Summary
Bu makalede, I/R gelişimini ve tedavisini daha iyi anlamak için omurilik iğnesi özelleştirilmiş kanca kullanılarak 3 günlük civciv embriyosunda iskemi-reperfüzyon (I/R) modellemesi açıklanmaktadır. Bu model basit, hızlı ve ucuzdur.
Abstract
Miyokard enfarktüsü, inme ve periferik vasküler hastalık gibi iskemi ve reperfüzyon (I/R) bozuklukları hastalık ve ölümün önde gelen nedenlerinden birkaçıdır. Birçok in vitro ve in vivo model şu anda hastalık veya hasarlı dokularda I/R mekanizmasını incelemek için mevcuttur. Bununla birlikte, bugüne kadar, I/R mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve daha hızlı ilaç taramasını sağlayacak ovo I/R modelinde hiçbir şey bildirilmemiştir. Bu makalede, I/R gelişim ve tedavi mekanizmalarını anlamak için 3 günlük civciv embriyosunda omurilik iğnesi özelleştirilmiş kanca kullanılarak yapılan I/R modellemesi açıklanmaktadır. Modelimiz DNA, RNA ve protein seviyelerindeki anomalileri araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem basit, hızlı ve ucuzdur. Mevcut model bağımsız olarak veya mevcut in vitro ve in vivo I/R modelleri ile birlikte kullanılabilir.
Introduction
İskemi-reperfüzyon dokusu hasarı kalp krizi, iskemik inme, travma ve periferik vasküler hastalık dahil olmak üzere bir dizi patoloji ile bağlantılıdır1,2,3,4,5. Bunun nedeni öncelikle hastalığın ilerlemesinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmaması ve etkili bir araştırma modelinin bulunmamasıdır. İskemik yaralanma, dokunun belirli bir bölgesine kan akışı kesildiğinde meydana gelir. Sonuç olarak, iskemik doku sonunda nekrotize edilir, ancak oran dokuya bağlı olarak değişir. Bu nedenle, kan akışının geri yüklenmesi hasarı azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, reperfüzyonin sadece iskemiden daha fazla doku hasarına neden olduğu gözlenmiştir6,7,8. Bu nedenle, etkili bir terapötik müdahale geliştirmek için iskemi-reperfüzyonun moleküler ve hücresel mekanizmalarını anlamak gerekir. Şu anda, I/R yaralanmaları için etkili bir tedavi bilinmamektedir. Bu eşitsizlik, mevcut sorunu çözmek için in vitrodan in vivo modellere kadar yeni deneysel modellerin oluşturulmasına neden oldu9,10,11,12,13.
Civciv embriyoları (Gallus gallus domesticus), erişim kolaylığı, etik kabul edilebilirlik, nispeten büyüklük (diğer embriyolara kıyasla), düşük maliyetli ve hızlı büyümeleri nedeniyle araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır14. Omurilik iğnesi yardımıyla sağ vitellin arterini tıkayıp serbest bırakarak ovo I/R oluşturmak için 72 saat gelişimde bir civciv embriyosu kullandık. Adını Hook-I/R iskemi-reperfüzyon modeli koyduk (Şekil 1). Bu çalışmada kullanılan model, sıklıkla I/R hasarı15,16,17 ile ilişkili olan oksidatif ve enflamatuar yollar da dahil olmak üzere tüm aşağı akış süreçlerini doğru bir şekilde simüle edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Era's Lucknow Tıp Koleji ve Hastanesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi, bu deneylerin Hayvanlar Üzerinde Deneylerin Kontrol ve Gözetimi Komitesi (CPCSEA) uyarınca yapılması için resmi bir onay gerek olmadığını belirten yazılı bir feragatname yayınladı. Bununla birlikte, embriyonik sıkıntı potansiyelini en aza indirmek için Standart Çalışma Prosedürleri izlendi.
1. Tampon hazırlama (Tablo 1)
- Ringer'ın çözümünü hazırlayın
- Ringer'ın çözümünü hazırlamak için, 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) 70 mL steril damıtılmış H2O'da son hacim 100 mL çözün. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tamamen çözünmesine ve otoklav olmasına izin verin. Ardından, 0,22 μm filtreden filtreleyin, tek kullanımlık miktarlarda (yaklaşık 10 mL) aliquot yapın ve oda sıcaklığında saklayın.
- Normal salin hazırlayın (%0,9 Sodyum Klorür, NaCl).
- 70 mL steril damıtılmış H2O'da, 0,9 g NaCl (154 mM) çözün. Sesi 100 mL'ye kadar yapın. 121 °C'de 15 dakika otoklav. Gerekirse pH'ı 0,1 N HCl veya 0,1 N NaOH ile 7,4'e ayarlayın. 15 mL steril santrifüj tüpünde 10 mL aliquot yapın ve oda sıcaklığında saklayın.
- %70 etanol (v/v) hazırlayın.
- 70 mL saf etanol (Mol. wt. 46.07 g/L) ila 30 mL steril H2O karıştırın. Sterilizasyona gerek yoktur.
- 1x Fosfat Tampon Salin (1x PBS) hazırlayın.
- 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14) ekleyerek 100 mL 1x PBS hazırlayın. 6 mM) ila 70 mL damıtılmış su. Çözün ve hacmi 100 mL'ye kadar yapın ve 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklav yapın. Gerekirse 0,1 N HCl veya 0,1 N NaOH damlası ekleyerek pH'ı 7,4'e getirin. 15 mL steril santrifüj tüpünde 10 mL'lik aliquots yapın ve oda sıcaklığında saklayın.
2. Gün 1
- Yumurta sterilizasyonu için gerekli tüm aletleri düzenleyin (%70 etanol, temizleme mendilleri, yumurta rafı ve OHP işaretleyici).
- Kağıt mendil mendil kullanarak 0 günlük yumurtaları % 70 etanol ile temizleyin. Sadece 0 günlük bir yumurta kullanın, çünkü yaşlı yumurtalar bir embriyoya yol vermeyebilir.
- Geçerli tarihi bir OHP işaretleyicisi ile yumurtalara yazın.
- Yumurtaları 36-37 ° C sıcaklığa ve% 60-65 nem seviyesine ayarlanmış bir yumurta inkübatörüne yerleştirin. Yumurtaları sonraki 24 saat kuluçkaya yatır.
3. Gün 2
- 5-6 mL albümin çekilmesi için gerekli ekipmanı düzenleyin (keskin kenar makası, 5 mL şırınga, 18 G iğne, şırınga atar ve yapışkan bant).
- Cerrahi makası% 70 etanol ile silin veya% 70 etanol ile sildikten sonra bir otoklav kullanarak sterilize edin.
- Şimdi yumurtayı katmanlama için 37 °C yumurta inkübatöründen alın.
- Yumurtayı temiz bir yumurta rafı üzerine yerleştirin.
- Yumurtanın kenarına küçük bir yapışkan bant parçası (boyut: yaklaşık 1 inç uzunluğunda x genişlik) takın.
- Keskin uçlu kenar makası kullanarak yumurta kabuğunun kenarında küçük bir delik açın. Yaklaşık 75° açıyla 5 mL şırınna yerleştirin.
NOT: 5 mL şırınga 24 G x 1 iğne (steril) ile birlikte gelir, ancak 24 G x 1 iğneyi 18 G x 1,5 iğne (steril) ile değiştirmek iyidir. 18 G x 1,5 iğnenin genişliği 1,25 x 38 mm'dir. Bu nedenle, albümin çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. - İğneyi yumurta sarısı kesesine yerleştirdikten sonra yavaşça 5-6 mL albümin çekin.
NOT: Bu, embriyoya üzerinde büyüyebileceği bir yatak sağlar. Albümin'i geri çekmek, bir pencere oluştururken albümin aşırı yayılmasını önler. Son olarak, 5-6 mL albümin ortadan kaldırılarak embriyonun pencereleme sırasında hasar görme riski azaltılır. - Albümini çıkardıktan sonra, açıklığı yapışkan bantla yeniden yapıştırın ve yumurtaları 48 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya bırakın.
4. Gün 4
- Protokolün bölüm 1'inde açıklandığı gibi Ringer'ın çözeltisini, %0,9 normal salin ve 1x PBS hazırlayın. Ardından, üç çözümü otomatik olarak örtün. Otoklavlamadan sonra, ilgili çözeltiyi oda sıcaklığına yerleştirin.
- Yumurtayı 37 °C yumurta inkübatöründen çıkar ve kabuğu dairesel bir şekle sok. Yumurta kabuğunü kesmeden önce kesilecek bölgeyi yapışkan bantla örtün.
NOT: Pencere alanını yapışkan bantla örtmek, yumurta kabuğunun istenmeyen yerlere kırılmasını önler. Ancak, istenmeyen bir yere girerseniz, bölgeyi yapışkan bantla kapatın. Kesilecek yerlerin yapışkan bantla kaplanması kabuk parçalarının yumurta sarısı kesesine düşmesini önler. - Pencerelemenin istendiği yerde keskin sivri kenar makası ile yumurta kabuğunda küçük bir delik oluşturun ve dairesel bir açıklık kesmeye başlayın. Bu işlem pencereleme olarak bilinir.
NOT: Dairesel kesimin embriyoya herhangi bir yönden kolay erişim sağlayacak kadar büyük olduğundan emin olun. Gerekirse, embriyonun konumunu karşılamak için yumurta pozisyonunu değiştirin. - Ardından, stereo zoom cerrahi mikroskop kullanarak sağ vitellin arterini (RVA) bulun.
NOT: Tavuk embriyoları normalde torasik burulmaya (servikal fleksür vb.) geliştikçe, başın sol tarafının 72 saat aşamada sarısına karşı olması gibi. Daha kaudally, vitelline arterlerin vücuttan çıktığı yerde, embriyo çok fazla bükülmez ve vücudun bu kısmı yumurta sarısına doğru ventral tarafta uzanır. Yani, doğrudan, embriyonun hakkı araştırmacının sağındadır. - RVA bulunduktan sonra, RVA'nın sol ve sağ taraflarında 26 G'lik bir iğne kullanarak iki küçük delik oluşturun (Şekil 2).
- Doppler kan akışı görüntüleme sondasını RVA'nın üstüne yerleştirin. Doppler kan akışı görüntüleme probunun iskemi bölgesinden 5 ± 1 mm uzakta ve RVA'nın distal ucuna doğru yerleştirildiklerinden emin olun. 2 dakika ve 30 s (veya istenirse daha uzun) için bir akı okuması alın. Bu normoksik faz okuması olacak.
- Bu arada burun plier ve dişli kastlar kullanarak omurilik iğnesinin kenarını kanca şeklinde manuel olarak kalıplayın (Şekil 3). Bunu, omurilik iğnesinin kenarını yaklaşık 1 mm bükerek yapın. Daha büyük bir boyut, I/R işlemi sırasında omurilik iğnesinin yerleştirilmesini ve çıkarılmasını daha zor hale getirecektir.
- Omurilik iğnesini bir mikromanipülatör kullanarak sağ vitellin arterinin tam altına yerleştirin.
NOT: RVA'ya veya bitişik arterlere zarar vermemek için omurilik iğnesini çok dikkatli yerleştirin. En uygun teknik, omurilik iğnesinin özel tasarlanmış kancasını RVA deliğinin sağ tarafının tam üstüne ayarlamak ve ardından omurilik iğnesinin özel tasarlanmış kenarını, sağ delikten stereo zoom cerrahi mikroskop rehberliğinde bir mikromanipülatör yardımıyla yavaş yavaş yumurta sarısı kesesine yerleştirmektir. Omurilik iğnesinin kancası yumurta sarısı kesesine girdikten sonra, RVA'nın altındaki kancayı yavaş yavaş ayarlayın, böylece kenarı tam olarak sol deliğin altına yerleştirilir. Şimdi omurilik iğnesini kaldırma zamanı. - Şimdi, mikromanipülatörün yardımıyla, Doppler kan akışı akısı arteriyel akışta minimum% 80'lik bir azalmaya işaret edene kadar arteri kademeli olarak kaldırın.
- Doppler akısında% 80 veya daha fazla bir düşüş elde edildikten sonra, omurilik iğnesini 5 dakika boyunca kaldırın (arteri yukarı çekerek). Bu, RVA'daki iskemi dönemi olacaktır.
NOT: İskemi süresince Doppler akısının izlenmesi kritik öneme sahiptir. Önemli miktarda dalgalanma bulunursa, testleri sonlandırın. - 5 dakikalık iskemi döneminden sonra, normal kan akışı seviyelerini geri kazanmak için arteri yavaş yavaş serbest bırakın. Doppler kan akış ölçütüsü okumasının normoksi sırasında elde edilenlerle karşılaştırılabilir değerler görüntülediğine emin olun. Bu, RVA'daki reperfüzyon dönemi olacaktır (Şekil 4).
- I/R işleminden sonra embriyoya birkaç damla (2-3) 1x PBS uygulayın ve 2-3 dakika izleyin.
NOT: 1x PBS kullanımı embriyonun kurumasını önlemeye yardımcı olur. - Son olarak, pencereyi yapışkan bantla yeniden yerleştirin ve yumurtayı 5 saat 55 dakika boyunca yumurta inkübatörüne geri yerleştirin.
- 5 saat 55 dakika sonra, yumurtayı yumurta inkübatörden alın, yumurta rafı üzerine yerleştirin, pencereyi yeniden açın ve aşağı akış tedavi protokolünü izleyin.
5. Tedaviler
- Arterlerin ilaçlar, aktivatörler veya inhibitörlerle tedavisi için, I/R işleminin 1 saat sonra RVA'yı kesin.
- Aşağı akış çalışmaları için, önce embriyoyu steril 90 mm Petri kabına yerleştirerek yumurta kabuğundan çıkarın.
- Embriyo Petri kabına salındıktan sonra, stereo zoom cerrahi mikroskobun rehberliğinde oküler iris kullanarak RVA'yı dışarı atın.
- RVA'nın eksizyon boyutunun 15 ± 1 mm'ye (gövdeden distal), atardamarın sol ve sağ tarafında 5 ± 1 mm'ye ve gövdeye doğru 2 ± 1 mm'ye kadar olduğundan emin olun.
NOT: Eksilecek alanı ölçmek için bir cetvel kullanılabilir (isteğe bağlı). - RVA'yı eksize ettikten sonra, 1x PBS içeren steril bir Petri kabında 1x PBS ile yıkayın.
- İstenilen tedaviler için, arteri 500 μL Ringer çözeltisi ile dolu 1,5 mL santrifüj tüpüne (sterilize edilmiş) yerleştirin. RVA'yı santrifüj tüpüne yerleştirin ve 5 saat 55 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Tedavilere bağlı olarak, ringer'ın çözeltisini herhangi bir tedavi olmadan veya istenen ilaç, aktivatör veya inhibitör hacmi ve konsantrasyonu ile tedavi edin. - 5 saat 55 dk inkübasyondan sonra, RVA'yı 37 °C laboratuvar inkübatöründen çıkar ve istenen tedavilere devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modelimizin etkinliğini değerlendirmek için Doppler Kan Akışı Görüntüleme tekniği kullanılmıştır. Kısacası, yarattığımız başarıyı belirlemek için kontrol grubundan gelen verileri RVA grubundan gelen verilerle karşılaştırdık. Şekil 4A , kontrol hayvanıyla ilişkili tipik bir akıyı tasvir ederken, Şekil 4B bir RVA'dan elde edilen sonuçları tasvir eder. Sayısal 1-8, I/R aşamalarıyla ilişkili çeşitli olayları temsil eder. Kısacası, sayısal 1-3 normoksi evresine karşılık gelirken, 3 ve 4 noktalarındaki akıdaki keskin düşüş, RVA'daki kan akışındaki azalma ile ilişkili olayları temsil eder. %80 veya daha büyük bir düşüş elde edildikten sonra, RVA sonraki 5 dakika boyunca yükseltildi. Bu iskemi evresiydi (sayısal 4-5). RVA'nın 5 dakikalık bir kaldırma işleminden sonra, sayısal 6 ve 7 ile temsil edilen RVA serbest bırakıldı. 7. noktadan itibaren gelen akı, RVA normal kan akışı seviyelerine ulaştıktan sonra ortaya çıkan ve reperfüzyon aşaması olan reperfüzyon aşamasını temsil eder. Bu özel deney, 3 günlük geliştirilen civciv embriyosunda I/R modellemesinin etkinliğini göstermiştir.
Modelimizin faydasını doğrulamak için ELISA, batı şişkinliği, qRT-PCR ve jel elektroforezi analizi yoluyla proteinlerin, RNA'nın ve DNA'nın ifade kalıplarını inceledik. Kısacası, 3 günlük geliştirilen yumurtaları üç deneysel gruba ayırdık: kontrol, I/R ve Tedaviler + I/R. Proteinlerin, genlerin ve DNA bütünlüğünün ekspresyonunda ilgili I/R ve kontrol grupları arasında anlamlı bir fark gözlenmiştir. Aşağıda tartışıldığı gibi, I/R grubuna ilaç tedavisi, bu grupta gözlenen sonucu sadece I/R tedavi grubuna kıyasla etkili bir şekilde iyileştirdi; bu, bu protokolün dayandığı önceki yayınımızla tutarlıdır1. Bu yazıda ele alınmayan ELISA18, western blotting19, qRT-PCR20 ve jel elektroforez21 için standart laboratuvar prosedürleri takip edilmiştir (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8).
İskemi-reperfüzyon, dokuya zarar veren reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu da dahil olmak üzere çeşitli süreçleri uyarır. İç antioksidan vücut savunma sistemlerinin ROS'a verdiği tepkinin neden olduğu zararlı etkiler, I/R yaralanmasının önemli bir özelliğidir. Oksijen düzenleyici proteinler 150 (ORP150), sitoplazmik süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ve iskemik damarlardaki katalazın faaliyetlerini inceledik. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, I/R ORP150, sitoplazmik SOD1 ve katalaz aktivitesini arttırmıştır (Şekil 5A-C). Bununla birlikte, bir ROS quencher olan N-Asetil-L-Sistein (NAC) ile takviye, I/R grubunun oksidatif stresini azalttı.
Modelimizin enflamatuar potansiyelini değerlendirmek için IL-1β ve TNF-α ekspresyonlarını incelemek için ELISA'yı kullandık (Şekil 6). Her iki interlökin de kontrol grubuna kıyasla I/R grubunda aşırı ifade edildi ve bu da modelimizin enflamatuar araştırmalarda kullanılma potansiyeline sahip olduğunu gösteriyor. Daha sonra, bu modelin enflamatuar çalışmalar için yararlılığını doğrulamak için NOD benzeri reseptör pyrin etki alanı içeren protein 3 (NLRP3) inflammasome pathway22,23 ve iltihaplanmayı güçlendirmede rol oynayan pro-enflamatuar molekül NF-kβ24,25'in ekspresyonunun ifadesini test ettik. RVA'da oluşturulan I/R'ye yanıt olarak, bu araştırma NLRP3 inflammasome (Şekil 7A) ve NF-kβ'nin (Şekil 7B) aktivasyonuna dair kanıtlar buldu. Bununla birlikte, iyi bilinen bir antienflamatuar ilaç olan Naringenin ile tedavi, ilaçla tedavi edilen gruplarda gözlendiği gibi enflamatuar etkileri iyileştirilmiştir.
İskemi-reperfüzyon programlanmış hücre ölüm yollarını aktive eder26,27,28. Civciv embriyosunda I/R'nin apoptoz ve otofaji yolları üzerindeki etkilerini inceledik. Şekil 8A, I/R'nin caspaz-3 ve zVAD-fmk üzerindeki etkisini tasvir eder. Şekil 8B-D, I/R grubunun protein seviyelerinde sırasıyla kontrol grubundan daha yüksek LC3II ve LC3II/I oranı (otofagosomes belirteci), Beclin1 (memeli hücrelerinde önemli bir otofaji düzenleyicisi) ve Atg7 (bazal otofaji için gerekli) ekspresyona sahip olduğunu göstermektedir. Buna karşılık Şekil 8E, I/R'nin mRNA düzeyleri üzerindeki etkisini göstermektedir. Bununla birlikte, otofaji inhibitörü olan 3-MA'nın eklenmesi sonuçları tersine çevirdi. Bu bulgular, modelin farklı hücre ölüm süreçlerini (örneğin nekroptoz) araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Şekil 9, Hook-I/R modelimiz kullanılarak DNA seviyesindeki değişikliklerin ne kadar verimli bir şekilde çalışabileceğini göstermektedir.
Son olarak, modelimizin diğer modellere kıyasla ne kadar etkili olduğunu görmek için Hook-I/R modeli ve orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modelinden elde edilen sonuçları karşılaştırıyoruz. Özetlemek gerekirse, I/R ile tedavi edilen RA'lar apoptotik protein cleaved caspase-3, otofaji proteinleri Beclin1 ve Atg7 ve enflamatuar interlökinler TNF-α ve IFN-Ƴ kontrol RVA'larından daha yüksek seviyelere sahipti. İlginçtir ki, ister inflamatuar stresi ister hücresel ölüm yollarını analiz edin, Hook-I/R modeli MCAO modeli tarafından elde edilenlere son derece benzer sonuçlar üretti (Şekil 10).
Şekil 1: Hook-I/R civciv embriyo iskemi-reperfüzyon modelinin tipik bir kurulumunun şematik diyagramı. Resimde stereo zoom cerrahi mikroskop, lazer Doppler kan akış cihazı, mikromanipülatör, omurilik iğnesi, 72 h gelişmiş civciv embriyoları ve bir aydınlatma kaynağı gibi Hook-I/R civciv embriyo iskemi-reperfüzyon deneyi gereksinimleri gösterilmektedir." Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3 günlük civciv embriyosu sergileyen tıkanıklık bölgesinin ve doku eksizyon alanının temsili görüntüsü. (A) Üçgen, batı şişkinliği, RNA ve DNA izolasyonu için dokunun eksizyonunun yerini gösterir. Yıldız ve noktalar tıkanıklık bölgesini ve RVA'nın sol ve sağ tarafında oluşturulan delikleri temsil eder ve iğneyi arterin altına sokarak onu kaldırır. Doku çıkarma alanının büyütülmüş bir görüntüsü de bununla birlikte sağlanır. A notasyonu gözü, B kalbi, C vitellin arterinin solunu ve C' vitellin arterinin sağını temsil eder. (B) Civciv embriyosunun sağ tarafının şematik bir temsili, RVA civarındaki doku eksizyon alanını gösterir. Düz çizgi embriyo gövdesinden çıkan RVA'yı temsil eder. Dikey çizgideki yıldız, Lazer Doppler kan akışı probunun konumunu sembolize eder. Kavşak tıkanıklık bölgesini gösterir. Arterlerin eksizyonu 15 ± 1 mm'ye (gövdeden distal), atardamarın sol ve sağ tarafında 5 ± 1 mm'ye kadar ve gövdeye doğru 2 ± 1 mm'ye kadar yapıldı. Tüm ölçümler tıkanıklık bölgesinden uzaklıkları göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Özel yapım kancalı bir omurilik iğnesinin temsili resmi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tipik bir Lazer Doppler kan akış cihazı sinyalinin temsili. Kontrol grubu yumurtadan (A) 3 günlük civciv embriyo arterinde tipik bir Lazer Doppler kan akış ölçer sinyali ölçüldü. Taban çizgisi (1), normoksi (2), RVA'nın hemen ön kaldırması (3), RVA'nın hemen sonra kaldırılması (4), iskemi sırasında (5), RVA'nın hemen ön salınması (6), hemen reperfüzyon sonrası (7), lazer doppler kan akışı (B) tarafından kaydedilen iskemi tedavi grubunda reperfüzyon (8) sırasında olaylar. Bu rakam Fauzia ve ark., 2018 'den (Farmakolojide Sınırlar; CC-BY lisansı altında) benimsenmiştir 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İskemi reperfüzyonunun oksidatif stres belirteci proteinlerinin ekspresyonu üzerindeki etkisi. ORP150, SOD1 ve katalaz ifade düzeylerini belirlemek için Batı blotting kullanıldı. (A) I/R hasarından sonra ORP150 ekspresyrı artırıldı. Bir pan-ROS inhibitörü olan NAC, ORP150'yi kontrol seviyesiyle karşılaştırılabilir bir seviyeye düşürdü. (B) I/R'den sonra SOD1 ifadesi yükseltilmiştir. NAC tedavisinden sonra SOD1 ekspresy ekspresyişi de azaldı. (C) I/R olayı katalaz ekspresyonunun indüklendi. I/R ile tedavi edilen ve NAC'ye maruz kalan RVA katalaz seviyelerinde azalma gösterdi. İç kontrol olarak GAPDH (A,C) ve β-Actin (B) kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ELISA kullanılarak IL-1β ve TNF-α tahmini. ELISA, IL-1β ve TNF-α ölçmek için kullanıldı ve sonuçlar, Naringenin eklenmesiyle hafifletilen IL-1β ve TNF-α ifadesinde bir artış olduğunu ortaya koydu. Bu çalışma için ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi uygulanmıştır. Hata çubukları ortalama ± SD'yi temsil eder, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: İskemi-reperfüzyonun inflamasyon belirteç proteinlerinin ekspresyonu üzerindeki etkisi. (A) G/Ç tedavisi NLRP3 ekspresyonunun artmasına neden oldu. Naringenin ile tedavi edilen RVA'nın inkübasyonu NLRP3 ekspresyonunu azalttı. (B) NLRP3'e benzer şekilde, I/R tedavisinden sonra NF-kβ ekspresyözü de arttırıldı. Naringenin tedavisi NF-kβ ekspresyonunun azaltılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: İskemi-reperfüzyonun RVA hücrelerinin apoptotik ve otofajik durumu üzerindeki etkisi. (A) I/R işlemi ile apoptozun indüksiyonunu araştırmak için, yarıklı kaspaz 3'ün ekspresyonu batı şişkinliği kullanılarak değerlendirildi. I/R hasarının ardından, bölünmüş kaspaz 3 seviyesi artırıldı. Bununla birlikte, bir apoptoz inhibitörü olan zVAD-fmk ile tedavi, bölünmüş kaspaz 3 ekspresyonunu azalttı. (B-D) I/R sonrasında otofaji indüksiyonunu değerlendirmek için LC3II/I, Beclin1 ve Atg7 ekspresyonu belirlendi. I/R'den sonra, tüm otofajik belirteçlerin ekspresyişi artarken, I/R ile tedavi edilen RVA'nın otofaji inhibitörü 3-MA'ya maruz kalması tüm proteinlerin kontrol seviyelerine ekspresyonunun azalmasını sağlamıştır. İç kontrol olarak GAPDH kullanılmıştır. (E) qRT-PCR otofaji indüksiyonunu doğrulamak ve Ambra1 ve Atg7 mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek için kullanılmıştır. Her iki gen de I/R grubunda kontrole kıyasla ifadede önemli bir artış gösterdi ve bu da NAC tedavisinin ardından normale yakın seviyelere geri döndü. GAPDH, qRT-PCR deneyleri için dahili kontrol olarak kullanılmıştır. Deney (E) için ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi uygulandı. Hata çubukları ortalama ± SD'yi temsil eder, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: İskemi reperfüzyonunun DNA hasarına etkisi. I/R'nin DNA çentiğine neden olup olmadığını belirlemek için jel elektroforezi kullanarak DNA hasarlarını inceledik. I/R, I/R örneğinde smearing ile gösterildiği gibi genomik DNA bozulmasına neden oldu. I/R hasarlı RVA'nın NAC tedavisi DNA hasarını azalttı. 1 kb DNA merdiveni kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Hook-I/R modelinin MCAO modeli ile karşılaştırılması. Hook-I/R modeli tarafından oluşturulan veriler ile MCAO modeli tarafından oluşturulan veriler arasında bir karşılaştırma yapıldı. (A) Apoptotik protein caspase-3 ve otofaji proteinleri Beclin1 ve Atg7'nin ekspresyonu, MCAO deneylerinde elde edilen bulgularla aynı proteinlerin kontrol edilen RVA'lardaki ekspresyonu ile karşılaştırıldığında I/R tedavi edilen RVA'larda daha yüksekti. (B) TNF-α ve IFN-Ƴ düzeylerinin ilgili kontrollerine kıyasla hem RVA hem de MCAO gruplarında yükseldiği bulunmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Malzeme/Ekipman Adı | Konsantrasyon | Otoklav | Depolama | ||
| Ringer'ın çözümü için reaktifler | |||||
| Sodyum klorür | 123 mM | ||||
| Potasyum klorür | 4,96 mM | ||||
| Kalsiyum klorür | 1,53 mM | ||||
| Steril damıtılmış su | 100 mL | ||||
| Ph | 7.4 | 121 °C'de 15 dk | R.T. | ||
| % 0.9 normal salin için reaktifler | |||||
| Sodyum Klorür | 154mM | ||||
| Steril damıtılmış su | 100 mL | ||||
| Ph | 7.4 | 121 °C'de 15 dk | R.T. | ||
| %70 etanol için reaktifler | |||||
| %70 etanol | 70 mL | ||||
| Steril damıtılmış su | 30 mL | Gerekli değil | R.T. | ||
| 1x Fosfat Tampon Salin için Reaktifler | |||||
| Sodyum klorür | 136,8 mM | ||||
| Potasyum klorür | 26,8 mM | ||||
| Potasyum fosfat monobasik susuz | 14,6 mM | ||||
| di-Sodyum hidrojen fosfat heptahydrat | 5,37 mM | ||||
| Steril damıtılmış su | 100 mL | 121 °C'de 15 dk | R.T. | ||
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan çözümlerin tarifi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İskemi-reperfüzyon araştırmalarının amacı, hücre ölümünü önleyen ve iyileşmeyi teşvik eden terapötik stratejiler oluşturmaktır29,30. I/R araştırmalarındaki mevcut kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir I/R modeli üretmek için hook I/R civciv embriyo modeli tasarladık. Bilgimize göre, bizimki, stres sinyallerini (örneğin, oksidatif ve enflamatuar stres) incelemenin yanı sıra, rutin I /R deneyleri için 3 günlük civciv embriyosunda oluşturulan ilk I/R modelidir. Gelişimin 3. gününde boyut ve erişilebilirliğin yararları göz önüne alındığında, civciv embriyosu, modelin yüksek çıktısı, istihdam edilebilirliği ve rutin analiz için uyarlanabilirliği nedeniyle 72 saat gelişim aşamasında kullanılmıştır32. Kısacası, gelişimsel 3. Büyük boyutu, normal fizyoloji ve stres sırasında embriyonun oluşumunu ve davranışını incelemek için özellikle yararlı hale getirir33. Her ne kadar yaşlı civciv embriyoları (4 gün veya daha uzun süre kuvuza edilenler) kullanılabilse de ve daha sonraki bir zaman noktasını denedik, daha yaşlı embriyoların model sistemleri olarak kullanılması, yumurta sarısı kesesinin 3 günlük gelişimin ötesinde cerrahi prosedürlerin zor olduğu kadar kalın büyümesiyle ciddi şekilde sınırlıdır. RVA'nın erken bir zaman penceresinde (örneğin, 1 veya 2. günde) tam olarak oluşmasa da, pencerelemenin teratojenikliğe yol açabileceğini belirtmek dikkat çekicidir34. Erken veya geç gelişim zaman noktası ile ilişkili sınırlamaların yanı sıra, 72 h civciv embriyosu, 3 günlük civciv embriyoları iyi tanımlanmış bir dolaşım sistemine sahip olduğundan I/R sürecini araştırmak için ideal bir model olarak hizmet eder30.
I/R yaralanmasının patofizyolojisini anlamak, bir I/R modeli tasarlamanın önemli bir hedefidir. Şu anda, iskemi-reperfüzyon hasarını azaltmak için klinik olarak yararlı bir terapötik yoktur1,35. Sonuç olarak, çok çeşitli in vitro ve vivo modellerinde önerilmiştir. Bu kapsamda ilk kez ovoda 3 günlük gelişen civciv embriyosunda I/R modellemesi önerildi. Önceki araştırmalar, arteriyel kan akışının tıkanması-reperfüzyonunun, insanlarda görülenlere benzer deneysel modellerde patolojik değişikliklere neden olduğunu göstermiştir36,37,38, bu nedenle modelimizin de aynı şeyi yapacağından umutluyduk (in vivo modellerde veya hastalarda gözlenen bu tür oksidatif ve enflamatuar stres). Çalışmamızın bulguları ile yukarıdaki hipotezin doğru olduğu gösterilmiştir.
Embriyolardan yumurta sarısı kesesine kan dolaşımı civciv embriyolarında vitellin damarları tarafından kontrol edilir39. Embriyolar yumurta sarısından besin alır ve vitelline dolaşımı yoluyla havadan oksijeni dağıtır; böylece, beslenme ve oksijen transferini bozabilecek vitelline damarlarından herhangi birinin kısıtlanması. Bu gerçeklere dayanarak, iskemi RVA'ya kan akışının 5 dakika boyunca tıkanmasının ardından ek 5 saat 55 dakika reperfüzyon ile indüklendi. Önerilen model, I/R ile ilişkili çeşitli hastalık süreçlerini incelemek ve çeşitli ilaçları ve hedeflerini test etmek için kullanılabilir. Mevcut model DNA, RNA ve proteinlerdeki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Yüksek çıktı verme potansiyeline sahiptir. Model, basitliği ve düzenli analize uyum sağlamasının yanı sıra, gelecekteki çalışmalarda araştırılacak olan kısa süreli kök hücre homing'i de araştırabilir.
İn vitro modellere kıyasla, modelimizin kullanımı kolaydır, uygun maliyetlidir ve etik olarak masum olmasının yanı sıra hızlı büyür32. Mikrovaskültürün varlığı, bağışıklık sistemi ve fizyolojik değerlendirmeler in vitro modellere göre fayda sağlarken, düşük maliyetli, zaman etkinliği ve hiçbir etik sorun in vivo modellere göre avantaj değildir40. Yukarıdaki avantajlar, modelimizin şu anda kullanılmakta olan diğer I/R modelleriyle karşılaştırılabilir bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 10). Potansiyel bir eksiklik, mevcut modelin enfarktüs alanını ölçememesidir. Doğrudan enfarktüs değerlendirmesi, I/R aracılı hasar için değerli bir biyobelirteç ve çeşitli tedavi ilaçlarının etkilerini haritalamak için bir yöntem olabilir. Böylece, enfarktüs alanını ölçmeye çalıştık, ancak 72 h-gelişmiş civcivin hassas yapısı nedeniyle bunu yapamadık. Bu nedenle, I/R süreçlerine yönelik stratejileri ve yolları kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için ek araştırmalar yapılması gerekmektedir.
Özetlemek gerekirse, mevcut model I/R ile bağlantılı çeşitli hastalık yollarını araştırmak ve çeşitli ilaçları ve hedeflerini taramak için kullanılabilir. Yüksek tekrarlanabilirliği, maliyet etkinliği ve basitliği nedeniyle, modelimizin temel bilim ve çeviri araştırmaları için değerli bir kaynak olacağını öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Videografi ve düzenleme sırasındaki eleştirel girişleri için Hari Shankar'a, seslendirme için Bay Baqer Hussain'e, video düzenleme için Bay Asghar Rizvi'ye, video çekimleri için Bay Mohammad Haider'e, deneyler sırasında yardım için Bay Mohammad Danish Siddiqui'ye şükranlarımızı sunmak istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
