det er viktig å overvåke Doppler-fluxen under iskemiens varighet. Hvis det blir funnet en betydelig mengde svingninger, avslutter du testene. - Etter 5 min iskemi perioden, gradvis slippe arterien for å gjenopprette normale blodstrøm nivåer. Forsikre deg om at en Doppler blodstrømsmåleravlesning viser verdier som kan sammenlignes med de som oppnås under normoksia. Dette vil være reperfusjonsperioden i RVA (figur 4).
- Etter I / R-prosedyren, bruk noen dråper (2-3) 1x PBS på embryoet og se det i 2-3 min.
MERK: Bruk av 1x PBS bidrar til å forhindre at embryoet tørker ut. - Til slutt, reseal vinduet med tape og legg egget tilbake i egginkubatoren i 5 timer og 55 min.
- Etter 5 timer og 55 min, ta egget fra egginkubatoren, plasser det på eggstativet, åpne vinduet igjen og følg nedstrøms behandlingsprotokollen.
5. Behandlinger
- For behandling av arteriene med legemidler, aktivatorer eller inhibitorer, sluk RVA etter 1 t i I / R-prosessen.
- For nedstrømsstudiene må du først fjerne embryoet fra eggeskallet ved å plassere det på en steril 90 mm Petri-tallerken.
- Når embryoet slippes ut i Petri-parabolen, eksisiserer du RVA ved hjelp av okulær iris under veiledning av et stereozoom kirurgisk mikroskop.
- Påse at eksisjonsdimensjonen til RVA er opptil 15 ± 1 mm (distal fra stammen), 5 ± 1 mm hver på venstre og høyre side av arterien, og 2 ± 1 mm mot stammen.
MERK: En linjal kan brukes til å måle området som skal utskilles (valgfritt). - Etter å ha utskilt RVA, vask den med 1x PBS i en steril Petri-tallerken som inneholder 1x PBS.
- For de ønskede behandlingene, plasser arterien i et 1,5 ml sentrifugerør (sterilisert) fylt med 500 μL ringers løsning. Plasser RVA i sentrifugerøret og legg det i en 37 °C inkubator i 5 timer og 55 min.
MERK: Avhengig av behandlingene, bruk enten Ringers løsning uten behandling, eller behandling med ønsket volum og konsentrasjon av stoff, aktivator eller hemmer. - Etter 5 timer og 55 min inkubasjon, ta ut RVA fra 37 °C laboratorieinkubatoren, og fortsett med de ønskede behandlingene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doppler Blood Flow Imaging-teknikken ble brukt til å evaluere effektiviteten av modellen vår. Kort sagt sammenlignet vi dataene fra kontrollgruppen med dataene fra RVA-gruppen for å fastslå suksessen til opprettelsen vår. Figur 4A viser en typisk flux assosiert med kontrolldyret, mens figur 4B skildrer resultatene hentet fra en RVA. Den numeriske 1-8 representerer de ulike hendelsene knyttet til I/R-faser. Kort fortalt tilsvarer numerisk 1-3 fasen av normoksia, mens en kraftig nedgang i flux ved punkt 3 og 4 representerer hendelsene forbundet med reduksjonen i blodstrømmen i RVA. Når en 80% eller større nedtrekk hadde blitt oppnådd, ble RVA igjen hevet i de neste 5 min. Dette var fasen av iskemi (numerisk 4-5). Etter en 5 min løfting av RVA ble RVA utgitt, som er representert av numerisk 6 og 7. Fluksen fra punkt 7 og fremover representerer reperfusjonsfasen, som oppstår etter at RVA har oppnådd normale blodstrømsnivåer, som var fasen av reperfusjon. Dette spesielle eksperimentet viste effektiviteten av I / R-modellering i det 3-dagers utviklede kyllingembryoet.
For å verifisere nytten av modellen vår, har vi studert uttrykksmønstrene til proteiner, RNA og DNA gjennom ELISA, vestlig blotting, qRT-PCR og gelelektroforeseanalyse. Kort fortalt delte vi de 3-dagers utviklede eggene inn i tre eksperimentelle grupper: kontroll, I / R og Behandlinger + I / R. Det ble observert en signifikant forskjell i uttrykk for proteiner, gener og DNA-integritet mellom deres respektive I/R og kontrollgrupper. Som beskrevet nedenfor forbedret legemiddelbehandlingen til I/R-gruppen effektivt utfallet som ble observert i denne gruppen sammenlignet med den I/R-behandlede gruppen alene; Dette er i samsvar med vår tidligere publikasjon som denne protokollen er basert på1. Standard laboratorieprosedyrer ble fulgt for ELISA18, vestlig blotting19, qRT-PCR20 og gelelektroforese21, som ikke er dekket i dette dokumentet (figur 5, figur 6, figur 7, figur 8).
Iskemireperfusjon stimulerer flere prosesser, inkludert dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS) som er skadelige for vev. De skadelige effektene forårsaket av de iboende antioksidant kroppsforsvarssystemenes respons på ROS er et viktig trekk ved I / R-skade. Vi undersøkte aktivitetene til oksygenregulatoriske proteiner 150 (ORP150), cytoplasmatisk superoksiddismutase 1 (SOD1) og katalase i iskemiske kar. Sammenlignet med kontrollgruppen forhøyet I/R aktiviteten til ORP150, cytoplasmatisk SOD1 og katalase (figur 5A-C). Imidlertid reduserte tilskudd med N-Acetyl-L-Cysteine (NAC), en ROS-quencher, I/R-gruppens oksidative stress.
For å vurdere modellens inflammatoriske potensial brukte vi ELISA til å undersøke IL-1β og TNF-α uttrykk (figur 6). Begge interleukins ble overekspressert i I/R-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen, noe som indikerer at modellen vår har potensial til å bli brukt i inflammatoriske undersøkelser. Deretter testet vi uttrykket av nod-lignende reseptor pyrin domeneholdig protein 3 (NLRP3) inflammasome pathway22,23, og proinflammatorisk molekyl, NF-kβ24,25, som er involvert i å forsterke betennelse, for å bekrefte nytten av denne modellen for inflammatoriske studier. Som svar på I/R generert i RVA fant denne undersøkelsen bevis for aktivering av NLRP3-inflammasomet (figur 7A), samt NF-kβ (figur 7B). Imidlertid ble behandling med Naringenin, et kjent antiinflammatorisk stoff, ameliorated de inflammatoriske effektene, som observert i de legemiddelbehandlede gruppene.
Iskemi-reperfusjon aktiverer programmerte celledødsveier26,27,28. Vi studerte effekten av I/R på apoptose og autofagiveier i kyllingembryoet. Figur 8A viser effekten av I/R på caspase-3 og zVAD-fmk. Figur 8B-D viser at I/R-gruppen hadde høyere uttrykk for LC3II samt LC3II/I-forholdet (autofagosommarkør), Beclin1 (en betydelig regulator av autofagi i pattedyrceller) og Atg7 (nødvendig for basal autofagi) enn kontrollgruppen, henholdsvis på proteinnivå. Figur 8E viser derimot effekten av I/R på mRNA-nivåer. Tilsetningen av 3-MA, en autofagihemmer, reverserte imidlertid resultatene. Disse funnene tyder på at modellen kan brukes til å undersøke ulike celledødsprosesser (f.eks. nekrose). Figur 9 viser hvor effektivt endringene på DNA-nivå kan studeres ved hjelp av vår Hook-I/R-modell.
Til slutt sammenligner vi resultatene fra Hook-I / R-modellen og den midterste cerebral arterie okklusjonsmodellen (MCAO) for å se hvor effektiv modellen vår er i forhold til andre modeller. For å oppsummere hadde I/R-behandlede RVAer høyere nivåer av apoptotisk proteinklynget kaspase-3, autofagiproteinene Beclin1 og Atg7, og de inflammatoriske interleukins TNF-α og IFN-Ƴ enn kontroll RVAs. Interessant, enten det var å analysere inflammatorisk stress eller cellulære dødsveier, produserte Hook-I / R-modellen resultater som var ekstremt lik de som ble oppnådd av MCAO-modellen (figur 10).
Figur 1: Et skjematisk diagram over et typisk oppsett av Hook-I/R chick embryo ischemia-reperfusion-modellen. Bildet viser kravene til Hook-I/R chick embryo iskemi-reperfusjonseksperimentering, for eksempel stereozoom kirurgisk mikroskop, laser Doppler blodstrømsmåler, mikromanipulator, spinal nål, 72 h utviklede kyllingembryoer og en belysningskilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativt bilde av et 3-dagers kyllingembryoutstillingssted for okklusjon og område av vevseksisjon. (A) Trekanten viser plasseringen av eksisjon av vevet for vestlig blotting, RNA og DNA-isolasjon. Stjernen og prikkene representerer okklusjonens sted og hullene som er opprettet på venstre og høyre side av RVA for å sette inn nålen under arterien for å løfte den, henholdsvis. Et forstørret bilde av vevsutvinningsområdet er også gitt sammen med det. Notasjonen A representerer øyet, B representerer hjertet, C representerer venstre for vitelline arterien, og C ' representerer høyre for vitelline arterien. (B) En skjematisk representasjon av høyre side av kyllingembryoet demonstrerer området vevseksisjon i nærheten av RVA. Den rette linjen representerer RVA som kommer ut av embryostammen. Stjernen på den vertikale linjen symboliserer posisjonen til Laser Doppler blodstrømssonde. Skjæringspunktet angir okklusjonsstedet. Eksisjon av arteriene ble gjort opptil 15 ± 1 mm (distal fra stammen), 5 ± 1 mm hver på venstre og høyre side av arterien, og 2 ± 1 mm mot stammen. Alle målingene viser avstander fra okklusjonsstedet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt bilde av en ryggnål med en skreddersydd krok. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representasjon av et typisk Laser Doppler blodstrømsmålersignal. Et typisk Laser Doppler blodstrømningsmålersignal ble målt på en 3-dagers kyllingembryoarterie fra et kontrollgruppeegg (A). Hendelser ved baseline (1), under normoksia (2), umiddelbar forhåndsløfting av RVA (3), umiddelbar etter løfting av RVA (4), under iskemi (5), umiddelbar forhåndsutgivelse av RVA (6), umiddelbar postreperfusjon (7), under reperfusjon (8) i den iskemibehandlede gruppen som er registrert av Laser Doppler blodstrømsmåler (B). Dette tallet ble vedtatt fra Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; under cc-by lisens)1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekt av iskemireperfusjon på uttrykket av oksidative stressmarkørproteiner. Vestlig blotting ble brukt til å bestemme ORP150-, SOD1- og kataseuttrykksnivåene. (A) ORP150-uttrykket ble økt etter I/R-skade. NAC, en pan-ROS-hemmer, senket ORP150 til et nivå som kan sammenlignes med kontroll. (B) Etter I/R ble SOD1-uttrykket hevet. SOD1-uttrykket ble også redusert etter NAC-behandling. (C) I/R-hendelsen induserte uttrykket katasase. RVA behandlet med I/R og eksponert for NAC viste en nedgang i katasenivåer. GAPDH (A, C) og β-Actin (B) ble brukt som interne kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Estimering av IL-1β og TNF-α ved bruk av ELISA. ELISA ble brukt til å kvantifisere IL-1β og TNF-α, og resultatene viste at det var en økning i IL-1β og TNF-α uttrykk, som ble dempet av tillegg av Naringenin. For denne studien ble ANOVA etterfulgt av Newman-Keuls-testen brukt. Feilfelt representerer middelverdi ± SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Effekt av iskemireperfusjon på uttrykk for betennelsesmarkørproteiner. (A) I/R-behandling resulterte i økt uttrykk for NLRP3. Inkubasjon av I/R behandlet RVA med Naringenin reduserte uttrykket av NLRP3. (B) I likhet med NLRP3 ble uttrykket for NF-kβ også økt etter I/R-behandling. Behandlingen av Naringenin reduserte uttrykket av NF-kβ. GAPDH ble brukt som internkontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Effekt av iskemirefusjon på apoptotisk og autofagisk status for RVA-celler. (A) For å utforske induksjonen av apoptose ved I/R-prosessen ble uttrykket for spaltet kaspase 3 evaluert ved hjelp av vestlig blotting. Etter I/R-skade ble nivået av cleaved caspase 3 økt. Behandling med zVAD-fmk, en apoptosehemmer, redusert kassett 3 uttrykk. (BD) Uttrykket for LC3II/I, Beclin1 og Atg7 ble bestemt for å evaluere induksjonen av autofagi etter I/R. Etter I/R økte uttrykket for alle autofagiske markører, mens eksponeringen av I/R-behandlet RVA til autofagihemmeren 3-MA reduserte uttrykket av alle proteiner til kontrollnivåer. Som internkontroll ble GAPDH brukt. (E) qRT-PCR ble brukt til å bekrefte induksjonen av autofagi og bestemme ambra1- og Atg7 mRNA-uttrykksnivåene. Begge genene viste en betydelig økning i uttrykk i I/R-gruppen sammenlignet med kontroll, som ble restaurert til nesten normale nivåer etter NAC-behandling. GAPDH ble brukt som internkontroll for qRT-PCR-eksperimenter. For eksperiment (E) ble ANOVA, etterfulgt av Newman-Keuls-testen, brukt. Feilfelt representerer middelverdi ± SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Effekt av iskemireperfusjon på DNA-skade. For å finne ut om I/R induserer DNA-nicks, undersøkte vi DNA-skade ved hjelp av gelelektroforese. I/R resulterte i genomisk DNA-nedbrytning, som vist ved smøring i I/R-prøven. NAC-behandling av I/R-skadet RVA reduserte DNA-skaden. En 1 kb DNA-stige ble ansatt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Sammenligning av Hook-I/R-modellen sammenlignet med MCAO-modellen. Det ble gjort en sammenligning mellom dataene som genereres av Hook-I/R-modellen og dataene som genereres av MCAO-modellen. (A) Uttrykket av apoptotisk protein caspase-3 og autofagiproteinene Beclin1 og Atg7 var høyere i I/R-behandlede RVAer sammenlignet med uttrykket av de samme proteinene i kontroll-PPA-er, som var i samsvar med funnene oppnådd i MCAO-forsøkene. (B) TNF-α- og IFN-Ƴ nivåer ble funnet å være forhøyet i både RVA- og MCAO-gruppene sammenlignet med deres respektive kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på materiale/utstyr | Konsentrasjon | Autoklav | Lagring | ||
| Reagenser for Ringers løsning | |||||
| Natriumklorid | 123 mM | ||||
| Kaliumklorid | 4,96 mM | ||||
| Kalsiumklorid | 1,53 mM | ||||
| Sterilt destillert vann | 100 ml | ||||
| Ph | 7.4 | 15 min ved 121 °C | R.T. | ||
| Reagenser for 0,9% normal saltvann | |||||
| Natriumklorid | 154mM | ||||
| Sterilt destillert vann | 100 ml | ||||
| Ph | 7.4 | 15 min ved 121 °C | R.T. | ||
| Reagenser for 70% etanol | |||||
| 70% etanol | 70 ml | ||||
| Sterilt destillert vann | 30 ml | Ikke nødvendig | R.T. | ||
| Reagenser for 1x fosfatbuffer saltvann | |||||
| Natriumklorid | 136,8 mM | ||||
| Kaliumklorid | 26,8 mM | ||||
| Kaliumfosfat monobasisk vannfri | 14,6 mM | ||||
| di-Natrium hydrogenfosfat heptahydrat | 5,37 mM | ||||
| Sterilt destillert vann | 100 ml | 15 min ved 121 °C | R.T. | ||
Tabell 1: Oppskrift på løsninger som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med iskemi-reperfusjonsforskning er å lage terapeutiske strategier som forhindrer celledød og fremmer utvinning29,30. For å overvinne nåværende begrensninger i I / R-forskning designet vi en Hook I / R chick embryo-modell for å produsere en pålitelig og reproduserbar I / R-modell. Så vidt vi vet er vår den første I/R-modellen som noen gang er laget i et 3-dagers kyllingembryo for rutinemessige I/R-eksperimenter, i tillegg til å studere stresssignaler (f.eks. oksidativt og inflammatorisk stress). Gitt fordelene med størrelse og tilgjengelighet på dag 3 av utvikling31, ble kyllingembryoen brukt på et utviklingsstadium på 72 timer, på grunn av modellens høye effekt, enkelhet å ansette og tilpasningsevne for rutinemessig analyse32. Kort sagt, på utviklingsdag 3 er in ovo chick en svært kontrollert, men likevel tilgjengelig og rimelig gjennomsiktig modell i egget som kan brukes til å visualisere normal fysiologi, sykdomspatologi og effekten av eksperimentell behandling. Den enorme størrelsen gjør det spesielt nyttig for å studere dannelsen og oppførselen til embryoet under normal fysiologi samt stress33. Selv om eldre kyllingembryoer (de som inkuberes i 4 dager eller lenger) kan brukes, og vi prøvde et senere tidspunkt, er bruken av eldre embryoer som modellsystemer sterkt begrenset av det faktum at eggeplommesekken vokser så tykk utover 3 dager med utvikling at kirurgiske prosedyrer er vanskelige. Det er bemerkelsesverdig å nevne at mens RVA ikke er fullt dannet på et tidlig tidspunkt (si på dag 1 eller 2), kan vindu føre til teratogenisitet34. Foruten begrensningene knyttet til et tidlig eller sen tidspunkt for utvikling, fungerer et 72 h kyllingembryo som en ideell modell for å undersøke I / R-prosessen siden 3-dagers kyllingembryoer har et veldefinert sirkulasjonssystem30.
Å forstå patofysiologien til I/R-skade er et hovedmål med å designe en I/R-modell. For tiden er det ikke noen klinisk nyttig terapeutisk for å redusere iskemi-reperfusjonsskade1,35. Som et resultat har et bredt spekter av in vitro- og in vivo-modeller blitt foreslått. I denne sammenhengen ble I / R-modellering i et 3-dagers utviklende kyllingembryo i ovo foreslått for første gang. Tidligere forskning har vist at okklusjon-reperfusjon av arteriell blodstrøm forårsaker patologiske endringer i eksperimentelle modeller som ligner de som er sett hos mennesker36,37,38, så vi håpet at vår modell ville gjøre det samme (slik oksidativt og inflammatorisk stress observert i in vivo-modeller eller hos pasienter). Med funnene i studien vår ble ovennevnte hypotese vist å være riktig.
Blodsirkulasjonen fra embryoer til eggeplommesekken styres av vitelline-kar i kyllingembryoer39. Embryoer får næringsstoffer fra eggeplommen og diffus oksygen fra luften via vitelline sirkulasjon; dermed begrense noen av vitelline fartøyene som kan forstyrre ernæring og oksygenoverføring. Basert på disse fakta ble iskemi indusert ved å okkludere blodtilførselen til RVA i 5 min, etterfulgt av reperfusjon i ytterligere 5 timer og 55 minutter. Den foreslåtte modellen kan brukes til å undersøke en rekke ulike sykdomsprosesser knyttet til I/R og teste en rekke legemidler og deres mål. Den nåværende modellen kan brukes til å undersøke endringer i DNA, RNA og proteiner. Det har potensial til å gi høy effekt. I tillegg til enkelhet og tilpasningsevne for regelmessig analyse, kan modellen også undersøke kortsiktig stamcelle-homing, som vil bli undersøkt i fremtidige studier.
Sammenlignet med in vitro-modeller er modellen vår enkel å bruke, kostnadseffektiv og vokser raskt, i tillegg til å være etisk uskyldig32. Tilstedeværelsen av mikrovaskulatur, immunsystemet og fysiologiske vurderinger er alle fordeler i forhold til in vitro-modeller, mens lave kostnader, tidseffektivitet og ingen etiske problemer er fordeler i forhold til in vivo-modeller40. Fordelene ovenfor indikerer at modellen vår har en sammenlignbar effekt med de andre I/R-modellene som er i bruk (figur 10). En potensiell mangel er dagens modells manglende evne til å kvantifisere det infarktområdet. Direkte infarktvurdering kan være en verdifull biomarkør for I/R-mediert skade og en metode for kartlegging av effektene av ulike terapimedisiner. Dermed forsøkte vi å kvantifisere det infarktområdet, men kunne ikke gjøre det på grunn av den delikate strukturen til de 72 h-utviklede kyllingene. Det kreves derfor ytterligere forskning for å vurdere strategiene og veiene for I/R-prosesser grundig.
For å oppsummere kan den nåværende modellen brukes til å undersøke ulike sykdomsveier knyttet til I / R og screene en rekke stoffer og deres mål. På grunn av den høye reproduserbarheten, kostnadseffektiviteten og enkelheten, forventer vi at modellen vår vil være en verdifull ressurs for grunnleggende vitenskap og translasjonell forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker å uttrykke vår takknemlighet til Hari Shankar for hans kritiske innspill under videografi og redigering, Mr. Baqer Hussain for voice-over, Mr. Asghar Rizvi for videoredigering, Mr. Mohammad Haider for videoopptak, Mr. Mohammad Danish Siddiqui for hjelp under forsøkene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
