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Biology

हुक Ischemia-Reperfusion मॉडल की पीढ़ी एक तीन दिवसीय विकासशील लड़की भ्रूण का उपयोग कर

Published: February 19, 2022 doi: 10.3791/63288
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 2, 1,3
1Laboratory for Stem Cell and Restorative Neurology, Department of Biotechnology, Era’s Lucknow Medical College Hospital, Era University, 2Era University, 3Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Era University
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर इस्केमिया-reperfusion (I / R) मॉडलिंग का वर्णन करता है एक 3-दिवसीय चिक भ्रूण में एक रीढ़ की हड्डी की सुई अनुकूलित हुक का उपयोग करके आई / आर विकास और उपचार को बेहतर ढंग से समझने के लिए। यह मॉडल सरल, त्वरित और सस्ता है।

Abstract

Ischemia और reperfusion (I / R) विकार, जैसे मायोकार्डियल रोधगलन, स्ट्रोक और परिधीय संवहनी रोग, बीमारी और मृत्यु के कुछ प्रमुख कारण हैं। कई इन विट्रो और इन विवो मॉडल वर्तमान में बीमारी या क्षतिग्रस्त ऊतकों में आई / आर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, आज तक, ओवो आई / आर मॉडल में कोई रिपोर्ट नहीं किया गया है, जो आई / आर तंत्र और तेजी से दवा स्क्रीनिंग की बेहतर समझ के लिए अनुमति देगा। यह पेपर आई / आर मॉडलिंग का वर्णन करता है जो आई / आर विकास और उपचार तंत्र को समझने के लिए 3-दिवसीय चूजे के भ्रूण में एक रीढ़ की हड्डी की सुई अनुकूलित हुक का उपयोग करता है। हमारे मॉडल का उपयोग डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर विसंगतियों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि सरल, त्वरित और सस्ती है। वर्तमान मॉडल का उपयोग स्वतंत्र रूप से या मौजूदा इन विट्रो और विवो आई / आर मॉडल के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

Ischemia-reperfusion ऊतक की चोट को दिल के दौरे, इस्केमिक स्ट्रोक, आघात, और परिधीय संवहनी रोग 1,2,3,4,5 सहित कई विकृतियों से जोड़ा गया है। यह मुख्य रूप से रोग की प्रगति की व्यापक समझ की कमी और एक प्रभावी शोध मॉडल की कमी के कारण है। इस्केमिक चोट तब होती है जब ऊतक के एक विशिष्ट क्षेत्र में रक्त की आपूर्ति काट दी जाती है। नतीजतन, इस्केमिक ऊतक अंततः नेक्रोटाइज़ करता है, हालांकि दर ऊतक के आधार पर भिन्न होती है। इसलिए, रक्त की आपूर्ति को बहाल करने से क्षति को कम करने में मदद मिल सकती है। हालांकि, यह देखा गया है, कुछ मामलों में, कि reperfusion अकेले ischemia की तुलना में अधिक ऊतक क्षति का कारण बनता है6,7,8 करता है. इसलिए, ischemia-reperfusion के आणविक और सेलुलर तंत्र को समझना एक प्रभावी चिकित्सीय हस्तक्षेप विकसित करने के लिए आवश्यक है। वर्तमान में, आई / आर चोटों के लिए कोई प्रभावी उपचार ज्ञात नहीं है। इस असमानता ने मौजूदा समस्या 9,10,11,12,13 को संबोधित करने के लिए इन विट्रो से लेकर इन विवो मॉडल तक नए प्रयोगात्मक मॉडल के निर्माण को प्रेरित किया है।

चिक भ्रूण (गैलस गैलस डोमेस्टिकस) व्यापक रूप से अनुसंधान में उपयोग किया जाता है क्योंकि उनकी पहुंच में आसानी, नैतिक स्वीकार्यता, अपेक्षाकृत बड़े आकार (अन्य भ्रूणों की तुलना में), कम लागत और तेजी से विकास 14। हमने विकास के 72 ज पर एक चूजे के भ्रूण का उपयोग किया ताकि रीढ़ की हड्डी की सुई की सहायता से सही विटेलिन धमनी को रोककर और जारी करके ओवो आई / आर में एक बनाया जा सके। हमने इसे हुक-I/ R ischemia-reperfusion मॉडल (चित्रा 1) का नाम दिया। इस अध्ययन में उपयोग किया गया मॉडल ऑक्सीडेटिव और भड़काऊ मार्गों सहित सभी डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं का सटीक रूप से अनुकरण करने में सक्षम है, जो अक्सर आई / आर क्षति 15,16,17 से जुड़े होते हैं।

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Protocol

एरा के लखनऊ मेडिकल कॉलेज और अस्पताल में संस्थागत पशु नैतिक समिति ने एक लिखित छूट जारी की, जिसमें कहा गया है कि जानवरों पर प्रयोगों के नियंत्रण और पर्यवेक्षण के उद्देश्य के लिए समिति (सीपीसीएसईए) के अनुसार इन प्रयोगों को करने के लिए किसी औपचारिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी। तथापि, भ्रूणीय संकट की किसी भी संभावना को कम करने के लिए मानक प्रचालन प्रक्रियाओं का पालन किया गया था।

1. बफर तैयारी (तालिका 1)

  1. रिंगर का समाधान तैयार करें
    1. रिंगर के समाधान को तैयार करने के लिए, 100 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के साथ 70 मिलीलीटर में NaCl (123 mM), CaCl2 (1.53 mM) के 0.017 g, KCl के 0.037 g (4.96 mM) को 70 mL के बाँझ आसुत H2O के 70 mL में भंग करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। इसे पूरी तरह से घुलने दें और आटोक्लेव करें। फिर, एक 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, एकल-उपयोग मात्रा (लगभग 10 मिलीलीटर) में एलीकोट करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. सामान्य खारा (0.9% सोडियम क्लोराइड, NaCl) तैयार करें।
    1. बाँझ आसुत H2O के 70 mL में, NaCl (154 mM) के 0.9 ग्राम भंग। वॉल्यूम को 100 mL तक बनाएं। 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव। यदि आवश्यक हो तो 0.1 N HCl या 0.1 N NaOH के साथ pH को 7.4 पर समायोजित करें। एक 15 मिलीलीटर बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 मिलीलीटर ऐलीकोट बनाएं और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. 70% इथेनॉल (v / v) तैयार करें।
    1. 70 मिलीलीटर शुद्ध इथेनॉल (Mol. wt. 46.07 g/L) को बाँझ H2O के 30 mL में मिलाएं। आवश्यकतानुसार तैयार करें या कमरे के तापमान पर स्टोर करें। नसबंदी की कोई जरूरत नहीं है।
  4. 1x फॉस्फेट बफर खारा (1x PBS) तैयार करें।
    1. 0.144 ग्राम Na2HPO4·7H2O (5.37 mM), NaCl के 0.8 g (136.8 mM), KCl के 0.2 g (26.8 mM), 0.2 g KH2PO4 (14. 6 mM) को 70 mL आसुत जल में जोड़कर 1x PBS का 100 mL तैयार करें। भंग और 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर और आटोक्लेव के लिए मात्रा बनाते हैं। पीएच को 7.4 पर लाएं, यदि आवश्यक हो तो 0.1 N HCl या 0.1 N NaOH की कुछ बूंदों को जोड़ें। एक 15 मिलीलीटर बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 मिलीलीटर के एलीकोट बनाएं और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

2. दिन 1

  1. अंडे की नसबंदी के लिए आवश्यक सभी उपकरणों की व्यवस्था करें (70% इथेनॉल, सफाई पोंछे, एक अंडा रैक, और एक ओएचपी मार्कर)।
  2. टिश्यू पेपर वाइप्स का उपयोग करके 70% इथेनॉल के साथ 0-दिवसीय अंडे को साफ करें। केवल 0-दिवसीय अंडे का उपयोग करें, क्योंकि पुराने अंडे भ्रूण को जन्म नहीं दे सकते हैं।
  3. एक OHP मार्कर के साथ अंडे पर वर्तमान तिथि लिखें।
  4. अंडे को 36-37 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 60% -65% के आर्द्रता स्तर पर सेट किए गए अंडे इनक्यूबेटर में रखें। अगले 24 घंटे के लिए अंडे को इनक्यूबेट करें।

3. दिन 2

  1. एल्ब्यूमिन के 5-6 मिलीलीटर (तेज किनारे कैंची, 5 एमएल सिरिंज, 18 जी सुई, सिरिंज त्यागने वाला, और चिपकने वाला टेप) की वापसी के लिए आवश्यक उपकरण ों की व्यवस्था करें।
  2. सर्जिकल कैंची को 70% इथेनॉल के साथ पोंछें या 70% इथेनॉल के साथ पोंछने के बाद एक आटोक्लेव का उपयोग करके निष्फल करें।
  3. अब लेयरिंग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस अंडे के इनक्यूबेटर से अंडे को लें।
  4. अंडे को एक साफ अंडे के रैक पर रखें।
  5. अंडे के किनारे पर चिपकने वाले टेप का एक छोटा सा टुकड़ा (आकार: लगभग 1 इंच लंबाई एक्स चौड़ाई) संलग्न करें।
  6. तेज-नुकीले किनारे कैंची का उपयोग करके अंडे के किनारे में एक छोटा सा छेद करें। 75° के अनुमानित कोण पर एक 5 mL सिरिंज डालें।
    नोट: 5 एमएल सिरिंज एक 24 जी एक्स 1 सुई (बाँझ) के साथ आता है, लेकिन 24 जी एक्स 1 सुई को 18 जी एक्स 1.5 सुई (बाँझ) के साथ बदलना अच्छा है। 18 G x 1.5 सुई चौड़ाई में 1.25 x 38 मिमी है। इसलिए, यह एल्ब्यूमिन को हटाने की सुविधा प्रदान करेगा।
  7. जर्दी थैली में सुई डालने के बाद, धीरे-धीरे एल्ब्यूमिन के 5-6 मिलीलीटर वापस ले लें।
    नोट: यह भ्रूण को एक बिस्तर प्रदान करता है जिस पर यह बढ़ सकता है। एल्ब्यूमिन को वापस लेने से विंडो स्थापित करते समय एल्ब्यूमिन के ओवरस्पिल को रोका जा सकता है। अंत में, विंडोइंग के दौरान भ्रूण के क्षतिग्रस्त होने के जोखिम को एल्ब्यूमिन के 5-6 मिलीलीटर को समाप्त करके कम किया जाता है।
  8. एल्ब्यूमिन को हटाने के बाद, चिपकने वाले टेप के साथ उद्घाटन को फिर से सील करें और अंडे को 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दें।

4. दिन 4

  1. रिंगर का समाधान, 0.9% सामान्य खारा, और 1x PBS तैयार करें जैसा कि प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 में वर्णित है। फिर, तीन समाधानों को आटोक्लेव करें। ऑटोक्लेविंग के बाद, संबंधित समाधान को कमरे के तापमान पर रखें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस अंडे के इनक्यूबेटर से अंडे को बाहर निकालें और खोल को एक परिपत्र आकार में काट लें। अंडे के गोले को काटने से पहले, चिपकने वाले टेप के साथ कटौती करने के लिए क्षेत्र को कवर करें।
    नोट: चिपकने वाला टेप के साथ खिड़की क्षेत्र को कवर करना अवांछित स्थानों में अंडे के छिलके को तोड़ने से रोकता है। हालांकि, यदि आप एक अवांछित स्थान में तोड़ते हैं, तो चिपकने वाले टेप के साथ क्षेत्र को सील करें। चिपकने वाले टेप के साथ काटे जाने वाले स्थानों को कवर करने से शेल टुकड़ों को जर्दी थैली पर गिरने से रोकता है।
  3. उस स्थान पर एक तेज नुकीले किनारे कैंची के साथ अंडे के गोले में एक छोटा सा छेद बनाएं जहां खिड़की वांछित है और एक परिपत्र उद्घाटन को काटना शुरू करें। इस प्रक्रिया को windowing के रूप में जाना जाता है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि परिपत्र कटौती किसी भी दिशा से भ्रूण के लिए आसान पहुँच की अनुमति देने के लिए पर्याप्त बड़ा है। यदि आवश्यक हो, तो भ्रूण की स्थिति को समायोजित करने के लिए अंडे की स्थिति को बदलें।
  4. इसके बाद, एक स्टीरियो ज़ूम सर्जिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सही विटेलिन धमनी (आरवीए) का पता लगाएं।
    नोट: चिकन भ्रूण आमतौर पर वक्षीय मरोड़ (गर्भाशय ग्रीवा flexure, आदि के साथ) से गुजरते हैं क्योंकि वे विकसित होते हैं, जैसे कि सिर का बाईं ओर 72 घंटे के चरण में जर्दी के खिलाफ होता है। अधिक caudally, जहां vitelline धमनियों शरीर से बाहर निकलते हैं, भ्रूण ज्यादा मुड़ नहीं है, और शरीर का यह हिस्सा जर्दी की ओर नीचे वेंट्रल पक्ष झूठ बोलता है। इसलिए, सीधे देखने पर, भ्रूण का अधिकार शोधकर्ता के दाईं ओर है।
  5. एक बार जब आरवीए स्थित हो जाता है, तो 26 जी सुई (चित्रा 2) का उपयोग करके आरवीए के बाईं और दाईं ओर दो छोटे छेद बनाएं।
  6. आरवीए के ऊपर डॉपलर रक्त प्रवाह इमेजिंग जांच रखें। सुनिश्चित करें कि डॉपलर रक्त प्रवाह इमेजिंग जांच ischemia की साइट से 5 ± 1 मिमी और आरवीए के दूरस्थ अंत की ओर रखा गया है। 2 मिनट और 30 सेकंड (या यदि वांछित हो तो अधिक समय तक) के लिए एक फ्लक्स रीडिंग लें। यह normoxic चरण पढ़ने हो जाएगा.
  7. इस बीच, एक नाक प्लायर और दांतेदार संदंश का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से रीढ़ की हड्डी की सुई के किनारे को हुक के आकार में ढालना (चित्रा 3)। लगभग 1 मिमी के लिए रीढ़ की हड्डी की सुई के किनारे को झुकाकर ऐसा करें। एक बड़ा आकार आई /आर प्रक्रिया के दौरान रीढ़ की हड्डी की सुई को सम्मिलित करना और निकालना अधिक कठिन बना देगा।
  8. एक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके सीधे दाएं विटेलिन धमनी के नीचे रीढ़ की हड्डी की सुई डालें।
    नोट: आरवीए या किसी भी आसन्न धमनियों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अत्यधिक सावधानी के साथ रीढ़ की हड्डी की सुई डालें। इष्टतम तकनीक आरवीए छेद के दाईं ओर के ठीक ऊपर रीढ़ की हड्डी की सुई के कस्टम-डिज़ाइन किए गए हुक को समायोजित करना है, इसके बाद धीरे-धीरे रीढ़ की सुई के कस्टम-डिज़ाइन किए गए किनारे को जर्दी थैली में डालने के लिए एक स्टीरियो ज़ूम सर्जिकल माइक्रोस्कोप के मार्गदर्शन में एक माइक्रोमैनिपुलेटर की सहायता से सही छेद के माध्यम से। एक बार जब रीढ़ की हड्डी की सुई का हुक जर्दी थैली में होता है, तो धीरे-धीरे आरवीए के नीचे हुक को समायोजित करें ताकि इसका किनारा बाएं छेद के नीचे बिल्कुल रखा जा सके। अब रीढ़ की सुई उठाने का समय है।
  9. अब, माइक्रोमैनिपुलेटर की सहायता से, धीरे-धीरे धमनी को तब तक उठाएं जब तक कि डॉपलर रक्त प्रवाह प्रवाह धमनी प्रवाह में 80% की न्यूनतम कमी को इंगित नहीं करता है।
  10. एक बार जब डॉपलर फ्लक्स में 80% या उससे अधिक का ड्रॉपडाउन प्राप्त हो जाता है, तो रीढ़ की हड्डी की सुई को 5 मिनट के लिए (धमनी को ऊपर की ओर खींचना) को छोड़ दें। यह आरवीए में ischemia की अवधि होगी.
    नोट: ischemia की अवधि के दौरान डॉपलर फ्लक्स की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। यदि उतार-चढ़ाव की एक महत्वपूर्ण मात्रा पाई जाती है, तो परीक्षणों को समाप्त करें।
  11. 5 मिनट ischemia अवधि के बाद, धीरे-धीरे सामान्य रक्त प्रवाह के स्तर को बहाल करने के लिए धमनी को छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि एक डॉपलर रक्त फ्लोमीटर रीडिंग नॉर्मोक्सिया के दौरान प्राप्त किए गए मूल्यों की तुलना में मूल्यों को प्रदर्शित करता है। यह आरवीए (चित्रा 4) में reperfusion की अवधि होगी।
  12. आई / आर प्रक्रिया के बाद, भ्रूण में 1x पीबीएस की कुछ बूंदें (2-3) लागू करें और इसे 2-3 मिनट के लिए देखें।
    नोट: 1x PBS का उपयोग भ्रूण को सूखने से रोकने में मदद करता है।
  13. अंत में, चिपकने वाले टेप के साथ खिड़की को फिर से सील करें और अंडे को 5 घंटे और 55 मिनट के लिए अंडे के इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  14. 5 घंटे और 55 मिनट के बाद, अंडे के इनक्यूबेटर से अंडे को लें, इसे अंडे के रैक पर रखें, खिड़की को फिर से खोलें, और डाउनस्ट्रीम उपचार प्रोटोकॉल का पालन करें।

5. उपचार

  1. दवाओं, उत्प्रेरक, या अवरोधकों के साथ धमनियों के उपचार के लिए, आई / आर प्रक्रिया के 1 घंटे के बाद आरवीए को एक्साइज करें।
  2. डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए, पहले भ्रूण को एक बाँझ 90 मिमी पेट्री डिश पर रखकर अंडे के गोले से हटा दें।
  3. एक बार भ्रूण पेट्री डिश में जारी किया जाता है, तो स्टीरियो ज़ूम सर्जिकल माइक्रोस्कोप के मार्गदर्शन में ओकुलर आईरिस का उपयोग करके आरवीए को एक्साइज करें।
  4. सुनिश्चित करें कि आरवीए का उच्छेदन आयाम 15 ± 1 मिमी (ट्रंक से डिस्टल), धमनी के बाईं और दाईं ओर 5 ± 1 मिमी प्रत्येक पर, और ट्रंक की ओर 2 ± 1 मिमी तक है।
    नोट: एक शासक का उपयोग उत्पादीकृत किए जाने वाले क्षेत्र को मापने के लिए किया जा सकता है (वैकल्पिक)।
  5. आरवीए को एक्ससाइज़ करने के बाद, इसे 1x पीबीएस युक्त बाँझ पेट्री डिश में 1x पीबीएस के साथ धो लें।
  6. वांछित उपचार के लिए, धमनी को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (निष्फल) में रखें जो रिंगर के समाधान के 500 μL से भरा हुआ है। आरवीए को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें और इसे 5 घंटे और 55 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: उपचार के आधार पर, या तो किसी भी उपचार के बिना रिंगर के समाधान का उपयोग करें, या दवा, उत्प्रेरक या अवरोधक की वांछित मात्रा और एकाग्रता के साथ उपचार करें।
  7. इनक्यूबेशन के 5 घंटे और 55 मिनट के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस प्रयोगशाला इनक्यूबेटर से आरवीए निकालें, और वांछित उपचार के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

डॉपलर रक्त प्रवाह इमेजिंग तकनीक का उपयोग हमारे मॉडल की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। संक्षेप में, हमने अपने निर्माण की सफलता को निर्धारित करने के लिए आरवीए समूह के डेटा के साथ नियंत्रण समूह के डेटा की तुलना की। चित्रा 4A नियंत्रण जानवर के साथ जुड़े एक विशिष्ट प्रवाह को दर्शाता है, जबकि चित्रा 4 बी एक आरवीए से प्राप्त परिणामों को दर्शाता है। संख्यात्मक 1-8 I/R चरणों से जुड़ी विभिन्न घटनाओं का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप में, संख्यात्मक 1-3 नॉर्मोक्सिया के चरण के अनुरूप है, जबकि बिंदु 3 और 4 पर फ्लक्स में तेज गिरावट आरवीए में रक्त प्रवाह में कमी से जुड़ी घटनाओं का प्रतिनिधित्व करती है। एक बार जब 80% या उससे अधिक ड्रॉप-डाउन प्राप्त कर लिया गया था, तो आरवीए को अगले 5 मिनट के लिए उठाया गया था। यह ischemia का चरण था (संख्यात्मक 4-5). आरवीए के 5 मिनट के उठाने के बाद, आरवीए जारी किया गया था, जिसे संख्यात्मक 6 और 7 द्वारा दर्शाया गया है। बिंदु 7 के बाद से फ्लक्स reperfusion चरण का प्रतिनिधित्व करता है, जो RVA द्वारा सामान्य रक्त प्रवाह स्तर प्राप्त करने के बाद होता है, जो reperfusion का चरण था। इस विशेष प्रयोग ने 3-दिवसीय विकसित चूजे के भ्रूण में आई / आर मॉडलिंग की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया।

हमारे मॉडल की उपयोगिता को सत्यापित करने के लिए, हमने एलिसा, पश्चिमी ब्लोटिंग, क्यूआरटी-पीसीआर और जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण के माध्यम से प्रोटीन, आरएनए और डीएनए की अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन किया है। संक्षेप में, हमने 3-दिवसीय विकसित अंडे को तीन प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित किया: नियंत्रण, आई / आर, और उपचार + आई / आर। प्रोटीन, जीन और डीएनए अखंडता की अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण अंतर उनके संबंधित आई / आर और नियंत्रण समूहों के बीच देखा गया था। जैसा कि नीचे चर्चा की गई है, आई / आर समूह के लिए दवा उपचार ने अकेले आई / आर उपचारित समूह की तुलना में इस समूह में देखे गए परिणाम में प्रभावी ढंग से सुधार किया; यह हमारे पूर्व प्रकाशन के अनुरूप है जिस पर यह प्रोटोकॉल आधारित है1. एलिसा 18, पश्चिमी ब्लोटिंग 19, क्यूआरटी-पीसीआर 20, और जेल वैद्युतकणसंचलन 21 के लिए मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का पालन किया गया था, जो इस पेपर में शामिल नहीं हैं (चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7, चित्रा 8)।

Ischemia-reperfusion कई प्रक्रियाओं को उत्तेजित करता है, जिसमें प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का गठन शामिल है जो ऊतक के लिए हानिकारक हैं। आरओएस के लिए आंतरिक एंटीऑक्सिडेंट बॉडी डिफेंस सिस्टम की प्रतिक्रिया के कारण होने वाले हानिकारक प्रभाव आई / आर चोट की एक महत्वपूर्ण विशेषता है। हमने ऑक्सीजन नियामक प्रोटीन 150 (ORP150), साइटोप्लाज्मिक सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज 1 (SOD1) और इस्केमिक जहाजों में कैटालेज की गतिविधियों की जांच की। जब नियंत्रण समूह की तुलना में, I/R ने ORP150, साइटोप्लाज्मिक SOD1, और कैटालेज (चित्रा 5A-C) की गतिविधि को बढ़ाया। हालांकि, एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन (एनएसी), एक आरओएस बुझाने वाला के साथ पूरक, आई / आर समूह के ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करता है।

हमारे मॉडल की भड़काऊ क्षमता का आकलन करने के लिए, हमने आईएल -1 और टीएनएफ-α अभिव्यक्ति (चित्रा 6) की जांच करने के लिए एलिसा का उपयोग किया। नियंत्रण समूह की तुलना में आई / आर समूह में दोनों इंटरल्यूकिन को अतिरंजित किया गया था, यह दर्शाता है कि हमारे मॉडल में भड़काऊ जांच में उपयोग करने की क्षमता है। इसके बाद, हमने एनओडी-जैसे रिसेप्टर पाइरिन डोमेन-युक्त प्रोटीन 3 (एनएलआरपी 3) की अभिव्यक्ति का परीक्षण किया, जो भड़काऊ मार्ग 22,23, और प्रो-इंफ्लेमेटरी अणु, एनएफ-के 24,25, जो सूजन को बढ़ाने में शामिल हैं, भड़काऊ अध्ययनों के लिए इस मॉडल की उपयोगिता की पुष्टि करने के लिए। आरवीए में उत्पन्न आई / आर के जवाब में, इस जांच में एनएलआरपी 3 इंफ्लेमेटरी (चित्रा 7 ए) के सक्रियण के साथ-साथ एनएफ-के π (चित्रा 7 बी) के सक्रियण का सबूत मिला। हालांकि, Naringenin के साथ उपचार, एक प्रसिद्ध विरोधी भड़काऊ दवा, भड़काऊ प्रभावों में सुधार, जैसा कि दवा-उपचारित समूहों में देखा गया है।

Ischemia-reperfusion प्रोग्राम किए गए सेल मृत्यु pathways26,27,28 को सक्रिय करता है। हमने चूजे के भ्रूण में एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी मार्गों पर आई / आर के प्रभावों का अध्ययन किया। चित्र 8A में I/R के प्रभाव को दर्शाया गया है। चित्रा 8B-D दर्शाता है कि I/R समूह में LC3II के साथ-साथ LC3II/I अनुपात (autophagosomes marker), Beclin1 (स्तनधारी कोशिकाओं में autophagy का एक महत्वपूर्ण नियामक), और Atg7 (बेसल ऑटोफैगी के लिए आवश्यक) की उच्च अभिव्यक्ति थी, क्रमशः, प्रोटीन के स्तर पर, नियंत्रण समूह की तुलना में। इसके विपरीत, चित्रा 8E एमआरएनए स्तरों पर आई / आर के प्रभाव को दर्शाता है। 3-एमए के अलावा, एक ऑटोफैगी अवरोधक, हालांकि, परिणामों को उलट दिया। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि मॉडल का उपयोग विभिन्न सेल मृत्यु प्रक्रियाओं (जैसे, नेक्रोप्टोसिस) की जांच करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 9 से पता चलता है कि डीएनए स्तर पर परिवर्तनों का हमारे हुक-आई / आर मॉडल का उपयोग करके कितनी कुशलता से अध्ययन किया जा सकता है।

अंत में, हम हुक-आई / आर मॉडल और मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) मॉडल के परिणामों की तुलना करते हैं, यह देखने के लिए कि हमारा मॉडल अन्य मॉडलों की तुलना में कितना प्रभावी है। संक्षेप में, I / R-उपचारित RVAs में एपोप्टोटिक प्रोटीन क्लीव्ड -3, ऑटोफैगी प्रोटीन Beclin1 और Atg7, और भड़काऊ इंटरल्यूकिन TNF-α और IFN-Π नियंत्रण आरवीए की तुलना में उच्च स्तर था। दिलचस्प बात यह है कि, चाहे भड़काऊ तनाव या सेलुलर मृत्यु मार्गों का विश्लेषण करते हुए, हुक-आई / आर मॉडल ने ऐसे परिणाम उत्पन्न किए जो एमसीएओ मॉडल (चित्रा 10) द्वारा प्राप्त किए गए लोगों के समान थे।

Figure 1
चित्रा 1: हुक-I/ R चिक भ्रूण ischemia-reperfusion मॉडल के एक विशिष्ट सेट-अप का एक योजनाबद्ध आरेख। तस्वीर हुक-I / R लड़की भ्रूण ischemia-reperfusion प्रयोग आवश्यकताओं, जैसे स्टीरियो ज़ूम सर्जिकल माइक्रोस्कोप, लेजर डॉपलर रक्त प्रवाहमीटर, micromanipulator, रीढ़ की हड्डी की सुई, 72 ज विकसित लड़की भ्रूण, और एक रोशनी स्रोत के रूप में से पता चलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: रोड़ा और ऊतक उच्छेदन के क्षेत्र की 3-दिवसीय चूजे के भ्रूण-प्रदर्शन स्थल की प्रतिनिधि छवि। (A) त्रिभुज पश्चिमी ब्लोटिंग, आरएनए और डीएनए अलगाव के लिए ऊतक के उच्छेदन के स्थान को दर्शाता है। स्टार और डॉट्स रोड़ा की साइट का प्रतिनिधित्व करते हैं और आरवीए के बाईं और दाईं ओर बनाए गए छेद क्रमशः इसे उठाने के लिए धमनी के नीचे सुई डालने के लिए। ऊतक निष्कर्षण के क्षेत्र की एक आवर्धित छवि भी इसके साथ प्रदान की जाती है। संकेतन A आंख का प्रतिनिधित्व करता है, B हृदय का प्रतिनिधित्व करता है, C विटेलिन धमनी के बाईं ओर का प्रतिनिधित्व करता है, और C', vitelline धमनी के दाईं ओर का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) चूजे के भ्रूण के दाईं ओर का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व आरवीए के आसपास के क्षेत्र में ऊतक उच्छेदन के क्षेत्र को दर्शाता है। सीधी रेखा भ्रूण ट्रंक से उभरने वाले आरवीए का प्रतिनिधित्व करती है। ऊर्ध्वाधर रेखा पर सितारा लेजर डॉपलर रक्त प्रवाह जांच की स्थिति का प्रतीक है। प्रतिच्छेदन रोड़ा की साइट को दर्शाता है। धमनियों का उच्छेदन 15 ± 1 मिमी (ट्रंक से डिस्टल), 5 ± 1 मिमी प्रत्येक धमनी के बाईं और दाईं ओर, और ट्रंक की ओर 2 ± 1 मिमी तक किया गया था। सभी माप रोड़ा की साइट से दूरी दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: कस्टम-निर्मित हुक के साथ रीढ़ की हड्डी की सुई का प्रतिनिधि चित्र। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक ठेठ लेजर डॉपलर रक्त फ्लोमीटर संकेत का प्रतिनिधित्व। एक विशिष्ट लेजर डॉपलर रक्त फ्लोमीटर सिग्नल को एक नियंत्रण समूह अंडे (ए) से 3-दिवसीय चिक भ्रूण धमनी पर मापा गया था। बेसलाइन (1), normoxia (2) के दौरान, RVA (3) के तत्काल पूर्व-उठाने, RVA (4) के तत्काल पोस्ट-लिफ्टिंग, ischemia (5) के दौरान, RVA (6), तत्काल पोस्ट-reperfusion (7) के तत्काल पूर्व-रिलीज, reperfusion (8) के दौरान ischemia उपचारित समूह में के दौरान के रूप में लेजर डॉपलर रक्त प्रवाहमीटर (बी) द्वारा दर्ज किया गया. इस आंकड़े को फौजिया एट अल. 2018 (फार्माकोलॉजी में फ्रंटियर्स; सीसी-बीवाई लाइसेंस के तहत) से अपनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ऑक्सीडेटिव तनाव मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर ischemia-reperfusion का प्रभाव। पश्चिमी ब्लोटिंग का उपयोग ORP150, SOD1, और catalase अभिव्यक्ति स्तरों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। (ए) ओआरपी 150 अभिव्यक्ति आई / आर क्षति के बाद बढ़ गई थी। एनएसी, एक पैन-आरओएस अवरोधक, ने ORP150 को नियंत्रण के बराबर स्तर तक कम कर दिया। (बी) आई / आर के बाद, एसओडी 1 अभिव्यक्ति को ऊंचा किया गया था। एनएसी उपचार के बाद एसओडी 1 अभिव्यक्ति भी कम हो गई थी। (C) I/R घटना ने कैटालेज की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। आरवीए को आई / आर के साथ इलाज किया गया और एनएसी के संपर्क में आने से कैटालेज के स्तर में कमी देखी गई। GAPDH (A, C) और β-Actin (B) का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एलिसा का उपयोग करके आईएल -1 और टीएनएफ -α का अनुमान। एलिसा का उपयोग आईएल -1 और टीएनएफ -α को मापने के लिए किया गया था, और परिणामों से पता चला कि आईएल -1 और टीएनएफ -α अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी, जिसे नारिंगेनिन के अलावा से कम किया गया था। इस अध्ययन के लिए, न्यूमैन-क्यूल्स परीक्षण के बाद एनोवा लागू किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± SD, n = 3 का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: सूजन मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर ischemia-reperfusion का प्रभाव. (A) I / R उपचार के परिणामस्वरूप NLRP3 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। इनक्यूबेशन I/R ने नारिंगेनिन के साथ RVA का इलाज किया, NLRP3 की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। (बी) एनएलआरपी 3 के समान, आई / आर उपचार के बाद एनएफ-के π की अभिव्यक्ति में भी वृद्धि हुई थी। Naringenin के उपचार NF-k की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। GAPDH एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: आरवीए कोशिकाओं की एपोप्टोटिक और ऑटोफैजिक स्थिति पर इस्केमिया-reperfusion का प्रभाव। (A) I / R प्रक्रिया द्वारा एपोप्टोसिस के प्रेरण का पता लगाने के लिए, पश्चिमी ब्लोटिंग का उपयोग करके क्लीव्ड 3 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया था। I/R क्षति के बाद, क्लीव्ड 3 के स्तर में वृद्धि हुई थी। हालांकि, zVAD-fmk, एक एपोप्टोसिस अवरोधक के साथ उपचार, cleaved 3 अभिव्यक्ति में कमी आई। (B-D) I/R के बाद Autophagy के प्रेरण का मूल्यांकन करने के लिए, LC3II/I, Beclin1, और Atg7 की अभिव्यक्ति निर्धारित की गई थी। आई / आर के बाद, सभी ऑटोफैजिक मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जबकि ऑटोफैगी अवरोधक 3-एमए के लिए आई / आर-उपचारित आरवीए के संपर्क ने स्तरों को नियंत्रित करने के लिए सभी प्रोटीनों की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में, GAPDH का उपयोग किया गया था। (ई) क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग ऑटोफैगी के प्रेरण की पुष्टि करने और एम्ब्रा 1 और एटीजी 7 एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया गया था। दोनों जीनों ने नियंत्रण की तुलना में आई / आर समूह में अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि दिखाई, जिसे एनएसी थेरेपी के बाद लगभग सामान्य स्तर पर बहाल किया गया था। GAPDH का उपयोग QRT-PCR प्रयोगों के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था। प्रयोग (ई) के लिए, एनोवा, न्यूमैन-केल्स परीक्षण के बाद, लागू किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± SD, n = 3 का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: डीएनए क्षति पर ischemia-reperfusion का प्रभाव। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आई / आर डीएनए निक्स को प्रेरित करता है, हमने जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके डीएनए क्षति की जांच की। I/R के परिणामस्वरूप जीनोमिक डीएनए गिरावट हुई, जैसा कि I/R नमूने में स्मीयरिंग द्वारा दिखाया गया है। आई / आर-क्षतिग्रस्त आरवीए की एनएसी थेरेपी ने डीएनए क्षति को कम कर दिया। एक 1 केबी डीएनए सीढ़ी नियोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: हुक-I/ R मॉडल बनाम MCAO मॉडल की तुलना। हुक-आई/आर मॉडल द्वारा उत्पन्न डेटा और एमसीएओ मॉडल द्वारा उत्पन्न डेटा के बीच तुलना की गई थी। (ए) एपोप्टोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति -3 और ऑटोफैगी प्रोटीन बेक्लिं 1 और एटीजी 7 नियंत्रण आरवीए में एक ही प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तुलना में आई / आर उपचारित आरवीए में अधिक थी, जो एमसीएओ प्रयोगों में प्राप्त निष्कर्षों के साथ समझौते में थी। (बी) टीएनएफ-α और आईएफएन-0 दोनों समूहों में उनके संबंधित नियंत्रणों की तुलना में आरवीए और एमसीएओ दोनों समूहों में ऊंचा पाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सामग्री / उपकरण का नाम एकाग्रता आटोक्लेव गोदाम
रिंगर के समाधान के लिए अभिकर्मक
सोडियम क्लोराइड 123 mM
पोटेशियम क्लोराइड 4.96 mM
कैल्शियम क्लोराइड 1.53 mM
बाँझ आसुत जल 100 mL
पीएच 7.4 121 °C पर 15 मिनट आर.टी.
0.9% सामान्य खारा के लिए अभिकर्मकों
सोडियम क्लोराइड 154mM
बाँझ आसुत जल 100 mL
पीएच 7.4 121 °C पर 15 मिनट आर.टी.
70% इथेनॉल के लिए अभिकर्मक
70% इथेनॉल 70 mL
बाँझ आसुत जल 30 mL आवश्यक नहीं है आर.टी.
1x फॉस्फेट बफर खारा के लिए अभिकर्मकों
सोडियम क्लोराइड 136.8 mM
पोटेशियम क्लोराइड 26.8 mM
पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक निर्जल 14.6 mM
डाइ-सोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट हेप्टाहाइड्रेट 5.37 mM
बाँझ आसुत जल 100 mL 121 °C पर 15 मिनट आर.टी.

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले समाधानों का नुस्खा।

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Discussion

ischemia-reperfusion अनुसंधान का लक्ष्य चिकित्सीय रणनीतियों है कि सेल मौत को रोकने और वसूली को बढ़ावा देने के लिए 29,30 बनाने के लिए है। आई / आर अनुसंधान में वर्तमान बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने एक विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य आई / आर मॉडल का उत्पादन करने के लिए एक हुक आई / आर चिक भ्रूण मॉडल तैयार किया है। हमारे ज्ञान के लिए, हमारा पहला आई / आर मॉडल है जो तनाव संकेतों (जैसे, ऑक्सीडेटिव और भड़काऊ तनाव) का अध्ययन करने के अलावा, नियमित आई / आर प्रयोगों के लिए 3-दिवसीय लड़की भ्रूण में बनाया गया है। विकास 31 के दिन 3 पर आकार और पहुंच के लाभों को देखते हुए, चूजे के भ्रूण का उपयोग 72 घंटे के विकासात्मक चरण में किया गया था, क्योंकि मॉडल के उच्च आउटपुट, रोजगार के लिए सादगी, और नियमित विश्लेषण के लिए अनुकूलन क्षमता 32। संक्षेप में, विकास के दिन 3 में, ओवो चिक अंडे के भीतर एक अत्यधिक नियंत्रित, अभी तक सुलभ और यथोचित पारदर्शी मॉडल है जिसका उपयोग सामान्य शरीर विज्ञान, रोग विकृति और प्रयोगात्मक उपचार के प्रभावों की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। इसका विशाल आकार इसे सामान्य शरीर विज्ञान के दौरान भ्रूण के गठन और व्यवहार के साथ-साथ तनाव 33 का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाता है। यद्यपि पुराने चूजे भ्रूण (जो 4 दिनों या उससे अधिक समय तक इनक्यूबेट किए जाते हैं) को नियोजित किया जा सकता है, और हमने बाद के समय-बिंदु की कोशिश की, मॉडल सिस्टम के रूप में पुराने भ्रूण का उपयोग इस तथ्य से गंभीर रूप से सीमित है कि जर्दी की थैली विकास के 3 दिनों से परे इतनी मोटी हो जाती है कि सर्जिकल प्रक्रियाएं मुश्किल हैं। यह उल्लेख करने योग्य है कि जबकि आरवीए पूरी तरह से शुरुआती समय की खिड़की पर नहीं बनता है (जैसे, दिन 1 या 2 पर), विंडोइंग टेराटोजेनिकिटी 34 का कारण बन सकता है। विकास के शुरुआती या देर से समय बिंदु से जुड़ी सीमाओं के अलावा, एक 72 एच चिक भ्रूण आई / आर प्रक्रिया पर शोध करने के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में कार्य करता है क्योंकि 3-दिवसीय चूजे भ्रूण में एक अच्छी तरह से परिभाषित परिसंचरण प्रणाली 30 होती है।

आई / आर चोट के पैथोफिजियोलॉजी को समझना एक आई / आर-मॉडल डिजाइन करने का एक प्रमुख लक्ष्य है। वर्तमान में, ischemia-reperfusion क्षति को कम करने के लिए कोई चिकित्सकीय रूप से उपयोगी चिकित्सीय नहीं है1,35. नतीजतन, इन विट्रो और इन विवो मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला प्रस्तावित की गई है। इस संदर्भ में, ओवो में 3-दिवसीय विकासशील चिक भ्रूण में आई / आर मॉडलिंग को पहली बार प्रस्तावित किया गया था। पिछले शोध से पता चला है कि धमनी रक्त प्रवाह के रोड़ा-reperfusion प्रयोगात्मक मॉडल में रोग संबंधी परिवर्तन का कारण बनता है जो मनुष्यों 36,37,38 में देखे गए लोगों के समान हैं, इसलिए हमें उम्मीद थी कि हमारा मॉडल भी ऐसा ही करेगा (इस तरह के ऑक्सीडेटिव और भड़काऊ तनाव विवो मॉडल में या रोगियों में देखे गए)। हमारे अध्ययन के निष्कर्षों के साथ, उपरोक्त परिकल्पना को सही दिखाया गया था।

भ्रूण से जर्दी थैली तक रक्त का परिसंचरण चूजे के भ्रूण में vitelline वाहिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है39. भ्रूण जर्दी से पोषक तत्व प्राप्त करते हैं और विटेलिन परिसंचरण के माध्यम से हवा से ऑक्सीजन फैलाते हैं; इस प्रकार, vitelline जहाजों है कि पोषण और ऑक्सीजन हस्तांतरण को बाधित कर सकते हैं में से किसी को भी प्रतिबंधित. इन तथ्यों के आधार पर, ischemia 5 मिनट के लिए आरवीए के लिए रक्त की आपूर्ति occluding द्वारा प्रेरित किया गया था, अतिरिक्त 5 ज और 55 मिनट के लिए reperfusion द्वारा पीछा किया. प्रस्तावित मॉडल का उपयोग आई / आर से जुड़ी विभिन्न रोग प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला की जांच करने और विभिन्न प्रकार की दवाओं और उनके लक्ष्यों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। वर्तमान मॉडल का उपयोग डीएनए, आरएनए और प्रोटीन में परिवर्तन की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसमें उच्च आउटपुट देने की क्षमता है। नियमित विश्लेषण के लिए अपनी सादगी और अनुकूलन क्षमता के अलावा, मॉडल अल्पकालिक स्टेम सेल होमिंग की भी जांच कर सकता है, जिसकी भविष्य के अध्ययनों में जांच की जाएगी।

इन विट्रो मॉडल की तुलना में, हमारा मॉडल उपयोग करना आसान है, लागत प्रभावी है, और जल्दी से बढ़ता है, साथ ही नैतिक रूप से निर्दोष भी है32। माइक्रोवैस्कुलचर की उपस्थिति, प्रतिरक्षा प्रणाली, और शारीरिक आकलन इन विट्रो मॉडल पर सभी लाभ हैं, जबकि कम लागत, समय-प्रभावशीलता, और कोई नैतिक समस्याएं विवो मॉडल 40 में फायदे नहीं हैं। उपर्युक्त लाभों से संकेत मिलता है कि हमारे मॉडल का वर्तमान में उपयोग किए जा रहे अन्य आई / आर मॉडल के लिए एक तुलनीय प्रभाव है (चित्रा 10)। एक संभावित कमी वर्तमान मॉडल की अक्षमता है जो इंफार्क्ट क्षेत्र को मापने में असमर्थता है। प्रत्यक्ष रोधगलन मूल्यांकन आई / आर-मध्यस्थता क्षति के लिए एक मूल्यवान बायोमार्कर हो सकता है और विभिन्न चिकित्सा दवाओं के प्रभावों को मैप करने के लिए एक विधि हो सकती है। इस प्रकार, हमने इंफार्क्ट क्षेत्र को मापने की मांग की, लेकिन 72 एच-विकसित चूजों की नाजुक संरचना के कारण ऐसा नहीं कर सके। इसलिए, आई / आर प्रक्रियाओं के लिए व्यापक रूप से रणनीतियों और मार्गों का आकलन करने के लिए अतिरिक्त शोध की आवश्यकता है।

संक्षेप में, वर्तमान मॉडल का उपयोग आई / आर से जुड़े विभिन्न रोग मार्गों की जांच करने और विभिन्न प्रकार की दवाओं और उनके लक्ष्यों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसकी उच्च पुनरुत्पादन, लागत-प्रभावशीलता और सादगी के कारण, हम उम्मीद करते हैं कि हमारा मॉडल बुनियादी विज्ञान और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन होगा।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम हरि शंकर को वीडियोग्राफी और संपादन के दौरान उनकी महत्वपूर्ण जानकारी के लिए, श्री बाकर हुसैन को वॉयस-ओवर के लिए, श्री असगर रिजवी को वीडियो संपादन के लिए, श्री मोहम्मद हैदर को वीडियो शूट के लिए, श्री मोहम्मद दानिश सिद्दीकी को प्रयोगों के दौरान सहायता के लिए आभार व्यक्त करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-80°C) freezer Haier, China -
1.5mL Centrifuge tube TARSONS, India 500010X
100mm Petri dish (sterile) Tarsons, India 460050
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) Ramsons, India 13990
1mL Syringe DISPO VAN -
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) DISPO VAN, india 30722D
37°C egg incubator with adjustable percentage humidity Gentek, India GL-100
37°C laboratory incubator SCIENCE TECH, India CB 101-14
3-Methyladenine (3-MA) Sigma Aldrich, USA M9281
3mL Pasture Pipette TARSONS, India 940050
50mL Beaker TARSONS, India -
5mL Syringe DISPO VAN, India IP53
70% ethanol Merck Millipore, United States 64-17-5
Adhesive tape/Cello tape Sunrise, India -
Ambra1 primers Applied Biosystems, Foster city, USA Hs00387943_m1
Anti-mouse IgG Cell Signaling Technology, USA 7076S
Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno Research Laboratories, USA 711-035-152
Atg7 R&D Systems, USA MAB6608
Atg7 primers Applied Biosystems, Foster city, USA Hs00893766_m1
Autoclave Bag Tarsons, India 550022
Autoclave Machine Local made, Lucknow, India -
Beclin-1 Proteintech, USA 66665-1-Ig
Beta Actin ImmunoTag, USA ITT07018
Bovine Serum Albumin Himedia, Mumbai, India TC194
Calcium Chloride Himedia, Mumbai, India GRM534
Catalase ImmunoTag, USA ITT5155
Cleaning wipes Kimberly-Clark, India 370080
Cleaved Caspase3 ImmunoTag, USA ITT07022
di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate Himedia, Mumbai, India GRM39611
Doppler blood flowmeter Moors instrument, United Kingdom moorVMS-LDF1
Egg rack - -
Egg rack - -
GAPDH ImmunoTag, USA M1000110
GAPDH primers Applied Biosystems, Foster city, USA Hs02758991_g1
Glycine Himedia, Mumbai, India MB013
Kidney tray HOSPITO -
LC3A/B Cell Signaling Technology, USA 4108S
Methanol Rankem laboratories, Mumbai, India M0252
Micromanipulator Narishige, Japan M-152
N-acetyl-L-cysteine (NAC) Sigma Aldrich, USA A7250
Naringenin Sigma Aldrich, USA 67604-48-2
NF-kβ Thermo Fisher Scientific, USA 51-0500
NLRP3 ImmunoTag, USA ITT07438
Nose plier Local made, Lucknow, India -
Ocular forceps Stoelting, Germany 52106-40
Ocular iris Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8"
OHP marker pen Camlin, India -
ORP-150 ImmunoTag, USA ITT08329
Pointed sharp edge scissor Stoelting, Germany 52132-11
Potassium Chloride Himedia, Mumbai, India MB043
Potassium phosphate monobasic anhydrous Himedia, Mumbai, India MB050
Protease Inhibitor Abcam, United States Ab65621
SOD-1 ImmunoTag, USA ITT4364
Sodium Chloride Fisher Scientific, Mumbai, India 27605
Sodium dodecyl sulphate Himedia, Mumbai, India GRM886
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) Ramson, India GS-2029
Stereo Zoom surgical microscope Olympus, Japan SZ2-STU3
Syringe discarder BIOHAZARD 882210
Toothed forceps Stoelting, Germany 52102-30
Tris Base G Biosciences, United States RC1217
Tris Hydrochloric Acid Himedia, Mumbai, India MB030
Tween 20 G Biosciences, United States RC1227
White Leghorn Chicken 0-day eggs - -
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK MP Biomedicals, LLC, USA FK009

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References

  1. Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
  2. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  3. Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
  4. Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
  5. Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
  6. Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
  7. Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
  8. Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
  9. Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
  10. Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
  11. Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
  12. Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  13. Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
  14. Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
  15. Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
  16. Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
  17. Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
  18. Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
  19. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
  20. Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  22. Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
  23. Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
  24. Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
  25. Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
  26. Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
  27. Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  28. Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
  29. Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
  30. Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
  31. Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
  32. Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
  33. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
  34. Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
  35. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  36. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
  37. Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
  38. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).
  39. Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
  40. Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).

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जीव विज्ञान मुद्दा 180 ischemia-reperfusion लड़की भ्रूण सफेद Leghorn चिकन अंडे ovo मॉडल में 72 ज भ्रूण विकास सही vitelline धमनी
हुक Ischemia-Reperfusion मॉडल की पीढ़ी एक तीन दिवसीय विकासशील लड़की भ्रूण का उपयोग कर
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Kumari, N., Yadav, S. K., Prakash,… More

Kumari, N., Yadav, S. K., Prakash, R., Siddiqui, A. J., Khan, M. A., Raza, S. S. Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo. J. Vis. Exp. (180), e63288, doi:10.3791/63288 (2022).

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