Summary
Dette papir beskriver iskæmi-reperfusion (I / R) modellering i en 3-dages chick embryo ved hjælp af en spinal nål tilpasset krog til bedre at forstå I / R udvikling og behandling. Denne model er enkel, hurtig og billig.
Abstract
Iskæmi og reperfusion (I / R) lidelser, såsom myokardieinfarkt, slagtilfælde, og perifer vaskulær sygdom, er nogle af de førende årsager til sygdom og død. Mange in vitro - og in vivo-modeller er i øjeblikket tilgængelige til undersøgelse af I/R-mekanismen i sygdom eller beskadiget væv. Til dato er der imidlertid ikke rapporteret nogen in ovo I/R-model, hvilket ville give mulighed for en bedre forståelse af I/R-mekanismer og hurtigere lægemiddelscreening. Dette papir beskriver I / R modellering ved hjælp af en spinal nål tilpasset krog i en 3-dages chick embryo til at forstå I / R udvikling og behandlingsmekanismer. Vores model kan bruges til at undersøge anomalier på DNA, RNA, og protein niveauer. Denne metode er enkel, hurtig og billig. Den nuværende model kan bruges uafhængigt eller sammen med eksisterende in vitro - og in vivo I/R-modeller.
Introduction
Iskæmi-reperfusion vævsskade er blevet knyttet til en række patologier, herunder hjerteanfald, iskæmisk slagtilfælde, traumer, og perifer vaskulær sygdom1,2,3,4,5. Dette skyldes primært en mangel på en omfattende forståelse af sygdommens progression og manglen på en effektiv forskningsmodel. Iskæmisk skade opstår, når blodforsyningen til et bestemt område af vævet er afskåret. Som et resultat, iskæmisk væv i sidste ende nekrotizes, selv om satsen varierer afhængigt af vævet. Hvis blodforsyningen genoprettes, kan det derfor være med til at mindske skaderne. Det er imidlertid blevet observeret, i nogle tilfælde, at reperfusion forårsager mere vævsskade end iskæmi alene gør6,7,8. Derfor er det nødvendigt at forstå de molekylære og cellulære mekanismer i iskæmi-reperfusion for at udvikle en effektiv terapeutisk intervention. I øjeblikket er ingen effektiv behandling for I / R-skader kendt. Denne forskel har foranlediget oprettelsen af nye eksperimentelle modeller, lige fra in vitro til in vivo modeller, til at løse det eksisterende problem9,10,11,12,13.
Chick embryoner (Gallus gallus domesticus) er meget udbredt i forskning på grund af deres nem adgang, etisk accept, relativt stor størrelse (sammenlignet med andre embryoner), lave omkostninger, og hurtig vækst14. Vi brugte en chick embryo på 72 h af udvikling til at skabe en in ovo I / R ved okkludering og frigivelse af den rigtige vitelline arterie ved hjælp af en spinal nål. Vi kaldte det Hook-I/R iskæmi-reperfusion model (Figur 1). Den model, der anvendes i denne undersøgelse er i stand til præcist at simulere alle downstream processer, herunder oxidative og inflammatoriske veje, som ofte er forbundet med I / R skader15,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionelle Animal Etiske Komité på Era's Lucknow Medical College og Hospital udstedt en skriftlig dispensation om, at ingen formel godkendelse var forpligtet til at udføre disse eksperimenter i overensstemmelse med udvalget med henblik på kontrol og tilsyn med forsøg på dyr (CPCSEA). Standarddriftsprocedurer blev imidlertid fulgt for at minimere ethvert potentiale for fosterlid.
1. Forberedelse af buffer (tabel 1)
- Forbered Ringers løsning
- For at forberede Ringers opløsning opløses 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) i 70 mL steril destilleret H2O med et endeligt volumen på 100 mL. PH-tallet justeres til 7,4. Lad det opløses helt og autoklave. Derefter filtreres gennem et 0,22 μm filter, aliquot i engangsbeløb (ca. 10 mL) og opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered normal saltvand (0,9% natriumchlorid, NaCl).
- I 70 mL steril destilleret H2O opløses 0,9 g NaCl (154 mM). Op udgør lydstyrken til 100 mL. Autoklave i 15 min ved 121 °C. pH-skærmen justeres til 7,4 med 0,1 N HCl eller 0,1 N NaOH, hvis det er nødvendigt. Lav 10 mL aliquots i et 15 mL sterilt centrifugerør og opbevares ved stuetemperatur.
- Klargør 70% ethanol (v/v).
- Bland 70 mL ren ethanol (Mol. wt. 46,07 g/L) til 30 mL steril H2O. Forbered efter behov eller opbevares ved stuetemperatur. Der er ikke behov for sterilisering.
- Forbered 1x Fosfat Buffer Saltvand (1x PBS).
- Der fremstilles 100 mL 1x PBS ved tilsætning af 0,144 g Na2HPO4.7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14.6 mM) til 70 mL destilleret vand. Volumenopløses og fyldes til 100 mL og autoklave i 15 min ved 121 °C. Bring pH til 7,4, tilføje et par dråber på 0,1 N HCl eller 0,1 N NaOH, hvis det er nødvendigt. Lav aliquots på 10 mL i et 15 mL sterilt centrifugerør og opbevares ved stuetemperatur.
2. Dag 1
- Arranger alle de værktøjer, der er nødvendige for ægsterilisering (70% ethanol, rengøringsservietter, et ægstativ og en OHP-markør).
- Rengør 0-dages æg med 70% ethanol ved hjælp af vævspapirservietter. Brug kun et 0-dages æg, da ældre æg muligvis ikke giver anledning til et embryo.
- Skriv dags dato på æg med en OHP-markør.
- Læg æggene i en æginkubator indstillet til en temperatur på 36-37 °C og et fugtighedsniveau på 60%-65%. Inkuber æggene i de næste 24 timer.
3. Dag 2
- Arranger det nødvendige udstyr til tilbagetrækning af 5-6 mL albumin (skarp kant saks, 5 mL sprøjte, 18 G nål, sprøjte discarder, og tape).
- Tør den kirurgiske saks af med 70% ethanol eller sterilisere ved hjælp af en autoklave efter aftørring af dem med 70% ethanol.
- Tag nu ægget fra æggeinkubatoren på 37 °C til lagdeling.
- Placer ægget på et rent æggestativ.
- Fastgør et lille stykke tape (størrelse: ca. 1-tommer længde x bredde) til æggets kant.
- Lav et lille hul i kanten af æggeskallen ved hjælp af skarpspids kant saks. Sæt en 5 mL sprøjte i en omtrentlig vinkel på 75°.
BEMÆRK: 5 ML sprøjten leveres med en 24 G x 1 nål (steril), men det er godt at udskifte 24 G x 1 nål med en 18 G x 1,5 nål (steril). Den 18 G x 1,5 nål er 1,25 x 38 mm i bredden. Derfor vil det lette fjernelsen af albumin. - Efter at have indsat nålen i æggeblommesækken, skal du langsomt trække 5-6 mL albumin tilbage.
BEMÆRK: Dette giver embryoet en seng, hvor det kan vokse. Tilbagetrækning af albumin forhindrer overspill af albumin, mens du opretter et vindue. Endelig mindskes risikoen for, at embryoet beskadiges under vinduesvinduet, ved at eliminere 5-6 mL albumin. - Når albuminet er fjernet, skal du gense åbningen med tape og lade æggene inkubere ved 37 °C i 48 timer.
4. Dag 4
- Forbered Ringers opløsning, 0,9% normal saltvand og 1x PBS som beskrevet i protokollens afsnit 1. Derefter autoklave de tre løsninger. Efter autoklavering skal du placere den respektive opløsning ved stuetemperatur.
- Tag ægget ud af æggeinkubatoren på 37 °C, og skær skallen i cirkulær form. Før du skærer æggeskallen, skal du dække det område, der skal skæres med tape.
BEMÆRK: At dække vinduesområdet med tape forhindrer æggeskallens brud på uønskede steder. Men hvis du bryder ind på et uønsket sted, forsegle området med tape. Dækker de steder, der skal skæres med tape forhindrer shell stykker fra at falde på æggeblomme sækken. - Opret et lille hul i æggeskallen med en skarpt spids kant saks på det sted, hvor vinduet ønskes og begynde at skære en cirkulær åbning. Denne proces kaldes vindue.
BEMÆRK: Sørg for, at det cirkulære snit er stort nok til at give nem adgang til embryoet fra enhver retning. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre æggets position for at imødekomme embryoets position. - Dernæst ved hjælp af et stereo zoom kirurgisk mikroskop, finde den rigtige vitelline arterie (RVA).
BEMÆRK: Kyllingembryoner gennemgår normalt thorax torsion (sammen med livmoderhalskræftfleksur osv.), som de udvikler sig, således at venstre side af hovedet er mod æggeblommen på 72 timers stadium. Mere caudally, hvor vitelline arterier forlade kroppen, embryoet er ikke meget snoet, og denne del af kroppen ligger ventral side ned mod æggeblommen. Så ser direkte, højre for embryoet er til højre for forskeren. - Når RVA er placeret, skal du oprette to små huller på venstre og højre side af RVA ved hjælp af en 26 G nål (figur 2).
- Placer Doppler-blodgennemstrømningsbilledsonden over RVA' en. Sørg for, at Doppler-blodgennemstrømningsbilledsonden placeres 5 ± 1 mm fra iskæmistedet og mod RVA's distale ende. Tag en flux læsning i 2 min og 30 s (eller længere, hvis det ønskes). Dette vil være normoxic fase læsning.
- I mellemtiden, ved hjælp af en næse tænge og tandede tang, manuelt forme spinal nål kant i form af en krog (Figur 3). Gør dette ved at bøje kanten af rygmarvsnålen i ca. 1 mm. En større størrelse vil gøre det vanskeligere at indsætte og fjerne rygmarvsnålen under I / R-proceduren.
- Indsæt rygmarvsnålen direkte under den højre vitelline arterie ved hjælp af en mikromanipulator.
BEMÆRK: Sæt rygmarvsnålen med ekstrem forsigtighed for at undgå at beskadige RVA eller tilstødende arterier. Den optimale teknik er at justere rygmarvsnålens specialdesignede krog nøjagtigt over højre side af RVA-hullet, efterfulgt af gradvist at indsætte rygmarvsnålens specialdesignede kant i æggeblommesækken ved hjælp af en mikromanipulator under vejledning af et stereozoo-kirurgisk mikroskop gennem det rigtige hul. Når rygmarvsnålens krog er i æggeblommesækken, skal du gradvist justere krogen under RVA' en, så kanten er nøjagtigt placeret under venstre hul. Nu er det tid til at løfte rygmarvsnålen. - Nu, ved hjælp af mikromanipulatoren, gradvist løfte arterien, indtil Doppler blodgennemstrømningen flux indikerer et minimum fald på 80% i arteriel flow.
- Når en dropdown på 80% eller mere i Doppler flux er opnået, lad rygmarvsnålen løftet (trække arterien opad) i 5 min. Dette vil være perioden med iskæmi i RVA.
BEMÆRK: Det er vigtigt at overvåge Doppler-fluxen under iskæmiperioden. Hvis der konstateres betydelige udsving, skal testene afsluttes. - Efter 5 min iskæmi periode, gradvist frigive arterien for at genoprette normale blodgennemstrømningsniveauer. Sørg for, at en Doppler-blodgennemstrømningsmåling viser værdier, der kan sammenlignes med dem, der opnås under normoxi. Dette vil være perioden med reperfusion i RVA (figur 4).
- Efter I / R-proceduren skal du anvende et par dråber (2-3) af 1x PBS på embryoet og se det i 2-3 min.
BEMÆRK: Brugen af 1x PBS hjælper med at forhindre embryoet i at tørre ud. - Endelig reseal vinduet med tape og læg ægget tilbage i æg inkubatoren i 5 timer og 55 min.
- Efter 5 timer og 55 min skal du tage ægget fra æginkubatoren, placere det på æggestativet, genåbne vinduet og følge downstream-behandlingsprotokollen.
5. Behandlinger
- Til behandling af arterierne med lægemidler, aktivatorer eller hæmmere, punktafgifter RVA efter 1 h af I / R-processen.
- Til downstream-undersøgelserne skal embryoet først fjernes fra æggeskallen ved at placere det på en steril 90 mm petriskål.
- Når embryoet er frigivet i Petriskålen, punktafgifter RVA ved hjælp af okulær iris under vejledning af et stereo zoom kirurgisk mikroskop.
- Sørg for, at excisiondimensionen af RVA er op til 15 ± 1 mm (distal fra bagagerummet), 5 ± 1 mm hver på venstre og højre side af arterien og 2 ± 1 mm mod bagagerummet.
BEMÆRK: En lineal kan bruges til at måle det område, der skal fjernes (valgfrit). - Efter at have undtaget RVA'en, vaskes den med 1x PBS i en steril petriskål indeholdende 1x PBS.
- For de ønskede behandlinger placere arterien i en 1,5 mL centrifuge rør (steriliseret) fyldt med 500 μL af Ringers opløsning. Anbring RVA'en i centrifugerøret, og læg den i en inkubator på 37 °C i 5 timer og 55 min.
BEMÆRK: Afhængigt af behandlingerne skal du enten bruge Ringers opløsning uden nogen behandling eller behandling med den ønskede volumen og koncentration af lægemiddel, aktivator eller hæmmer. - Efter 5 timer og 55 minutters inkubation skal RVA'en ud af 37 °C-laboratorieinkubatoren og fortsætte med de ønskede behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doppler Blood Flow Imaging-teknikken blev brugt til at evaluere effektiviteten af vores model. Kort sagt sammenlignede vi dataene fra kontrolgruppen med data fra RVA-gruppen for at bestemme succesen af vores oprettelse. Figur 4A viser en typisk flux, der er forbundet med kontroldyret, mens figur 4B viser resultaterne fra en RVA. Den numeriske 1-8 repræsenterer de forskellige hændelser, der er knyttet til I/R-faser. Kort sagt svarer numerisk 1-3 til normoxiafasen, mens et kraftigt fald i flux ved punkt 3 og 4 repræsenterer de hændelser, der er forbundet med faldet i blodgennemstrømningen i RVA. Når en 80% eller større drop-down var opnået, RVA blev efterladt hævet for de næste 5 min. Dette var fasen af iskæmi (numerisk 4-5). Efter en 5 minutters løft af RVA blev RVA frigivet, som er repræsenteret ved numerisk 6 og 7. Fluxen fra punkt 7 og fremefter repræsenterer reperfusionsfasen, som opstår, efter at RVA har opnået normale blodgennemstrømningsniveauer, som var reperfusionsfasen. Dette særlige eksperiment viste effektiviteten af I/R-modellering i det 3-dages udviklede kyllingefoster.
For at verificere nytten af vores model har vi studeret ekspresmønstrene for proteiner, RNA og DNA gennem ELISA, vestlig blotting, qRT-PCR og gelelektroforeseanalyse. Kort sagt opdelte vi de 3-dages udviklede æg i tre eksperimentelle grupper: kontrol, I / R og Behandlinger + I / R. En signifikant forskel i ekspression af proteiner, gener og DNA-integritet blev observeret mellem deres respektive I / R og kontrolgrupper. Som beskrevet nedenfor forbedrede lægemiddelbehandlingen af I/R-gruppen effektivt det resultat, der blev observeret i denne gruppe, sammenlignet med den I/R-behandlede gruppe alene. Dette er i overensstemmelse med vores forudgående offentliggørelse, som denne protokol er baseret på1. Der blev fulgt standardlaboratorieprocedurer for ELISA18, vestlig blotting19, qRT-PCR20 og gelelektrofores21, som ikke er dækket af dette papir (figur 5, figur 6, figur 7, figur 8).
Iskæmi-reperfusion stimulerer flere processer, herunder dannelsen af reaktive iltarter (ROS), der er skadelige for væv. De skadelige virkninger forårsaget af den iboende antioxidant krop forsvarssystemer reaktion på ROS er et vigtigt element i I / R skade. Vi undersøgte aktiviteterne i iltregulerende proteiner 150 (ORP150), cytoplasmisk superoxid dismutase 1 (SOD1) og katalase i iskæmiske fartøjer. Sammenlignet med kontrolgruppen forhøjede I/R aktiviteten af ORP150, cytoplasmisk SOD1 og katalase (figur 5A-C). Men, tilskud med N-Acetyl-L-Cystein (NAC), en ROS quencher, afbødes I / R-gruppens oxidative stress.
For at vurdere vores models inflammatoriske potentiale brugte vi ELISA til at undersøge IL-1β og TNF-α udtryk (Figur 6). Begge interleukins var overekspresserede i I / R-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket indikerer, at vores model har potentialet til at blive brugt i inflammatoriske undersøgelser. Dernæst testede vi udtrykket af den NOD-lignende receptor pyrin domæneholdige protein 3 (NLRP3) inflammasome pathway22,23, og pro-inflammatorisk molekyle, NF-kβ24,25, som er involveret i at forstærke inflammation, for at bekræfte nytten af denne model for inflammatoriske undersøgelser. Som reaktion på I/R, der blev genereret i RVA, fandt denne undersøgelse tegn på aktivering af NLRP3-inflammasomet (figur 7A) samt NF-kβ (figur 7B). Imidlertid, behandling med Naringenin, et velkendt antiinflammatorisk lægemiddel, forbedrede de inflammatoriske virkninger, som observeret i de lægemiddelbehandlede grupper.
Iskæmi-reperfusion aktiverer programmerede celledødsveje26,27,28. Vi studerede virkningerne af I / R på apoptose og autofagi veje i chick embryo. Figur 8A skildrer virkningen af I/R på caspase-3 og zVAD-fmk. Figur 8B-D viser, at I/R-gruppen havde et højere udtryk for LC3II samt LC3II/I-forholdet (autophagosomes-markør), Beclin1 (en signifikant regulator for autofagi i pattedyrceller) og Atg7 (nødvendig for basal autofagi) end henholdsvis kontrolgruppen ved proteinniveauer. I modsætning hertil viser figur 8E I/R's virkning på mRNA-niveauerne. Tilføjelsen af 3-MA, en autofagi hæmmer, dog vendt resultaterne. Disse resultater tyder på, at modellen kan bruges til at undersøge forskellige celledødsprocesser (f.eks. nekrose). Figur 9 viser, hvor effektivt ændringerne på DNA-niveau kan studeres ved hjælp af vores Hook-I/R-model.
Endelig sammenligner vi resultaterne fra Hook-I /R-modellen og den midterste cerebrale arterie okklusion (MCAO) model for at se, hvor effektiv vores model er i forhold til andre modeller. For at opsummere, I / R-behandlede RVAs havde højere niveauer af det apoptotiske protein kløvet caspase-3, autofagi proteiner Beclin1 og Atg7, og de inflammatoriske interleukins TNF-α og IFN-Ƴ end kontrol RVAs. Interessant, uanset om du analyserer inflammatorisk stress eller cellulære dødsveje, producerede Hook-I / R-modellen resultater, der var meget lig dem, der blev opnået af MCAO-modellen (Figur 10).
Figur 1: Et skemat diagram over en typisk opsætning af Hook-I/R chick embryo iskæmi-reperfusion model. Billedet viser Hook-I/R chick embryo iskæmi-reperfusion eksperimenter krav, såsom stereo zoom kirurgisk mikroskop, laser Doppler blodgennemstrømningmeter, mikromanipulator, spinal nål, 72 h udviklet chick embryoner, og en belysning kilde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativt billede af et 3-dages chick embryo-udstillingssted for okklusion og område af væv excision. (A) Trekanten viser placeringen af excision af vævet til vestlig blotting, RNA, og DNA isolation. Stjernen og prikkerne repræsenterer okklusionsstedet og hullerne, der er oprettet på venstre og højre side af RVA for at indsætte nålen under arterien for at løfte den. Et forstørret billede af området for vævsudvinding er også forsynet sammen med det. Notationen A repræsenterer øjet, B repræsenterer hjertet, C repræsenterer venstre for vitelline arterien, og C' repræsenterer højre for vitelline arterie. B) En skematisk repræsentation af højre side af kyllingembryoet viser området for vævs excision i nærheden af RVA. Den lige linje repræsenterer RVA kommer ud af embryo stammen. Stjernen på den lodrette linje symboliserer placeringen af Laser Doppler blodgennemstrømning sonde. Krydset angiver okklusionsstedet. Excision af arterierne blev gjort op til 15 ± 1 mm (distal fra bagagerummet), 5 ± 1 mm hver på venstre og højre side af arterien og 2 ± 1 mm mod bagagerummet. Alle målinger viser afstande fra okklusionsstedet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativt billede af en rygmarvsnål med en skræddersyet krog.
Figur 4: Repræsentation af et typisk Laser Doppler-blodgennemstrømningssignal. En typisk Laser Doppler blodgennemstrømningometer signal blev målt på en 3-dages chick embryo arterie fra en kontrolgruppe æg (A). Hændelser ved baseline (1), under normoxia (2), øjeblikkelig forhjulsløftning af RVA (3), øjeblikkelig efterløft af RVA (4), under iskæmi (5), øjeblikkelig for frigivelse af RVA (6), øjeblikkelig postreperfusion (7), under reperfusion (8) i den iskæmibehandlede gruppe som registreret af Laser Doppler-blodgennemstrømningmeteret (B). Dette tal blev vedtaget fra Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; under en CC-BY-licens)1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Effekt af iskæmi-reperfusion på udtrykket af oxidative stressmarkørproteiner. Vestlige blotting blev brugt til at bestemme ORP150, SOD1, og katalase udtryk niveauer. (A) ORP150-udtrykket blev forøget efter I/R-skader. NAC, en pan-ROS-hæmmer, sænkede ORP150 til et niveau, der kan sammenlignes med kontrol. (B) Efter I/R blev SOD1-udtrykket forhøjet. SOD1-udtrykket blev ligeledes nedsat efter NAC-behandling. (C) I/R-hændelsen fremkaldte katalaseudtrykket. RVA behandlet med I/R og eksponeret for NAC viste et fald i katalaseniveauet. GAPDH (A, C) og β-Actin (B) blev anvendt som interne kontroller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Skøn over IL-1β og TNF-α ved hjælp af ELISA. ELISA blev brugt til at kvantificere IL-1β og TNF-α, og resultaterne viste, at der var en stigning i IL-1β og TNF-α udtryk, som blev afbødet ved tilføjelsen af Naringenin. Til denne undersøgelse blev ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls-testen anvendt. Fejllinjer repræsenterer middel ± SD, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Effekten af iskæmi-reperfusion på ekspressionen af inflammationsmarkørproteiner. (A) I/R-behandling resulterede i øget udtryk for NLRP3. Inkubation af I/R behandlet RVA med Naringenin faldt udtrykket af NLRP3. (B) I lighed med NLRP3 blev NF-kβ's udtryk også forøget efter I/R-behandling. Behandlingen af Naringenin reducerede udtrykket NF-kβ. GAPDH blev brugt som intern kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Virkningen af iskæmi-reperfusion på Apoptotiske og autophagiske status af RVA celler. (A) For at udforske induktion af apoptose ved I / R-processen, udtrykket af spaltede caspase 3 blev evalueret ved hjælp af vestlige blotting. Efter I/R-skader blev niveauet af spaltet caspase 3 forhøjet. Men, behandling med zVAD-fmk, en apoptose hæmmer, nedsat kløvet caspase 3 udtryk. (B-D) For at evaluere induktionen af autofagi efter I/R blev udtrykket LC3II/I, Beclin1 og Atg7 bestemt. Efter I/R steg ekspressionen af alle autophagiske markører, mens eksponeringen af I/R-behandlet RVA for den autofagihæmmer 3-MA reducerede ekspressionen af alle proteiner for at kontrollere niveauer. Som intern kontrol blev GAPDH anvendt. (E) qRT-PCR blev brugt til at bekræfte induktionen af autofagi og bestemme Ambra1- og Atg7 mRNA-udtryksniveauerne. Begge gener viste en betydelig stigning i ekspressionen i I/R-gruppen sammenlignet med kontrol, som blev genoprettet til næsten normale niveauer efter NAC-behandling. GAPDH blev brugt som en intern kontrol for qRT-PCR eksperimenter. For eksperiment (E) blev ANOVA, efterfulgt af Newman-Keuls-testen, anvendt. Fejllinjer repræsenterer middel ± SD, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Effekt af iskæmi-reperfusion på DNA-skader. For at afgøre, om I/R fremkalder DNA-rifter, undersøgte vi DNA-skader ved hjælp af gelelektroforese. I/R resulterede i genomisk DNA-nedbrydning, som det fremgår ved udtværing i I/R-prøven. NAC-behandling af I/R-beskadiget RVA reducerede DNA-skaden. Der blev ansat en dna-stige på 1 kb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Sammenligning af Hook-I/R-modellen vs. MCAO-modellen. Der blev foretaget en sammenligning mellem de data, der genereres af Hook-I/R-modellen, og de data, der genereres af MCAO-modellen. (A) Udtrykket af det apoptotiske protein caspase-3 og de autofagiproteiner Beclin1 og Atg7 var højere i I/R-behandlede RVAs sammenlignet med ekspressionen af de samme proteiner i kontrol-RVAs, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne i MCAO-forsøgene. (B) TNF-α- og IFN-Ƴ-niveauerne viste sig at være forhøjede i både RVA- og MCAO-grupperne sammenlignet med deres respektive kontroller. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på materiale/udstyr | Koncentration | Autoklave | Oplagring | ||
| Reagenser til Ringers løsning | |||||
| Natriumchlorid | 123 mM | ||||
| Kaliumchlorid | 4,96 mM | ||||
| Calciumchlorid | 1,53 mM | ||||
| Sterilt destilleret vand | 100 mL | ||||
| ph | 7.4 | 15 min ved 121 °C | R.T. | ||
| Reagenser til 0,9% normal saltvand | |||||
| Natriumchlorid | 154mM | ||||
| Sterilt destilleret vand | 100 mL | ||||
| ph | 7.4 | 15 min ved 121 °C | R.T. | ||
| Reagenser til 70% ethanol | |||||
| 70% ethanol | 70 mL | ||||
| Sterilt destilleret vand | 30 mL | Ikke påkrævet | R.T. | ||
| Reagenser til 1x fosfat buffer saltvand | |||||
| Natriumchlorid | 136,8 mM | ||||
| Kaliumchlorid | 26,8 mM | ||||
| Kaliumphosphat monobasisk vandfri | 14,6 mM | ||||
| di-Natrium hydrogenphosphat heptahydrat | 5,37 mM | ||||
| Sterilt destilleret vand | 100 mL | 15 min ved 121 °C | R.T. | ||
Tabel 1: Opskrift på løsninger, der anvendes i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med iskæmi-reperfusion forskning er at skabe terapeutiske strategier, der forhindrer celledød og fremme inddrivelse29,30. For at overvinde de nuværende begrænsninger i I / R forskning, vi designet en Hook I / R chick embryo model til at producere en pålidelig og reproducerbar I / R model. Så vidt vi ved, er vores den første I /R-model, der nogensinde er skabt i et 3-dages chick embryo til rutinemæssige I / R-eksperimenter, udover at studere stresssignaler (f.eks. oxidativ og inflammatorisk stress). I betragtning af fordelene ved størrelse og tilgængelighed på dag 3 i udvikling31 blev kyllingembrynet brugt på et udviklingsstadium på 72 timer på grund af modellens høje output, enkelhed at anvende og tilpasningsevne til rutinemæssig analyse32. Kort sagt, på udviklingsdagen 3 er in ovo chick en meget kontrolleret, men tilgængelig og rimeligt gennemsigtig model i ægget, der kan bruges til at visualisere normal fysiologi, sygdomspatologi og virkningerne af eksperimentel behandling. Dens enorme størrelse gør det særligt nyttigt til at studere embryoets dannelse og adfærd under normal fysiologi samt stress33. Selvom ældre kyllingembryoner (dem, der inkuberes i 4 dage eller længere) kan anvendes, og vi prøvede et senere tidspunkt, er brugen af ældre embryoner som modelsystemer stærkt begrænset af det faktum, at æggeblommesækken vokser så tyk ud over 3 dages udvikling, at kirurgiske procedurer er vanskelige. Det er bemærkelsesværdigt at nævne, at mens RVA ikke er fuldt dannet på et tidligt tidspunkt vindue (siger, på dag 1 eller 2), vindue kan føre til teratogenicitet34. Ud over de begrænsninger, der er forbundet med et tidligt eller sent udviklingspunkt, fungerer et 72 timers kyllingembryo som en ideel model til at forske i I / R-processen, da 3-dages kyllingembryoner har et veldefineret kredsløbssystem30.
Forståelse af patofysiologi af I / R skade er et vigtigt mål for at designe en I / R-model. I øjeblikket er der ikke nogen klinisk nyttig terapeutisk til at reducere iskæmi-reperfusion skader1,35. Som følge heraf er der foreslået en lang række in vitro- og in vivo-modeller. I den forbindelse blev I/R-modellering i et 3-dages chick embryo i ovo foreslået for første gang. Tidligere forskning har vist, at okklusion-reperfusion af arteriel blodgennemstrømning forårsager patologiske ændringer i eksperimentelle modeller, der ligner dem, der ses hos mennesker36,37,38, så vi håbede, at vores model ville gøre det samme (sådan oxidativ og inflammatorisk stress observeret i in vivo modeller eller hos patienter). Med resultaterne af vores undersøgelse viste ovenstående hypotese sig at være korrekt.
Blodcirkulationen fra embryoner til æggeblommesækken styres af vitellinebeholdere i kyllingembryoner39. Embryoner får næringsstoffer fra æggeblommen og diffus ilt fra luften via vitellincirkulation; således begrænser nogen af de vitelline fartøjer, der kan forstyrre ernæring og ilt overførsel. På grundlag af disse kendsgerninger blev iskæmi fremkaldt ved at okkludre blodforsyningen til RVA i 5 min, efterfulgt af reperfusion i yderligere 5 timer og 55 min. Den foreslåede model kan anvendes til at undersøge en række forskellige sygdomsprocesser forbundet med I / R og teste en række lægemidler og deres mål. Den nuværende model kan bruges til at undersøge ændringer i DNA, RNA og proteiner. Det har potentiale til at give høj output. Udover sin enkelhed og tilpasningsevne til regelmæssig analyse kan modellen også undersøge kortsigtet stamcellebevaring, som vil blive undersøgt i fremtidige undersøgelser.
I forhold til in vitro-modeller er vores model nem at bruge, omkostningseffektiv og vokser hurtigt, samt at være etisk uskyldig32. Tilstedeværelsen af mikrovasculatur, immunsystemet og fysiologiske vurderinger er alle fordele i forhold til in vitro-modeller , mens lave omkostninger, tidseffektivitet, og ingen etiske problemer er fordele i forhold til in vivo modeller40. Ovenstående fordele indikerer, at vores model har en sammenlignelig effekt som de andre I /R-modeller, der i øjeblikket er i brug (figur 10). En potentiel mangel er den nuværende models manglende evne til at kvantificere infarktområdet. Direkte infarktvurdering kan være en værdifuld biomarkør for I/R-medieret skade og en metode til kortlægning af virkningerne af forskellige terapimediciner. Således forsøgte vi at kvantificere infarktområdet, men kunne ikke gøre det på grund af den delikate struktur af de 72 h-udviklede kyllinger. Derfor er der behov for yderligere forskning for at vurdere strategier og veje for I/R-processer grundigt.
For at opsummere, den nuværende model kan bruges til at undersøge forskellige sygdomsforløb knyttet til I / R og screene en række lægemidler og deres mål. På grund af dens høje reproducerbarhed, omkostningseffektivitet og enkelhed forventer vi, at vores model vil være en værdifuld ressource for grundlæggende videnskab og translationel forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne udtrykke vores taknemmelighed over for Hari Shankar for hans kritiske input under videografi og redigering, Mr. Baqer Hussain for voice-over, Mr. Asghar Rizvi for videoredigering, Mr. Mohammad Haider for videooptagelser, Mr. Mohammad danske Siddiqui for hjælp under eksperimenterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
