Summary
Detta dokument beskriver ischemia-reperfusion (I/R) modellering i en 3-dagars kyckling embryo med hjälp av en spinal nål anpassade krok för att bättre förstå I/R utveckling och behandling. Denna modell är enkel, snabb och billig.
Abstract
Ischemi och reperfusion (I/R) störningar, såsom hjärtinfarkt, stroke och perifera vaskulär sjukdom, är några av de främsta orsakerna till sjukdom och död. Många in vitro- och in vivo-modeller finns för närvarande tillgängliga för att studera I/R-mekanismen i sjukdom eller skadade vävnader. Hittills har dock ingen i ovo I/R-modell rapporterats, vilket skulle möjliggöra en bättre förståelse för I/R-mekanismer och snabbare läkemedelsscreening. Detta dokument beskriver I/R modellering med hjälp av en spinal nål anpassade krok i en 3-dagars kyckling embryo för att förstå I/R utveckling och behandling mekanismer. Vår modell kan användas för att undersöka anomalier på DNA-, RNA- och proteinnivåerna. Denna metod är enkel, snabb och billig. Den nuvarande modellen kan användas oberoende eller i kombination med befintliga in vitro- och in vivo I/R-modeller.
Introduction
Ischemia-reperfusion vävnad skada har kopplats till ett antal patologier, inklusive hjärtinfarkt, skandinavisk stroke, trauma och perifera vaskulär sjukdom1,2,3,4,5. Detta beror främst på bristande en omfattande förståelse för sjukdomsprogressionen och avsaknaden av en effektiv forskningsmodell. Ischemisk skada uppstår när blodtillförseln till ett visst område av vävnaden är avskuren. Som ett resultat, ischemisk vävnad så småningom necrotizes, även om hastigheten varierar beroende på vävnaden. Därför kan återställande av blodtillförseln bidra till att mildra skadorna. Det har dock observerats, i vissa fall, att reperfusion orsakar mer vävnadsskador än ischemi ensam gör6,7,8. Därför krävs förståelse för de molekylära och cellulära mekanismerna för ischemi-reperfusion för att utveckla en effektiv terapeutisk intervention. För närvarande är ingen effektiv behandling för I/ R skador känd. Denna skillnad har lett till skapandet av nya experimentella modeller, allt från in vitro till in vivo-modeller, för att ta itu med det befintliga problemet9,10,11,12,13.
Kycklingembryon (Gallus gallus domesticus) används ofta i forskning på grund av deras lättillgänglighet, etisk acceptans, relativt stor storlek (jämfört med andra embryon), låg kostnad och snabb tillväxt14. Vi använde en kyckling embryo vid 72 h av utveckling för att skapa en in ovo I/R genom att ocklusive och släppa rätt vitelline gatan med hjälp av en spinal nål. Vi döpte den till Hook-I/R ischemia-reperfusion-modellen (figur 1). Modellen som används i denna studie kan exakt simulera alla nedströmsprocesser, inklusive oxidativa och inflammatoriska vägar, som ofta är förknippade med I/R-skador15,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionella djuretiska kommittén vid Era's Lucknow Medical College and Hospital utfärdade ett skriftligt undantag om att inget formellt godkännande krävdes för att utföra dessa experiment i enlighet med kommittén för kontroll och övervakning av djurförsök (CPCSEA). Standardrutiner följdes dock för att minimera risken för embryonala nöd.
1. Buffertberedning (tabell 1)
- Förbered Ringers lösning
- För att förbereda Ringers lösning, lös upp 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) i 70 ml sterilt destillerad H2O, med en slutlig volym på 100 ml. Justera pH-värdet till 7,4. Låt det lösas upp helt och autoklav. Filtrera sedan genom ett 0,22 μm-filter, alikvotera till engångsbelopp (ca 10 ml) och förvara i rumstemperatur.
- Förbered normal saltlösning (0,9% natriumklorid, NaCl).
- Lös upp 0,9 g NaCl (154 mM) i 70 ml sterilt destillerat H2O. Gör upp volymen till 100 ml. Autoklav i 15 min vid 121 °C. Justera pH-värdet till 7,4 med 0,1 N HCl eller 0,1 N NaOH vid behov. Gör 10 ml alikvoter i ett 15 ml sterilt centrifugrör och förvara i rumstemperatur.
- Förbered 70% etanol (v/v).
- Blanda 70 ml ren etanol (Mol. wt. 46,07 g/L) till 30 ml steril H2O. Förbered vid behov eller förvara vid rumstemperatur. Det finns inget behov av sterilisering.
- Förbered 1x fosfatbuffertsaltlösning (1x PBS).
- Förbered 100 ml 1x PBS genom att tillsätta 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14, 6 mM) till 70 mM. Lös upp och gör upp volymen till 100 ml och autoklav i 15 min vid 121 °C. Ta pH till 7,4 och tillsätt ett par droppar 0,1 N HCl eller 0,1 N NaOH, om det behövs. Gör alikvoter på 10 ml i ett 15 ml sterilt centrifugrör och förvara i rumstemperatur.
2. Dag 1
- Ordna alla verktyg som behövs för äggsterilisering (70% etanol, rengöringsservetter, ett äggställ och en OHP-markör).
- Rengör 0-dagars äggen med 70% etanol med hjälp av vävnadspappersservetter. Använd endast ett 0-dagars ägg, eftersom äldre ägg kanske inte ger upphov till ett embryo.
- Skriv aktuellt datum på ägg med en OHP-markör.
- Placera äggen i en ägginkubator inställd på en temperatur av 36-37 °C och en fuktighetsnivå på 60%-65%. Inkubera äggen under de kommande 24 h.
3. Dag 2
- Ordna den nödvändiga utrustningen för uttag av 5-6 ml albumin (skarp kantsax, 5 ml spruta, 18 G nål, sprutades kasserare och tejp).
- Torka av den kirurgiska saxen med 70% etanol eller sterilisera med en autoklav efter att ha torkat dem med 70% etanol.
- Ta nu ägget från ägginkubatorn 37 °C för skiktning.
- Placera ägget på ett rent äggställ.
- Fäst en liten bit tejp (storlek: ca 1 tum längd x bredd) på äggets kant.
- Gör ett litet hål i eggshells kant med vass spetsig kantsax. Sätt in en 5 ml spruta i en ungefärlig vinkel på 75°.
OBS: 5 ml-sprutan levereras med en 24 G x 1 nål (steril), men det är bra att byta ut 24 G x 1-nålen med en 18 G x 1,5 nål (steril). Nålen 18 G x 1,5 är 1,25 x 38 mm bred. Därför kommer det att underlätta avlägsnandet av albumin. - Efter att ha fört in nålen i äggula säcken, dra långsamt ut 5-6 ml albumin.
OBS: Detta ger embryot en säng där det kan växa. Om du drar tillbaka albumin förhindras överspill av albumin samtidigt som ett fönster upprättas. Slutligen minskar risken för att embryot skadas under fönsterning genom att eliminera 5-6 ml albumin. - Efter att ha tagit bort albumin, återförslut öppningen med tejp och låt äggen inkubera vid 37 °C i 48 timmar.
4. Dag 4
- Förbered Ringers lösning, 0,9% normal saltlösning och 1x PBS enligt beskrivningen i avsnitt 1 i protokollet. Autoklavera sedan de tre lösningarna. Placera respektive lösning vid rumstemperatur efter autoklavering.
- Ta ut ägget från ägginkubatorn på 37 °C och skär skalet i en cirkulär form. Innan du skär äggskalet, täck det område som ska skäras med tejp.
OBS: Att täcka fönsterområdet med tejp förhindrar att äggskalet bryts på oönskade platser. Men om du bryter dig in på en oönskad plats, försegla området med tejpen. Att täcka de platser som ska skäras med tejp förhindrar att skalbitar faller på äggulasäcken. - Skapa ett litet hål i äggskalet med en skarpt spetsig kantsax på den plats där fönsterningen önskas och börja klippa en cirkulär öppning. Den här processen kallas fönster fönster.
OBS: Se till att det cirkulära snittet är tillräckligt stort för att ge enkel åtkomst till embryot från alla håll. Ändra vid behov äggpositionen för att passa embryots position. - Därefter, med hjälp av ett stereozoom kirurgiskt mikroskop, hitta rätt vitelline artery (RVA).
OBS: Kycklingembryon genomgår normalt bröstsorrsion (tillsammans med cervikal flexure, etc.) när de utvecklas, så att vänster sida av huvudet är mot äggulan vid 72 h-stadiet. Mer kaudiellt, där vitellinartärerna lämnar kroppen, är embryot inte mycket vridet, och denna del av kroppen ligger ventral sida ner mot äggulan. Så att titta direkt, embryots rätt är till höger om forskaren. - När RVA är placerad, skapa två små hål på vänster och höger sida av RVA med en 26 G nål (bild 2).
- Placera Dopplers blodflödesavbildningssond ovanför RVA. Se till att Dopplers blodflödesavbildningssond placeras 5 ± 1 mm från ischemistället och mot RVA:s distala ände. Ta en flödesavläsning i 2 min och 30 s (eller längre om så önskas). Detta kommer att vara den normoxiska fasavläsningen.
- Under tiden, med hjälp av en näsplog och tandade tångar, formar du långsamt ryggradsnålens kant i form av en krok (figur 3). Gör detta genom att böja kanten på ryggmärgsnålen i ca 1 mm. En större storlek gör det svårare att sätta in och ta bort ryggmärgsnålen under I/R-proceduren.
- För in ryggmärgsnålen direkt under den högra vitellinartären med hjälp av en mikromanipulator.
OBS: Sätt in ryggmärgsnålen med stor försiktighet för att undvika att skada RVA eller intilliggande artärer. Den optimala tekniken är att justera ryggmärgsnålens specialdesignade krok exakt ovanför RVA-hålets högra sida, följt av att gradvis föra in ryggradsnålens specialdesignade kant i äggulasäcken med hjälp av en mikromanipulator under ledning av ett stereozoomkirurgiskt mikroskop genom det högra hålet. När ryggmärgsnålens krok är i äggulasäcken, justera gradvis kroken under RVA så att dess kant är exakt placerad under det vänstra hålet. Nu är det dags att lyfta ryggmärgsnålen. - Nu, med hjälp av mikromanipulatorn, lyft gradvis artären tills Doppler blodflödesflödet indikerar en minsta minskning av artärflödet med 80%.
- När en dropdown på 80% eller mer i Doppler flux uppnås, lämna ryggmärgsnålen lyft (dra artären uppåt) i 5 min. Detta kommer att vara perioden för ischemi i RVA.
OBS: Det är viktigt att övervaka Dopplerflödet under ischemin. Om en betydande mängd fluktuationer upptäcks avslutar du testerna. - Efter 5 min ischemi perioden, gradvis släppa artären för att återställa normala blodflödesnivåer. Se till att dopplerblodflödesmätarens avläsning visar värden som är jämförbara med dem som erhålls under normoxia. Detta kommer att vara perioden för reperfusion i RVA (figur 4).
- Efter I/R-proceduren, applicera några droppar (2-3) 1x PBS på embryot och titta på det i 2-3 min.
OBS: Användningen av 1x PBS hjälper till att förhindra att embryot torkar ut. - Slutligen återförsluta fönstret med tejp och placera ägget tillbaka i ägginkubatorn i 5 h och 55 min.
- Efter 5 h och 55 min, ta ägget från ägginkubatorn, placera det på äggstället, öppna fönstret igen och följ nedströmsbehandlingsprotokollet.
5. Behandlingar
- För behandling av artärer med läkemedel, aktivatorer eller hämmare, punkt punkt RVA efter 1 h av I/R-processen.
- För nedströmsstudierna, ta först bort embryot från äggskalet genom att placera det på en steril 90 mm Petriskål.
- När embryot har släppts ut i Petri-skålen, ta bort RVA med okulär iris under ledning av ett stereozoom kirurgiskt mikroskop.
- Se till att RVA:s excisionsdimension är upp till 15 ± 1 mm (distala från stammen), 5 ± 1 mm vardera på vänster och höger sida av artären och 2 ± 1 mm mot stammen.
OBS: En linjal kan användas för att mäta det område som ska strukits (valfritt). - Efter excising RVA, tvätta den med 1x PBS i en steril Petri-skål som innehåller 1x PBS.
- För önskade behandlingar, placera artären i ett 1,5 ml centrifugrör (steriliserat) fyllt med 500 μL av Ringers lösning. Placera RVA i centrifugröret och placera den i en inkubator på 37 °C i 5 timmar och 55 min.
OBS: Beroende på behandlingarna, antingen använda Ringers lösning utan någon behandling, eller behandling med önskad volym och koncentration av läkemedel, aktivator eller hämmare. - Efter 5 h och 55 min inkubation, ta ut RVA från 37 °C laboratorieinkubatorn och fortsätt med önskade behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doppler Blood Flow Imaging-tekniken användes för att utvärdera effektiviteten hos vår modell. Kort sagt jämförde vi data från kontrollgruppen med data från RVA-gruppen för att avgöra hur framgångsrikt vi skapar. Figur 4A visar ett typiskt flöde som är förknippat med kontrolldjuret, medan figur 4B visar resultaten från en RVA. Den numeriska 1-8 representerar de olika händelser som är associerade med I/R faser. Kort sagt motsvarar numerisk 1-3 fasen av normoxia, medan en kraftig minskning av flödet vid punkterna 3 och 4 representerar de händelser som är förknippade med minskningen av blodflödet i RVA. När en 80% eller större drop-down hade uppnåtts, lämnades RVA upp för de kommande 5 min. Detta var fasen av ischemi (numerisk 4-5). Efter en 5 minuters lyftning av RVA släpptes RVA, som representeras av numeriska 6 och 7. Flödet från punkt 7 och framåt representerar reperfusionsfasen, som inträffar efter att RVA har uppnått normala blodflödesnivåer, vilket var fasen av reperfusion. Detta särskilda experiment visade effektiviteten av I/R modellering i 3-dagarsutvecklade kyckling embryo.
För att verifiera nyttan av vår modell har vi studerat uttrycksmönstren för proteiner, RNA och DNA genom ELISA, western blotting, qRT-PCR och gelelektroforesanalys. I korthet delade vi in de 3-dagars utvecklade äggen i tre experimentella grupper: kontroll, I / R och behandlingar + I / R. En signifikant skillnad i uttryck av proteiner, gener och DNA-integritet observerades mellan deras respektive I/R och kontrollgrupper. Som diskuteras nedan förbättrade läkemedelsbehandlingen till I/R-gruppen effektivt det resultat som observerats i denna grupp jämfört med den I/R-behandlade gruppen enbart. Detta är förenligt med vår tidigare publicering som detta protokoll bygger på1. Standardlaboratoriets förfaranden följdes för ELISA18, western blotting19, qRT-PCR20 och gelelektrofores21, som inte omfattas av detta dokument (figur 5, figur 6, figur 7, figur 8).
Ischemia-reperfusion stimulerar flera processer, inklusive bildandet av reaktiva syrearter (ROS) som är skadliga för vävnaden. De skadliga effekterna som orsakas av de inneboende antioxidant kroppsförsvarssystemens svar på ROS är ett viktigt inslag i I/R skada. Vi undersökte verksamheten av syre reglerande proteiner 150 (ORP150), cytoplasmic superoxid dismutas 1 (SOD1) och katalas i skandinaviska fartyg. Jämfört med kontrollgruppen förhöjde I/R aktiviteten hos ORP150, cytoplasmisk SOD1 och katalas (figur 5A-C). Emellertid, tillskott med N-Acetyl-L-Cystein (NAC), en ROS quencher, mildrade I/R gruppen oxidativ stress.
För att bedöma vår modells inflammatoriska potential använde vi ELISA för att undersöka IL-1β och TNF-α uttryck (figur 6). Båda interleukinerna var överuttryckta i I/R gruppen jämfört med kontrollgruppen, vilket indikerar att vår modell har potential att användas i inflammatoriska undersökningar. Därefter testade vi uttrycket av nod-liknande receptor pyrin domän-innehållande protein 3 (NLRP3) inflammasome utbildningsavsnitt22,23, och proinflammatoriska molekyl, NF-kβ24,25, som är inblandade i att förstärka inflammation, för att bekräfta nyttan av denna modell för inflammatoriska studier. Som svar på I/R som genererades i RVA fann denna undersökning bevis för aktivering av NLRP3-inflammasom (figur 7A) samt NF-kβ (figur 7B). Behandling med Naringenin, ett välkänt antiinflammatoriskt läkemedel, lindrade dock de inflammatoriska effekterna, som observerats i de läkemedelsbehandlade grupperna.
Ischemia-reperfusion aktiverar programmerade celldödsvägar26,27,28. Vi studerade effekterna av I/R på apoptos och autofagi vägar i kyckling embryot. Figur 8A visar effekten av I/R på caspase-3 och zVAD-fmk. Figur 8B-D visar att I/R gruppen hade högre uttryck för LC3II samt LC3II/I förhållandet (autophagosomer markör), Beclin1 (en betydande regulator av autofagi i däggdjursceller) och Atg7 (behövs för basal autofagi) än kontrollgruppen, respektive, på proteinnivåer. Figur 8E visar däremot effekten av I/R på mRNA-nivåerna. Tillägget av 3-MA, en autofagihämmare, vände dock resultaten. Dessa resultat tyder på att modellen kan användas för att undersöka olika celldödsprocesser (t.ex. nekroptos). Figur 9 visar hur effektivt förändringarna på DNA-nivå kan studeras med hjälp av vår Hook-I/R-modell.
Slutligen jämför vi resultaten från Hook-I/R-modellen och den mellersta cerebrala artären (MCAO) -modellen för att se hur effektiv vår modell är i jämförelse med andra modeller. Sammanfattningsvis hade I/R-behandlade RVI högre nivåer av apoptotiska protein klyvda caspase-3, autofagiproteinerna Beclin1 och Atg7 och inflammatoriska interleukiner TNF-α och IFN-Ƴ än kontroll RVAs. Intressant, oavsett om man analyserar inflammatorisk stress eller cellulära dödsvägar, hook-I/ R-modellen producerade resultat som var extremt lika dem som erhållits av MCAO-modellen (figur 10).
Figur 1: Ett schematiskt diagram över en typisk uppsättning av hook-I/R kyckling embryo ischemia-reperfusion modell. Bilden visar hook-I/R kyckling embryo ischemia-reperfusion experiment krav, såsom stereozoom kirurgiskt mikroskop, laser Doppler blodflödesmätare, micromanipulator, spinal nål, 72 h utvecklade kyckling embryon och en belysningskälla." Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativ bild av en 3-dagars kyckling embryo-utställande plats för ocklusion och område av vävnad excision. (A) Triangeln visar platsen för excision av vävnaden för västra blotting, RNA och DNA isolering. Stjärnan och prickarna representerar platsen för ocklusionen och hålen som skapas på vänster och höger sida av RVA för att sätta in nålen under artären för att lyfta den. En förstorad bild av området för vävnadsextraktion tillhandahålls också tillsammans med den. Notationen A representerar ögat, B representerar hjärtat, C representerar vänster om vitelline gatan och C' representerar höger om vitelline gatan. B) En schematisk representation av kycklingembryonets högra sida visar området för vävnadsexcision i närheten av RVA. Den raka linjen representerar RVA som kommer ut ur embryostammen. Stjärnan på den vertikala linjen symboliserar positionen för Laser Doppler blodflödessonden. Korsningen betecknar platsen för ocklusion. Excision av artärerna gjordes upp till 15 ± 1 mm (distala från bålen), 5 ± 1 mm vardera på vänster och höger sida av gatan och 2 ± 1 mm mot stammen. Alla mätningar visar avstånd från platsen för ocklusion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Representativ bild av en ryggradsnål med en specialtillverkad krok. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Representation av en typisk laserdoppler blodflödesmätare signal. En typisk Laser Doppler blodflödesmätare signal mättes på en 3-dagars kyckling embryo gatan från en kontrollgrupp ägg (A). Händelser vid baslinjen (1), under normoxia (2), omedelbar förlyftning av RVA (3), omedelbar efterlyftning av RVA (4), under ischemi (5), omedelbar förfrigörelse av RVA (6), omedelbar postreparerfusion (7), under reperfusion (8) i den ischemibehandlade gruppen som registrerats av Laser Dopplers blodflödesmätare (B). Denna siffra antogs från Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; under en CC-BY-licens)1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Effekten av ischemireperfusion på uttrycket av oxidativa stressmarkörproteiner. Western blotting användes för att bestämma ORP150, SOD1 och katalas uttryck nivåer. (A) ORP150-uttrycket ökades efter I/R-skador. NAC, en pan-ROS-hämmare, sänkte ORP150 till en nivå som är jämförbar med kontrollnivån. (B) Efter I/R höjdes SOD1-uttrycket. SOD1 uttryck minskade också efter NAC behandling. C) I/R-händelsen framkallade uttrycket av katalas. RVA behandlas med I/R och exponeras för NAC visade en minskning av katalasnivåerna. GAPDH (A,C) och β-Actin (B) användes som interna kontroller. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Uppskattning av IL-1β och TNF-α med ELISA. ELISA användes för att kvantifiera IL-1β och TNF-α, och resultaten visade att det fanns en ökning av IL-1β och TNF-α uttryck, vilket mildrades av tillsatsen av Naringenin. För denna studie tillämpades ANOVA följt av Newman-Keuls-testet. Felstaplar representerar medelvärde ± SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Effekten av ischemi-reperfusion på uttrycket av inflammation markör proteiner. (A) I/R behandling resulterade i ökat uttryck av NLRP3. Inkubation av I/R behandlad RVA med Naringenin minskade uttrycket av NLRP3. (B) I likhet med NLRP3 ökade också uttrycket av NF-kβ efter I/R-behandling. Behandlingen av Naringenin minskade uttrycket av NF-kβ. GAPDH användes som en intern kontroll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Effekten av ischemia-reperfusion på apoptotic och autophagic status av RVA celler. (A) För att utforska induktion av apoptos genom I/R processen, uttrycka klyva caspase 3 utvärderades med hjälp av västra blotting. Efter I/R skador ökade nivån av klyvade caspase 3. Behandling med zVAD-fmk, en apoptoshämmare, minskade dock cleaved caspase 3 uttryck. (B-D) För att utvärdera induktion av autofagi efter I/R fastställdes uttrycket av LC3II/I, Beclin1 och Atg7. Efter I/R ökade uttrycket av alla autofagiska markörer, medan exponeringen av I/R-behandlade RVA för autofagihämmaren 3-MA minskade uttrycket av alla proteiner för att kontrollera nivåerna. Som en intern kontroll användes GAPDH. (E) qRT-PCR användes för att bekräfta induktion av autofagi och bestämma uttrycksnivåerna ambra1 och atg7 mRNA. Båda generna visade en betydande ökning av uttryck i I/R gruppen jämfört med kontroll, som återställdes till nära normala nivåer efter NAC terapi. GAPDH användes som en intern kontroll för qRT-PCR experiment. För experiment (E) tillämpades ANOVA, följt av Newman-Keuls-testet. Felstaplar representerar medelvärde ± SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 9: Ischemireperfusions effekt på DNA-skador. För att avgöra om I/R inducerar DNA-hack undersökte vi DNA-skador med gelelektrofores. I/R resulterade i genomisk DNA-nedbrytning, vilket framgår av utstryks i I/R-provet. NAC-behandling av I/R-skadad RVA minskade DNA-skador. En 1 kb DNA-stege användes. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 10: Jämförelse av Hook-I/R-modellen jämfört med MCAO-modellen. En jämförelse gjordes mellan de data som genereras av Hook-I/R-modellen och de data som genereras av MCAO-modellen. (A) Uttrycket av det apoptotiska proteinet caspase-3 och autofagiproteinerna Beclin1 och Atg7 var högre i I/R-behandlade RFA jämfört med uttrycket av samma proteiner i kontroll-RFA, vilket överens med resultaten från MCAO-experimenten. B) TNF- α- och IFN- # nivåer konstaterades vara förhöjda i både RVA- och MCAO-grupperna jämfört med deras respektive kontroller. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Material/utrustnings namn | Koncentration | Autoklav | Lagring | ||
| Reagenser för Ringers lösning | |||||
| Koksalt | 123 mM | ||||
| Kaliumklorid | 4.96 mM | ||||
| Kalciumklorid | 1,53 mM | ||||
| Sterilt destillerat vatten | 100 ml | ||||
| pH | 7.4 | 15 min vid 121 °C | R.T. | ||
| Reagenser för 0,9% normal saltlösning | |||||
| Koksalt | 154mM | ||||
| Sterilt destillerat vatten | 100 ml | ||||
| pH | 7.4 | 15 min vid 121 °C | R.T. | ||
| Reagenser för 70% etanol | |||||
| 70% etanol | 70 ml | ||||
| Sterilt destillerat vatten | 30 ml | Krävs inte | R.T. | ||
| Reagenser för 1x fosfatbuffertsaltlösning | |||||
| Koksalt | 136,8 mM | ||||
| Kaliumklorid | 26,8 mM | ||||
| Monobasisk vattenhalt i kaliumfosfat | 14,6 mM | ||||
| di-natrium vätefosfat heptahydrat | 5.37 mM | ||||
| Sterilt destillerat vatten | 100 ml | 15 min vid 121 °C | R.T. | ||
Tabell 1: Recept på lösningar som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med ischemi-reperfusion forskning är att skapa terapeutiska strategier som förhindrar celldöd och främja återhämtning29,30. För att övervinna nuvarande begränsningar i I/R-forskning utformade vi en Hook I/R chick embryo modell för att producera en pålitlig och reproducerbar I/R-modell. Såvitt vi vet är vår första I/R-modell som någonsin skapats i ett 3-dagars kycklingembryon för rutinmässiga I/R-experiment, förutom att studera stresssignaler (t.ex. oxidativ och inflammatorisk stress). Med tanke på fördelarna med storlek och tillgänglighet på dag 3 av utveckling31, användes kycklingembryon i ett utvecklingsstadium på 72 h, på grund av modellens höga produktion, enkelhet att använda och anpassningsförmåga för rutinanalys32. Kort sagt, på utvecklingsdagen 3 är in ovo-kycklingen en mycket kontrollerad, men ändå tillgänglig och någorlunda transparent modell inom ägget som kan användas för att visualisera normal fysiologi, sjukdomspatologi och effekterna av experimentell behandling. Dess enorma storlek gör det särskilt användbart för att studera embryots bildande och beteende under normal fysiologi samt stress33. Även om äldre kycklingembryon (de som inkuberas i 4 dagar eller längre) kan användas, och vi försökte en senare tidpunkt, begränsas användningen av äldre embryon som modellsystem allvarligt av det faktum att äggulasäcken växer så tjock bortom 3 dagars utveckling att kirurgiska ingrepp är svåra. Det är anmärkningsvärt att nämna att även om RVA inte är helt formad vid ett tidigt tidsfönster (säg, på dag 1 eller 2), kan fönsterning leda till teratogenicitet34. Förutom begränsningarna i samband med en tidig eller sen utvecklingspunkt fungerar ett 72 h kycklingembryon som en idealisk modell för att undersöka I/R-processen eftersom 3-dagars kycklingembryon har ett väldefinierat cirkulationssystem30.
Att förstå patofysiologin för I/R-skada är ett viktigt mål för att utforma en I/R-modell. För närvarande finns det ingen kliniskt användbar terapeutisk för att minska ischemi-reperfusion skador1,35. Som ett resultat har ett brett utbud av in vitro- och in vivo-modeller föreslagits. I detta sammanhang föreslogs I/R-modellering i ett 3-dagars utvecklande kycklingembryon i ovo för första gången. Tidigare forskning har visat att ocklusionsreperfusion av arteriellt blodflöde orsakar patologiska förändringar i experimentella modeller som liknar de som ses hos människor36,37,38, så vi var hoppfulla om att vår modell skulle göra detsamma (sådan oxidativ och inflammatorisk stress observerad i in vivo-modeller eller hos patienter). Med resultaten av vår studie visade sig ovanstående hypotes vara korrekt.
Blodcirkulationen från embryon till äggulasäcken kontrolleras av vitellinkärl i kycklingembryon39. Embryon får näringsämnen från äggulan och sprider syre från luften via vitelline cirkulation; således begränsa något av vitelline fartyg som kan störa näring och syre överföring. Baserat på dessa fakta inducerades ischemi genom att ocklusive blodtillförseln till RVA i 5 min, följt av reperfusion för ytterligare 5 h och 55 min. Den föreslagna modellen kan användas för att undersöka en rad olika sjukdomsprocesser i samband med I/R och testa en mängd olika läkemedel och deras mål. Den nuvarande modellen kan användas för att undersöka förändringar i DNA, RNA och proteiner. Det har potential att ge hög effekt. Förutom sin enkelhet och anpassningsförmåga för regelbunden analys kan modellen även undersöka kortsiktig stamcellsring, som kommer att undersökas i framtida studier.
I jämförelse med in vitro-modeller är vår modell lätt att använda, kostnadseffektiv och växer snabbt, samt att vara etiskt oskyldig32. Förekomsten av mikrovaskulatur, immunsystemet och fysiologiska bedömningar är alla fördelar jämfört med in vitro-modeller medan låg kostnad, tidseffektivitet och inga etiska problem är fördelar jämfört med in vivo-modeller40. Ovanstående fördelar tyder på att vår modell har en jämförbar effekt som de andra I/R-modeller som för närvarande används (figur 10). En potentiell brist är den nuvarande modellens oförmåga att kvantifiera det infarkta området. Direkt infarkt bedömning kan vara en värdefull biomarkör för I/R-medierad skada och en metod för kartläggning av effekterna av olika terapiläkemedel. Således försökte vi kvantifiera det infarkta området men kunde inte göra det på grund av den känsliga strukturen hos de 72 h-utvecklade kycklingarna. Därför krävs ytterligare forskning för att bedöma strategier och vägar för I/R-processer på ett heltäckande sätt.
Sammanfattningsvis kan den nuvarande modellen användas för att undersöka olika sjukdomsvägar kopplade till I/R och screena en mängd olika läkemedel och deras mål. På grund av dess höga reproducerbarhet, kostnadseffektivitet och enkelhet förväntar vi oss att vår modell kommer att vara en värdefull resurs för grundläggande vetenskap och translationell forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi vill uttrycka vår tacksamhet till Hari Shankar för hans kritiska ingångar under videografi och redigering, Mr. Baqer Hussain för voice-over, Mr. Asghar Rizvi för videoredigering, Mr. Mohammad Haider för videoinspelningar, Mr. Mohammad Danish Siddiqui för hjälp under experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
