Summary
Dieses Papier beschreibt die Ischämie-Reperfusion (I / R) -Modellierung in einem 3-tägigen Kükenembryo unter Verwendung eines angepassten Spinalnadelhakens, um die I / R-Entwicklung und -Behandlung besser zu verstehen. Dieses Modell ist einfach, schnell und kostengünstig.
Abstract
Ischämie und Reperfusionsstörungen (I / R) wie Myokardinfarkt, Schlaganfall und periphere Gefäßerkrankungen sind einige der Hauptursachen für Krankheit und Tod. Derzeit stehen viele in vitro und in vivo Modelle zur Verfügung, um den I/R-Mechanismus in Krankheiten oder geschädigtem Gewebe zu untersuchen. Bisher wurde jedoch kein in ovo I / R-Modell berichtet, das ein besseres Verständnis der I / R-Mechanismen und ein schnelleres Drogenscreening ermöglichen würde. Dieses Papier beschreibt die I / R-Modellierung unter Verwendung eines an die Wirbelsäulennadel angepassten Hakens in einem 3-tägigen Kükenembryo, um die I / R-Entwicklungs- und Behandlungsmechanismen zu verstehen. Unser Modell kann verwendet werden, um Anomalien auf DNA-, RNA- und Proteinebene zu untersuchen. Diese Methode ist einfach, schnell und kostengünstig. Das aktuelle Modell kann unabhängig oder in Verbindung mit bestehenden in vitro und in vivo I/R-Modellen verwendet werden.
Introduction
Ischämie-Reperfusion Gewebeverletzung wurde mit einer Reihe von Pathologien in Verbindung gebracht, darunter Herzinfarkte, ischämischer Schlaganfall, Trauma und periphere Gefäßerkrankungen1,2,3,4,5. Dies ist in erster Linie auf das Fehlen eines umfassenden Verständnisses des Krankheitsverlaufs und das Fehlen eines effektiven Forschungsmodells zurückzuführen. Eine ischämische Verletzung tritt auf, wenn die Blutversorgung eines bestimmten Bereichs des Gewebes unterbrochen wird. Infolgedessen nekrotisiert ischämisches Gewebe schließlich, obwohl die Rate je nach Gewebe variiert. Daher kann die Wiederherstellung der Blutversorgung dazu beitragen, den Schaden zu mildern. Es wurde jedoch in einigen Fällen beobachtet, dass die Reperfusion mehr Gewebeschäden verursacht als Ischämie allein6,7,8. Daher ist das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Ischämie-Reperfusion erforderlich, um eine wirksame therapeutische Intervention zu entwickeln. Derzeit ist keine wirksame Behandlung von I/R-Verletzungen bekannt. Diese Diskrepanz hat zur Schaffung neuer experimenteller Modelle geführt, die von In-vitro- bis zu In-vivo-Modellen reichen, um das bestehende Problem anzugehen9,10,11,12,13.
Kükenembryonen (Gallus gallus domesticus) werden aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit, ethischen Akzeptanz, relativ großen Größe (im Vergleich zu anderen Embryonen), niedrigen Kosten und schnellen Wachstums häufig in der Forschung eingesetzt14. Wir verwendeten einen Kükenembryo nach 72 h Entwicklungszeit, um eine In-Ovo-I / R zu erzeugen, indem wir die rechte Vitellinarterie mit Hilfe einer Spinalnadel verschlossen und freisetzten. Wir nannten es das Hook-I/R-Ischämie-Reperfusionsmodell (Abbildung 1). Das in dieser Studie verwendete Modell ist in der Lage, alle nachgeschalteten Prozesse genau zu simulieren, einschließlich oxidativer und entzündlicher Signalwege, die häufig mit I/R-Schäden in Verbindung gebracht werden15,16,17.
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Protocol
Das Institutional Animal Ethical Committee am Lucknow Medical College and Hospital von Era gab eine schriftliche Verzichtserklärung heraus, in der es heißt, dass für die Durchführung dieser Experimente in Übereinstimmung mit dem Committee for the Purpose of Control and Supervision of Animals (CPCSEA) keine formelle Genehmigung erforderlich ist. Es wurden jedoch Standardarbeitsanweisungen befolgt, um das Potenzial für embryonalen Stress zu minimieren.
1. Puffervorbereitung (Tabelle 1)
- Vorbereiten der Lösung von Ringer
- Zur Herstellung der Ringer-Lösung werden 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) in 70 ml sterilem destilliertem H2O mit einem Endvolumen von 100 mL gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Lassen Sie es vollständig auflösen und autoklavieren. Anschließend durch einen 0,22 μm Filter filtrieren, in Einwegmengen (ca. 10 ml) aliquotieren und bei Raumtemperatur lagern.
- Normale Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid, NaCl) zubereiten.
- In 70 ml sterilem destilliertem H2O werden 0,9 g NaCl (154 mM) gelöst. Machen Sie das Volumen auf 100 ml. Autoklav für 15 min bei 121 °C. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 0,1 N HCl oder 0,1 N NaOH ein, falls erforderlich. 10 mL Aliquots in einem 15 mL sterilen Zentrifugenröhrchen herstellen und bei Raumtemperatur lagern.
- 70% Ethanol (v/v) herstellen.
- Mischen Sie 70 mL reines Ethanol (Mol. wt. 46,07 g/L) auf 30 mL steriles H2O. Bereiten Sie es nach Bedarf vor oder lagern Sie es bei Raumtemperatur. Es besteht keine Notwendigkeit für die Sterilisation.
- Bereiten Sie 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (1x PBS) vor.
- 100 ml 1x PBS werden unter Zugabe von 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14,6 mM) zu 70 mL destilliertem Wasser hergestellt. Lösen und das Volumen auf 100 ml auffüllen und für 15 min bei 121 °C autoklavieren. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,4 und fügen Sie bei Bedarf ein paar Tropfen 0,1 N HCl oder 0,1 N NaOH hinzu. Aliquots von 10 ml in einem 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen herstellen und bei Raumtemperatur lagern.
2. Tag 1
- Ordnen Sie alle Werkzeuge an, die für die Sterilisation von Eiern erforderlich sind (70% Ethanol, Reinigungstücher, ein Eierregal und ein OHP-Marker).
- Reinigen Sie die 0-Tage-Eier mit 70% Ethanol mit Seidenpapiertüchern. Verwenden Sie nur ein 0-Tage-Ei, da ältere Eier möglicherweise keinen Embryo hervorbringen.
- Schreiben Sie das aktuelle Datum auf Eier mit einem OHP-Marker.
- Legen Sie die Eier in einen Eierinkubator, der auf eine Temperatur von 36-37 ° C und eine Luftfeuchtigkeit von 60% -65% eingestellt ist. Bebrüten Sie die Eier für die nächsten 24 h.
3. Tag 2
- Organisieren Sie die notwendige Ausrüstung für die Entnahme von 5-6 ml Albumin (Schere mit scharfer Kante, 5 ml Spritze, 18 G Nadel, Spritzenauswerfer und Klebeband).
- Wischen Sie die chirurgische Schere mit 70% Ethanol ab oder sterilisieren Sie sie mit einem Autoklaven, nachdem Sie sie mit 70% Ethanol abgewischt haben.
- Nehmen Sie nun das Ei aus dem 37 °C eier inkubator zur Schichtung.
- Legen Sie das Ei auf ein sauberes Eierregal.
- Befestigen Sie ein kleines Stück Klebeband (Größe: ca. 1 Zoll Länge x Breite) am Rand des Eies.
- Machen Sie mit einer scharfen Kantenschere ein kleines Loch in den Rand der Eierschale. Führen Sie eine 5-ml-Spritze in einem ungefähren Winkel von 75° ein.
HINWEIS: Die 5-ml-Spritze wird mit einer 24 G x 1-Nadel (steril) geliefert, aber es ist gut, die 24 G x 1-Nadel durch eine 18 G x 1,5-Nadel (steril) zu ersetzen. Die 18 G x 1,5 Nadel ist 1,25 x 38 mm breit. Daher wird es die Entfernung von Albumin erleichtern. - Nachdem Sie die Nadel in den Dottersack eingeführt haben, ziehen Sie langsam 5-6 ml Albumin ab.
HINWEIS: Dies gibt dem Embryo ein Bett, auf dem er wachsen kann. Das Zurückziehen von Albumin verhindert ein Überfüllen von Albumin beim Einrichten eines Fensters. Schließlich wird das Risiko, dass der Embryo während des Fensters beschädigt wird, durch die Eliminierung von 5-6 ml Albumin gemindert. - Nach dem Entfernen des Albumins die Öffnung mit Klebeband wieder verschließen und die Eier 48 h bei 37 °C inkubieren lassen.
4. Tag 4
- Bereiten Sie die Ringer-Lösung, 0,9 % normale Kochsalzlösung und 1x PBS wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben vor. Dann autoklavieren Sie die drei Lösungen. Nach dem Autoklavieren die jeweilige Lösung bei Raumtemperatur platzieren.
- Nehmen Sie das Ei aus dem 37 °C großen Eierinkubator heraus und schneiden Sie die Schale in eine kreisförmige Form. Bevor Sie die Eierschale schneiden, bedecken Sie den zu schneidenden Bereich mit Klebeband.
HINWEIS: Das Abdecken des Fensterbereichs mit Klebeband verhindert das Brechen der Eierschale an unerwünschte Stellen. Wenn Sie jedoch an einen unerwünschten Ort einbrechen, versiegeln Sie den Bereich mit dem Klebeband. Das Abdecken der zu schneidenden Stellen mit Klebeband verhindert, dass Schalenstücke auf den Dottersack fallen. - Erstellen Sie ein kleines Loch in der Eierschale mit einer scharf zugespitzten Kantenschere an der Stelle, an der die Fensterung gewünscht wird, und beginnen Sie mit dem Schneiden einer kreisförmigen Öffnung. Dieser Vorgang wird als Windowing bezeichnet.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der kreisförmige Schnitt groß genug ist, um einen einfachen Zugang zum Embryo aus jeder Richtung zu ermöglichen. Falls erforderlich, ändern Sie die Eizellposition, um die Position des Embryos anzupassen. - Als nächstes lokalisieren Sie mit einem Stereozoom-Operationsmikroskop die rechte Vitellinarterie (RVA).
HINWEIS: Hühnerembryonen durchlaufen normalerweise eine Thoraxtorsion (zusammen mit zervikaler Beugung usw.), wenn sie sich entwickeln, so dass die linke Seite des Kopfes im 72-Stunden-Stadium gegen das Eigelb ist. Kaudaler, wo die Vitellinarterien den Körper verlassen, ist der Embryo nicht viel verdreht, und dieser Teil des Körpers liegt ventral mit der Seite nach unten zum Eigelb. Wenn man also direkt betrachtet, befindet sich die Rechte des Embryos rechts vom Forscher. - Sobald die RVA lokalisiert ist, erzeugen Sie mit einer 26 G-Nadel zwei kleine Löcher auf der linken und rechten Seite der RVA (Abbildung 2).
- Platzieren Sie die Doppler-Blutfluss-Bildgebungssonde über der RVA. Stellen Sie sicher, dass die Doppler-Blutfluss-Bildgebungssonde 5 ± 1 mm von der Stelle der Ischämie und in Richtung des distalen Endes der RVA platziert wird. Nehmen Sie eine Flussmessung für 2 min und 30 s (oder länger, falls gewünscht) vor. Dies wird die normoxische Phasenmessung sein.
- In der Zwischenzeit formen Sie die Kante der Spinalnadel mit einer Nasenzange und einer Zahnzange manuell in die Form eines Hakens (Abbildung 3). Tun Sie dies, indem Sie den Rand der Spinalnadel für ca. 1 mm biegen. Eine größere Größe erschwert das Einführen und Entfernen der Spinalnadel während des E / A-Verfahrens.
- Führen Sie die Spinalnadel mit einem Mikromanipulator direkt unter die rechte Vitellinarterie ein.
HINWEIS: Führen Sie die Spinalnadel mit äußerster Vorsicht ein, um eine Beschädigung der RVA oder benachbarter Arterien zu vermeiden. Die optimale Technik besteht darin, den speziell entwickelten Haken der Spinalnadel genau über der rechten Seite des RVA-Lochs einzustellen, gefolgt von einem schrittweisen Einführen der speziell entwickelten Kante der Spinalnadel in den Dottersack mit Hilfe eines Mikromanipulators unter Anleitung eines Stereozoom-Operationsmikroskops durch das rechte Loch. Sobald sich der Haken der Spinalnadel im Dottersack befindet, stellen Sie den Haken unter dem RVA schrittweise so ein, dass seine Kante genau unter dem linken Loch platziert ist. Jetzt ist es an der Zeit, die Spinalnadel anzuheben. - Heben Sie nun mit Hilfe des Mikromanipulators die Arterie allmählich an, bis der Doppler-Blutflussfluss eine minimale Abnahme des arteriellen Flusses um 80% anzeigt.
- Sobald ein Drop von 80% oder mehr im Dopplerfluss erreicht ist, lassen Sie die Spinalnadel für 5 Minuten angehoben (ziehen Sie die Arterie nach oben). Dies wird die Periode der Ischämie in der RVA sein.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Dopplerfluss während der Dauer der Ischämie zu überwachen. Wenn eine signifikante Fluktuation festgestellt wird, beenden Sie die Tests. - Nach der 5-minütigen Ischämieperiode lassen Sie die Arterie allmählich frei, um den normalen Blutfluss wiederherzustellen. Stellen Sie sicher, dass ein Doppler-Blutdurchflussmesser Werte anzeigt, die mit denen vergleichbar sind, die während der Normoxie erhalten wurden. Dies ist der Zeitraum der Reperfusion in der RVA (Abbildung 4).
- Nach dem I / R-Verfahren einige Tropfen (2-3) 1x PBS auf den Embryo auftragen und 2-3 Minuten lang beobachten.
HINWEIS: Die Verwendung von 1x PBS verhindert, dass der Embryo austrocknet. - Zum Schluss das Fenster mit Klebeband wieder verschließen und das Ei für 5 h und 55 min wieder in den Eierinkubator legen.
- Nehmen Sie nach 5 h und 55 min das Ei aus dem Eierinkubator, legen Sie es auf das Eierregal, öffnen Sie das Fenster wieder und befolgen Sie das nachgeschaltete Behandlungsprotokoll.
5. Behandlungen
- Für die Behandlung der Arterien mit Medikamenten, Aktivatoren oder Inhibitoren, schneiden Sie die RVA nach 1 h des I / R-Prozesses aus.
- Für die nachgelagerten Studien entfernen Sie den Embryo zunächst aus der Eierschale, indem Sie ihn auf eine sterile 90-mm-Petrischale legen.
- Sobald der Embryo in die Petrischale entlassen wurde, schneiden Sie die RVA unter Verwendung der Augeniris unter Anleitung eines Stereozoom-Operationsmikroskops aus.
- Stellen Sie sicher, dass das Exzisionsmaß von RVA bis zu 15 ± 1 mm (distal vom Stamm), jeweils 5 ± 1 mm auf der linken und rechten Seite der Arterie und 2 ± 1 mm in Richtung Des Rumpfes beträgt.
HINWEIS: Ein Lineal kann verwendet werden, um den zu beschneidenden Bereich zu messen (optional). - Nach dem Ausschneiden der RVA waschen Sie sie mit 1x PBS in einer sterilen Petrischale mit 1x PBS.
- Für die gewünschten Behandlungen legen Sie die Arterie in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (sterilisiert), das mit 500 μL Ringer-Lösung gefüllt ist. Legen Sie die RVA in das Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie für 5 h und 55 min in einen 37 °C Inkubator.
HINWEIS: Abhängig von den Behandlungen verwenden Sie entweder die Ringer-Lösung ohne Behandlung oder die Behandlung mit dem gewünschten Volumen und der gewünschten Konzentration von Medikament, Aktivator oder Inhibitor. - Nach 5 h und 55 min Inkubation nehmen Sie die RVA aus dem 37 °C Laborinkubator und fahren mit den gewünschten Behandlungen fort.
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Representative Results
Die Doppler Blood Flow Imaging-Technik wurde verwendet, um die Wirksamkeit unseres Modells zu bewerten. Kurz gesagt, wir haben die Daten aus der Kontrollgruppe mit den Daten aus der RVA-Gruppe verglichen, um den Erfolg unserer Kreation zu bestimmen. Abbildung 4A zeigt einen typischen Fluss, der mit dem Kontrolltier assoziiert ist, während Abbildung 4B die Ergebnisse einer RVA darstellt. Die Numerische 1-8 stellt die verschiedenen Ereignisse dar, die mit E/A-Phasen verbunden sind. Kurz gesagt, numerisch 1-3 entsprechen der Phase der Normoxie, während ein starker Rückgang des Flusses an den Punkten 3 und 4 die Ereignisse darstellt, die mit der Abnahme des Blutflusses in der RVA verbunden sind. Sobald ein Drop-Down von 80% oder mehr erreicht war, wurde der RVA für die nächsten 5 Minuten angehoben. Dies war die Phase der Ischämie (numerisch 4-5). Nach einem 5-minütigen Anheben der RVA wurde die RVA freigegeben, die durch numerische 6 und 7 dargestellt wird. Der Fluss ab Punkt 7 stellt die Reperfusionsphase dar, die auftritt, nachdem die RVA normale Blutflusswerte erreicht hat, was die Phase der Reperfusion war. Dieses spezielle Experiment zeigte die Wirksamkeit der I / R-Modellierung in dem 3 Tage entwickelten Kükenembryo.
Um den Nutzen unseres Modells zu überprüfen, haben wir die Expressionsmuster von Proteinen, RNA und DNA durch ELISA, Western Blotting, qRT-PCR und Gelelektrophorese-Analyse untersucht. Kurz gesagt, wir haben die 3-tägigen entwickelten Eier in drei experimentelle Gruppen unterteilt: Kontrolle, I / R und Behandlungen + I / R. Ein signifikanter Unterschied in der Expression von Proteinen, Genen und DNA-Integrität wurde zwischen ihren jeweiligen I / R- und Kontrollgruppen beobachtet. Wie unten diskutiert, verbesserte die medikamentöse Behandlung der I /R-Gruppe effektiv das in dieser Gruppe beobachtete Ergebnis im Vergleich zur I/R-behandelten Gruppe allein; Dies steht im Einklang mit unserer vorherigen Veröffentlichung, auf der dieses Protokoll basiert1. Standard-Laborverfahren wurden für ELISA18, Western Blotting19, qRT-PCR20 und Gelelektrophorese21 befolgt, die in diesem Papier nicht behandelt werden (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7, Abbildung 8).
Ischämie-Reperfusion stimuliert mehrere Prozesse, einschließlich der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die für das Gewebe schädlich sind. Die schädlichen Auswirkungen, die durch die Reaktion des intrinsischen antioxidativen Körperabwehrsystems auf ROS verursacht werden, sind ein wichtiges Merkmal von I / R-Verletzungen. Wir untersuchten die Aktivitäten der sauerstoffregulatorischen Proteine 150 (ORP150), der zytoplasmatischen Superoxiddismutase 1 (SOD1) und der Katalase in ischämischen Gefäßen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte I/R die Aktivität von ORP150, zytoplasmatischem SOD1 und Katalase (Abbildung 5A-C). Die Supplementierung mit N-Acetyl-L-Cystein (NAC), einem ROS-Quencher, milderte jedoch den oxidativen Stress der I / R-Gruppe.
Um das Entzündungspotenzial unseres Modells zu beurteilen, untersuchten wir mit ELISA die IL-1β- und TNF-α-Expression (Abbildung 6). Beide Interleukine waren in der I/R-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe überexprimiert, was darauf hindeutet, dass unser Modell das Potenzial hat, in entzündlichen Untersuchungen eingesetzt zu werden. Als nächstes testeten wir die Expression des NOD-ähnlichen Rezeptor-Pyrin-Domänen-haltigen Proteins 3 (NLRP3) Inflammasom-Signalwegs22,23 und des entzündungsfördernden Moleküls NF-kβ24,25, die an der Verstärkung von Entzündungen beteiligt sind, um die Nützlichkeit dieses Modells für Entzündungsstudien zu bestätigen. Als Reaktion auf die in der RVA erzeugte I/R fand diese Untersuchung Hinweise auf die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms (Abbildung 7A) sowie von NF-kβ (Abbildung 7B). Die Behandlung mit Naringenin, einem bekannten entzündungshemmenden Medikament, verbesserte jedoch die entzündlichen Wirkungen, wie sie in den mit Medikamenten behandelten Gruppen beobachtet wurden.
Ischämie-Reperfusion aktiviert programmierte Zelltodwege26,27,28. Wir untersuchten die Auswirkungen von I / R auf Apoptose- und Autophagiewege im Kükenembryo. Abbildung 8A zeigt die Wirkung von I/R auf Caspase-3 und zVAD-fmk. Abbildung 8B-D zeigt, dass die I/R-Gruppe eine höhere Expression von LC3II sowie LC3II/I-Verhältnis (Autophagosomen-Marker), Beclin1 (ein signifikanter Regulator der Autophagie in Säugetierzellen) und Atg7 (benötigt für die basale Autophagie) aufwies als die Kontrollgruppe auf Proteinebene. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 8E die Wirkung der I/R auf die mRNA-Spiegel. Die Zugabe von 3-MA, einem Autophagie-Inhibitor, kehrte die Ergebnisse jedoch um. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Modell verwendet werden könnte, um verschiedene Zelltodprozesse (z. B. Nekroptose) zu untersuchen. Abbildung 9 zeigt, wie effizient die Veränderungen auf DNA-Ebene mit unserem Hook-I/R-Modell untersucht werden können.
Schließlich vergleichen wir die Ergebnisse des Hook-I/R-Modells und des MODELLS der mittleren Zerebralarterienverschlüsse (MCAO), um zu sehen, wie effektiv unser Modell im Vergleich zu anderen Modellen ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass I/R-behandelte RVAs höhere Spiegel des apoptotischen Proteins gespaltenen Caspase-3, der Autophagieproteine Beclin1 und Atg7 und der entzündlichen Interleukine TNF-α und IFN-Ƴ aufwiesen als Kontroll-RVAs. Interessanterweise lieferte das Hook-I/ R-Modell bei der Analyse von Entzündungsstress oder zellulären Todeswegen Ergebnisse, die denen des MCAO-Modells sehr ähnlich waren (Abbildung 10).
Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm eines typischen Aufbaus des Hook-I/R-Kükenembryo-Ischämie-Reperfusionsmodells. Das Bild zeigt die Anforderungen an Hook-I / R-Chick-Embryo-Ischämie-Reperfusionsexperimente, wie das Stereo-Zoom-Operationsmikroskop, das Laser-Doppler-Blutdurchflussmesser, den Mikromanipulator, die Spinalnadel, die 72 h entwickelten Kükenembryonen und eine Beleuchtungsquelle. " Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives Bild eines 3-tägigen Kükenembryo, der eine Verschlussstelle und einen Bereich der Gewebeexzision aufweist. (A) Das Dreieck zeigt den Ort der Exzision des Gewebes für Western Blotting, RNA und DNA-Isolierung. Der Stern und die Punkte stellen den Ort des Verschlusses und die Löcher dar, die auf der linken und rechten Seite des RVA entstehen, um die Nadel unter die Arterie einzuführen, um sie anzuheben. Ein vergrößertes Bild des Bereichs der Gewebeextraktion wird ebenfalls mitgeliefert. Die Notation A repräsentiert das Auge, B repräsentiert das Herz, C repräsentiert die linke Seite der Vitellinarterie und C' repräsentiert die rechte Seite der Vitellinarterie. (B) Eine schematische Darstellung der rechten Seite des Kükenembryons zeigt den Bereich der Gewebeexzision in der Nähe von RVA. Die gerade Linie stellt die RVA dar, die aus dem Embryonenstamm austritt. Der Stern auf der vertikalen Linie symbolisiert die Position der Laser Doppler Blutflusssonde. Die Kreuzung bezeichnet den Ort der Okklusion. Die Exzision der Arterien erfolgte bis zu 15 ± 1 mm (distal vom Rumpf), jeweils 5 ± 1 mm auf der linken und rechten Seite der Arterie und 2 ± 1 mm in Richtung Rumpf. Alle Messungen zeigen Entfernungen vom Ort der Okklusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Bild einer Spinalnadel mit einem maßgefertigten Haken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Darstellung eines typischen Laser-Doppler-Blutdurchflussmessersignals. Ein typisches Laser-Doppler-Blutdurchflussmessersignal wurde an einer 3-tägigen Kükenembryoarterie aus einem Kontrollgruppenei (A) gemessen. Ereignisse zu Studienbeginn (1), während der Normoxie (2), sofortiges Pre-Lifting von RVA (3), sofortiges Post-Lifting von RVA (4), während Ischämie (5), sofortiges Pre-Releaseing von RVA (6), sofortiges Pre-Reperfusion (7), während Reperfusion (8) in der mit Ischämie behandelten Gruppe, wie vom Laser Doppler-Blutflussmesser (B) aufgezeichnet. Diese Zahl wurde von Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; unter einer CC-BY-Lizenz)1 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Wirkung der Ischämie-Reperfusion auf die Expression von oxidativen Stress-Markerproteinen. Western Blotting wurde verwendet, um die ORP150-, SOD1- und Katalase-Expressionsniveaus zu bestimmen. (A) Die ORP150-Expression war nach einer I/R-Schädigung erhöht. NAC, ein Pan-ROS-Inhibitor, senkte ORP150 auf ein Niveau, das mit dem der Kontrolle vergleichbar ist. (B) Nach I/R war die SOD1-Expression erhöht. Die SOD1-Expression war nach der NAC-Behandlung ebenfalls erniedrigt. (C) Das I/R-Ereignis induzierte die Expression der Katalase. RVA, die mit I/R behandelt und NAC ausgesetzt wurde, zeigte eine Abnahme der Katalasespiegel. GAPDH (A,C) und β-Actin (B) wurden als interne Kontrollen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Abschätzung von IL-1β und TNF-α mittels ELISA. ELISA wurde verwendet, um IL-1β und TNF-α zu quantifizieren, und die Ergebnisse zeigten, dass es einen Anstieg der IL-1β- und TNF-α-Expression gab, die durch die Zugabe von Naringenin gemildert wurde. Für diese Studie wurde die ANOVA gefolgt vom Newman-Keuls-Test angewendet. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Wirkung der Ischämie-Reperfusion auf die Expression von Entzündungsmarkerproteinen. (A) Die I/R-Behandlung führte zu einer erhöhten Expression von NLRP3. Die Inkubation der mit I/R behandelten RVA mit Naringenin verringerte die Expression von NLRP3. (B) Ähnlich wie bei NLRP3 war auch die Expression von NF-kβ nach der I/R-Behandlung erhöht. Die Behandlung von Naringenin reduzierte die Expression von NF-kβ. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Wirkung der Ischämie-Reperfusion auf den apoptotischen und autophagischen Status von RVA-Zellen. (A) Um die Induktion der Apoptose durch den I/R-Prozess zu untersuchen, wurde die Expression der gespaltenen Caspase 3 mittels Western Blotting untersucht. Nach einer I/R-Schädigung wurde der Gehalt an gespaltener Caspase 3 erhöht. Die Behandlung mit zVAD-fmk, einem Apoptosehemmer, verringerte jedoch die gespaltene Caspase-3-Expression. (B-D) Um die Induktion der Autophagie nach I/R zu bewerten, wurde die Expression von LC3II/I, Beclin1 und Atg7 bestimmt. Nach I/R nahm die Expression aller autophagischen Marker zu, während die Exposition von I/R-behandelter RVA gegenüber dem Autophagie-Inhibitor 3-MA die Expression aller Proteine auf Kontrollniveaus verringerte. Als interne Kontrolle wurde GAPDH eingesetzt. (E) qRT-PCR wurde verwendet, um die Induktion der Autophagie zu bestätigen und die Ambra1- und Atg7-mRNA-Expressionsniveaus zu bestimmen. Beide Gene zeigten einen signifikanten Anstieg der Expression in der I/R-Gruppe im Vergleich zur Kontrolle, die nach der NAC-Therapie auf ein nahezu normales Niveau zurückgeführt wurde. GAPDH wurde als interne Kontrolle für qRT-PCR-Experimente verwendet. Für Experiment (E) wurde die ANOVA, gefolgt vom Newman-Keuls-Test, angewendet. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Wirkung der Ischämie-Reperfusion auf DNA-Schäden. Um festzustellen, ob I / R DNA-Kerben induziert, untersuchten wir DNA-Schäden mittels Gelelektrophorese. I/R führte zu einem genomischen DNA-Abbau, wie durch Verschmieren in der I/R-Probe gezeigt wurde. NAC-Therapie von I/R-geschädigter RVA reduzierte DNA-Schäden. Eine 1 kb DNA-Leiter wurde verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Vergleich des Hook-I/R-Modells mit dem MCAO-Modell. Es wurde ein Vergleich zwischen den vom Hook-I/R-Modell generierten Daten und den vom MCAO-Modell generierten Daten durchgeführt. (A) Die Expression des apoptotischen Proteins Caspase-3 und der Autophagieproteine Beclin1 und Atg7 war in I/R-behandelten RVAs höher als die Expression der gleichen Proteine in Kontroll-RVAs, was mit den Ergebnissen der MCAO-Experimente übereinstimmte. (B) Es wurde festgestellt, dass die TNF-α- und IFN-Ƴ-Spiegel sowohl in der RVA- als auch in der MCAO-Gruppe im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen erhöht waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Materials/der Ausrüstung | Konzentration | Autoklav | Lagerung | ||
| Reagenzien für Ringers Lösung | |||||
| Natriumchlorid | 123 mM | ||||
| Kaliumchlorid | 4,96 mM | ||||
| Calciumchlorid | 1,53 mM | ||||
| Steriles destilliertes Wasser | 100 ml | ||||
| Ph | 7.4 | 15 min bei 121 °C | == Einzelnachweise == | ||
| Reagenzien für 0,9% normale Kochsalzlösung | |||||
| Natriumchlorid | 154m | ||||
| Steriles destilliertes Wasser | 100 ml | ||||
| Ph | 7.4 | 15 min bei 121 °C | == Einzelnachweise == | ||
| Reagenzien für 70% Ethanol | |||||
| 70% Ethanol | 70 ml | ||||
| Steriles destilliertes Wasser | 30 ml | Nicht erforderlich | == Einzelnachweise == | ||
| Reagenzien für 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung | |||||
| Natriumchlorid | 136,8 mM | ||||
| Kaliumchlorid | 26,8 mM | ||||
| Kaliumphosphat einbasisch wasserfrei | 14,6 mM | ||||
| Di-Natriumhydrogenphosphat-Heptahydrat | 5,37 mM | ||||
| Steriles destilliertes Wasser | 100 ml | 15 min bei 121 °C | == Einzelnachweise == | ||
Tabelle 1: Rezeptur der in dieser Studie verwendeten Lösungen.
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Discussion
Ziel der Ischämie-Reperfusionsforschung ist es, therapeutische Strategien zu entwickeln, die den Zelltod verhindern und die Genesung fördern29,30. Um die aktuellen Einschränkungen in der I/R-Forschung zu überwinden, haben wir ein Hook I/R-Kükenembryomodell entwickelt, um ein zuverlässiges und reproduzierbares I/R-Modell zu erstellen. Unseres Wissens nach ist unser Modell das erste I / R-Modell, das jemals in einem 3-tägigen Kükenembryo für routinemäßige I / R-Experimente erstellt wurde, neben der Untersuchung von Stresssignalen (z. B. oxidativer und entzündlicher Stress). Angesichts der Vorteile der Größe und Zugänglichkeit am Tag 3 der Entwicklung31 wurde der Kükenembryo in einem Entwicklungsstadium von 72 h verwendet, da das Modell eine hohe Leistung, eine einfache Anwendung und eine Anpassungsfähigkeit für die Routineanalyse32 aufweist. Kurz gesagt, am Entwicklungstag 3 ist das In-Ovo-Küken ein hochgradig kontrolliertes, aber zugängliches und einigermaßen transparentes Modell innerhalb des Eies, das verwendet werden kann, um die normale Physiologie, die Krankheitspathologie und die Auswirkungen der experimentellen Behandlung zu visualisieren. Seine enorme Größe macht es besonders nützlich für die Untersuchung der Bildung und des Verhaltens des Embryos während der normalen Physiologie sowie stress33. Obwohl ältere Kükenembryonen (solche, die 4 Tage oder länger inkubiert wurden) verwendet werden können, und wir haben es zu einem späteren Zeitpunkt versucht, ist die Verwendung älterer Embryonen als Modellsysteme durch die Tatsache stark eingeschränkt, dass der Dottersack über 3 Tage der Entwicklung hinaus so dick wird, dass chirurgische Eingriffe schwierig sind. Es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass, während die RVA in einem frühen Zeitfenster (z. B. an Tag 1 oder 2) nicht vollständig gebildet ist, Fenster zu Teratogenität führen könnte34. Neben den Einschränkungen, die mit einem frühen oder späten Zeitpunkt der Entwicklung verbunden sind, dient ein 72-stündiger Kükenembryo als ideales Modell für die Erforschung des I / R-Prozesses, da 3-Tage-Kükenembryonen ein gut definiertes Kreislaufsystem haben30.
Das Verständnis der Pathophysiologie von I / R-Verletzungen ist ein wichtiges Ziel bei der Entwicklung eines I / R-Modells. Derzeit gibt es kein klinisch nützliches Therapeutikum zur Verringerung von Ischämie-Reperfusionsschäden1,35. Infolgedessen wurde eine breite Palette von In-vitro- und In-Vivo-Modellen vorgeschlagen. In diesem Zusammenhang wurde erstmals die I/R-Modellierung in einem sich 3 Tage entwickelnden Kükenembryo in ovo vorgeschlagen. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die Okklusion-Reperfusion des arteriellen Blutflusses pathologische Veränderungen in experimentellen Modellen verursacht, die denen beim Menschen ähnlich sind36,37,38, so dass wir hofften, dass unser Modell dasselbe tun würde (wie oxidativer und entzündlicher Stress, der in In-vivo-Modellen oder bei Patienten beobachtet wurde). Mit den Ergebnissen unserer Studie erwies sich die obige Hypothese als richtig.
Die Blutzirkulation von Embryonen zum Dottersack wird in Kükenembryonen durch Vitellingefäße gesteuert39. Embryonen erhalten Nährstoffe aus dem Eigelb und diffundieren Sauerstoff aus der Luft über die Vitellinzirkulation; Dadurch werden alle Vitellingefäße eingeschränkt, die die Ernährung und den Sauerstofftransfer stören können. Basierend auf diesen Tatsachen wurde die Ischämie induziert, indem die Blutversorgung der RVA für 5 minuten verschlossen wurde, gefolgt von einer Reperfusion für weitere 5 h und 55 min. Das vorgeschlagene Modell kann verwendet werden, um eine Reihe verschiedener Krankheitsprozesse im Zusammenhang mit I / R zu untersuchen und eine Vielzahl von Medikamenten und deren Ziele zu testen. Mit dem aktuellen Modell lassen sich Veränderungen in DNA, RNA und Proteinen untersuchen. Es hat das Potenzial, eine hohe Leistung zu erzielen. Neben seiner Einfachheit und Anpassungsfähigkeit für die regelmäßige Analyse kann das Modell auch das kurzfristige Stammzell-Homing untersuchen, das in zukünftigen Studien untersucht wird.
Im Vergleich zu In-vitro-Modellen ist unser Modell einfach zu bedienen, kostengünstig und wächst schnell und ist ethisch unschuldig32. Das Vorhandensein von Mikrovaskulatur, das Immunsystem und physiologische Bewertungen sind alle Vorteile gegenüber In-vitro-Modellen , während niedrige Kosten, Zeitwirksamkeit und keine ethischen Probleme Vorteile gegenüber In-vivo-Modellen sind40. Die oben genannten Vorteile deuten darauf hin, dass unser Modell einen vergleichbaren Effekt wie die anderen derzeit verwendeten I/R-Modelle hat (Abbildung 10). Ein potenzielles Manko ist die Unfähigkeit des aktuellen Modells, den Infarktbereich zu quantifizieren. Die direkte Infarktbeurteilung kann ein wertvoller Biomarker für I/R-vermittelte Schäden und eine Methode zur Abbildung der Wirkungen verschiedener Therapiemedikamente sein. So versuchten wir, den Infarktbereich zu quantifizieren, konnten dies aber aufgrund der empfindlichen Struktur der 72 h-entwickelten Küken nicht tun. Daher ist zusätzliche Forschung erforderlich, um die Strategien und Pfade für I / R-Prozesse umfassend zu bewerten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Modell verwendet werden kann, um verschiedene Krankheitswege im Zusammenhang mit I / R zu untersuchen und eine Vielzahl von Medikamenten und deren Ziele zu screenen. Aufgrund seiner hohen Reproduzierbarkeit, Kosteneffizienz und Einfachheit gehen wir davon aus, dass unser Modell eine wertvolle Ressource für die Grundlagenforschung und die translationale Forschung sein wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine gegensätzlichen Interessen.
Acknowledgments
Wir möchten Hari Shankar für seine kritischen Beiträge während der Videografie und des Schnitts, Herrn Baqer Hussain für voice-over, Herrn Asghar Rizvi für den Videoschnitt, Herrn Mohammad Haider für Videodrehs, Herrn Mohammad Danish Siddiqui für die Unterstützung während der Experimente danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
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