Summary
Cet article décrit la modélisation de l’ischémie-reperfusion (I / R) dans un embryon de poussin de 3 jours à l’aide d’un crochet personnalisé à l’aiguille de la colonne vertébrale pour mieux comprendre le développement et le traitement de l’I / R. Ce modèle est simple, rapide et peu coûteux.
Abstract
L’ischémie et les troubles de la reperfusion (I / R), tels que l’infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies vasculaires périphériques, sont quelques-unes des principales causes de maladie et de décès. De nombreux modèles in vitro et in vivo sont actuellement disponibles pour étudier le mécanisme I/R dans la maladie ou les tissus endommagés. Cependant, à ce jour, aucun modèle in ovo I/R n’a été rapporté, ce qui permettrait de mieux comprendre les mécanismes I/R et d’accélérer le dépistage des drogues. Cet article décrit la modélisation I/R à l’aide d’un crochet personnalisé à l’aiguille de la colonne vertébrale dans un embryon de poussin de 3 jours pour comprendre les mécanismes de développement et de traitement de l’I/R. Notre modèle peut être utilisé pour étudier les anomalies au niveau de l’ADN, de l’ARN et des protéines. Cette méthode est simple, rapide et peu coûteuse. Le modèle actuel peut être utilisé indépendamment ou en conjonction avec des modèles I/R in vitro et in vivo existants.
Introduction
Les lésions tissulaires d’ischémie-reperfusion ont été liées à un certain nombre de pathologies, notamment les crises cardiaques, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les traumatismes et les maladies vasculaires périphériques1,2,3,4,5. Cela est principalement dû à l’absence d’une compréhension globale de la progression de la maladie et à l’absence d’un modèle de recherche efficace. Une lésion ischémique se produit lorsque l’apport sanguin à une zone spécifique du tissu est coupé. En conséquence, le tissu ischémique finit par se nécroser, bien que le taux varie en fonction du tissu. Par conséquent, la restauration de l’approvisionnement en sang peut aider à atténuer les dommages. Cependant, il a été observé, dans certains cas, que la reperfusion provoque plus de dommages tissulaires que l’ischémie seule6,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de l’ischémie-reperfusion est nécessaire pour développer une intervention thérapeutique efficace. À l’heure actuelle, aucun traitement efficace pour les lésions I/R n’est connu. Cette disparité a incité à la création de nouveaux modèles expérimentaux, allant des modèles in vitro aux modèles in vivo, pour résoudre le problème existant9,10,11,12,13.
Les embryons de poussins (Gallus gallus domesticus) sont largement utilisés dans la recherche en raison de leur facilité d’accès, de leur acceptabilité éthique, de leur taille relativement grande (par rapport à d’autres embryons), de leur faible coût et de leur croissance rapide14. Nous avons utilisé un embryon de poussin à 72 h de développement pour créer un in ovo I/R en obstruant et en libérant l’artère droite de vitelline à l’aide d’une aiguille spinale. Nous l’avons nommé le modèle Hook-I/R ischemia-reperfusion (Figure 1). Le modèle utilisé dans cette étude est capable de simuler avec précision tous les processus en aval, y compris les voies oxydatives et inflammatoires, qui sont fréquemment associées à des dommages I/R15,16,17.
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Protocol
Le comité d’éthique animale institutionnelle du Lucknow Medical College and Hospital d’Era a émis une renonciation écrite indiquant qu’aucune approbation formelle n’était requise pour mener ces expériences conformément au Comité aux fins du contrôle et de la supervision des expériences sur les animaux (CPCSEA). Cependant, les procédures opérationnelles normalisées ont été suivies afin de minimiser tout risque de détresse embryonnaire.
1. Préparation du tampon (tableau 1)
- Préparer la solution de Ringer
- Pour préparer la solution de Ringer, dissoudre 0,72 g de NaCl (123 mM), 0,017 g de CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g de KCl (4,96 mM) dans 70 mL de H2O distillé stérile, avec un volume final de 100 mL. Ajustez le pH à 7,4. Laissez-le se dissoudre complètement et autoclaver. Ensuite, filtrez à travers un filtre de 0,22 μm, aliquote en quantités à usage unique (environ 10 mL) et conservez à température ambiante.
- Préparer une solution saline normale (chlorure de sodium à 0,9 %, NaCl).
- Dans 70 mL de H2O distillé stérile, dissoudre 0,9 g de NaCl (154 mM). Porter le volume à 100 mL. Autoclave pendant 15 min à 121 °C. Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH si nécessaire. Faire des aliquotes de 10 mL dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL et conserver à température ambiante.
- Préparer de l’éthanol à 70 % (v/v).
- Mélanger 70 mL d’éthanol pur (Mol. wt. 46,07 g/L) à 30 mL de H2O stérile. Préparer au besoin ou conserver à température ambiante. Il n’y a pas besoin de stérilisation.
- Préparez 1x phosphate buffer Saline (1x PBS).
- Préparer 100 mL de 1x PBS en ajoutant 0,144 g de Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g de NaCl (136,8 mM), 0,2 g de KCl (26,8 mM), 0,2 g de KH2PO4 (14,6 mM) à 70 mL d’eau distillée. Dissoudre et porter le volume à 100 mL et autoclaver pendant 15 min à 121 °C. Porter le pH à 7,4, en ajoutant quelques gouttes de 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH, si nécessaire. Faire des aliquotes de 10 mL dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL et conserver à température ambiante.
2. Jour 1
- Disposez tous les outils nécessaires à la stérilisation des œufs (éthanol à 70%, lingettes nettoyantes, un porte-œufs et un marqueur OHP).
- Nettoyez les œufs de 0 jour avec 70% d’éthanol à l’aide de lingettes en papier de soie. Utilisez seulement un œuf de 0 jour, car les œufs plus âgés peuvent ne pas donner naissance à un embryon.
- Écrivez la date actuelle sur les œufs avec un marqueur OHP.
- Placez les œufs dans un incubateur à œufs réglé à une température de 36-37 ° C et à un taux d’humidité de 60% à 65%. Incuber les œufs pendant les 24 heures suivantes.
3. Jour 2
- Disposez l’équipement nécessaire pour le retrait de 5 à 6 mL d’albumine (ciseaux à bord tranchant, seringue de 5 mL, aiguille de 18 G, déflateur de seringue et ruban adhésif).
- Essuyez les ciseaux chirurgicaux avec 70% d’éthanol ou stérilisez-les à l’aide d’un autoclave après les avoir essuyés avec 70% d’éthanol.
- Maintenant, prenez l’œuf de l’incubateur à œufs à 37 ° C pour la superposition.
- Placez l’œuf sur une grille à œufs propre.
- Fixez un petit morceau de ruban adhésif (taille: environ 1 pouce de longueur x largeur) au bord de l’œuf.
- Faites un petit trou dans le bord de la coquille d’œuf à l’aide de ciseaux à bord pointu. Insérez une seringue de 5 mL à un angle approximatif de 75°.
REMARQUE: La seringue de 5 mL est livrée avec une aiguille de 24 G x 1 (stérile), mais il est bon de remplacer l’aiguille de 24 G x 1 par une aiguille de 18 G x 1,5 (stérile). L’aiguille de 18 G x 1,5 mesure 1,25 x 38 mm de largeur. Par conséquent, il facilitera l’élimination de l’albumine. - Après avoir inséré l’aiguille dans le sac vitellin, retirez lentement 5 à 6 mL d’albumine.
REMARQUE: Cela fournit à l’embryon un lit sur lequel il peut se développer. Le retrait de l’albumine empêche le débordement d’albumine tout en établissant une fenêtre. Enfin, le risque que l’embryon soit endommagé pendant le fenêtrage est atténué en éliminant 5 à 6 mL d’albumine. - Après avoir retiré l’albumine, refermer l’ouverture avec du ruban adhésif et laisser les œufs incuber à 37 °C pendant 48 h.
4. Jour 4
- Préparez la solution de Ringer, une solution saline normale à 0,9 % et 1x PBS comme décrit à la section 1 du protocole. Ensuite, autoclavez les trois solutions. Après l’autoclavage, placez la solution respective à température ambiante.
- Sortez l’œuf de l’incubateur à 37 °C et coupez la coquille en une forme circulaire. Avant de couper la coquille d’œuf, couvrez la zone à couper avec du ruban adhésif.
REMARQUE: Couvrir la zone de la fenêtre avec du ruban adhésif empêche la rupture de la coquille d’œuf dans des endroits indésirables. Cependant, si vous vous introduisez dans un endroit indésirable, scellez la zone avec le ruban adhésif. Couvrir les endroits à couper avec du ruban adhésif empêche les morceaux de coquille de tomber sur le sac vitellin. - Créez un petit trou dans la coquille d’œuf avec un ciseau de bord pointu à l’endroit où la fenêtre est souhaitée et commencez à couper une ouverture circulaire. Ce processus est connu sous le nom de fenêtrage.
REMARQUE: Assurez-vous que la coupe circulaire est suffisamment grande pour permettre un accès facile à l’embryon de n’importe quelle direction. Si nécessaire, modifiez la position de l’œuf pour l’adapter à la position de l’embryon. - Ensuite, à l’aide d’un microscope chirurgical à zoom stéréo, localisez l’artère vitelline droite (RVA).
REMARQUE: Les embryons de poulet subissent normalement une torsion thoracique (ainsi qu’une flexion cervicale, etc.) à mesure qu’ils se développent, de sorte que le côté gauche de la tête est contre le jaune au stade de 72 h. Plus caudalement, là où les artères vitelline sortent du corps, l’embryon n’est pas très tordu, et cette partie du corps se trouve du côté ventral vers le bas vers le jaune. Ainsi, en regardant directement, le droit de l’embryon est à la droite du chercheur. - Une fois le RVA localisé, créez deux petits trous sur les côtés gauche et droit du RVA à l’aide d’une aiguille de 26 G (Figure 2).
- Placez la sonde d’imagerie du flux sanguin Doppler au-dessus du RVA. Assurez-vous que la sonde d’imagerie du flux sanguin Doppler est placée à 5 ± 1 mm du site de l’ischémie et vers l’extrémité distale de l’ARV. Prenez une lecture de flux pendant 2 min et 30 s (ou plus si vous le souhaitez). Ce sera la lecture de la phase normoxique.
- Entre-temps, à l’aide d’une pince nasale et d’une pince dentée, moulez manuellement le bord de l’aiguille vertébrale en forme de crochet (Figure 3). Pour ce faire, pliez le bord de l’aiguille rachidienne sur environ 1 mm. Une taille plus grande rendra plus difficile l’insertion et le retrait de l’aiguille vertébrale pendant la procédure I / R.
- Insérez l’aiguille vertébrale directement sous l’artère vitelline droite à l’aide d’un micromanipulateur.
REMARQUE: Insérez l’aiguille vertébrale avec une extrême prudence pour éviter d’endommager le RVA ou les artères adjacentes. La technique optimale consiste à ajuster le crochet personnalisé de l’aiguille spinale exactement au-dessus du côté droit du trou RVA, puis à insérer progressivement le bord personnalisé de l’aiguille vertébrale dans le sac vitellin à l’aide d’un micromanipulateur sous la direction d’un microscope chirurgical à zoom stéréo à travers le trou droit. Une fois que le crochet de l’aiguille vertébrale est dans le sac vitellin, ajustez progressivement le crochet sous le RVA afin que son bord soit exactement placé sous le trou gauche. Il est maintenant temps de soulever l’aiguille de la colonne vertébrale. - Maintenant, avec l’aide du micromanipulateur, soulevez progressivement l’artère jusqu’à ce que le flux sanguin Doppler indique une diminution minimale de 80% du flux artériel.
- Une fois qu’une baisse de 80% ou plus du flux Doppler est obtenue, laissez l’aiguille vertébrale soulevée (en tirant l’artère vers le haut) pendant 5 minutes. Ce sera la période d’ischémie dans la RVA.
REMARQUE: Il est essentiel de surveiller le flux Doppler pendant la durée de l’ischémie. Si une quantité importante de fluctuation est trouvée, mettez fin aux tests. - Après la période d’ischémie de 5 minutes, relâchez progressivement l’artère pour rétablir un flux sanguin normal. Assurez-vous qu’une lecture de débitmètre sanguin Doppler affiche des valeurs comparables à celles obtenues lors de la normoxie. Ce sera la période de reperfusion dans le RVA (Figure 4).
- Après la procédure I/R, appliquez quelques gouttes (2-3) de 1x PBS sur l’embryon et surveillez-le pendant 2-3 min.
REMARQUE: L’utilisation de 1x PBS aide à empêcher l’embryon de se dessécher. - Enfin, refermez la fenêtre avec du ruban adhésif et replacez l’œuf dans l’incubateur à œufs pendant 5 h et 55 min.
- Après 5 h et 55 min, sortez l’œuf de l’incubateur à œufs, placez-le sur la grille à œufs, rouvrez la fenêtre et suivez le protocole de traitement en aval.
5. Traitements
- Pour le traitement des artères avec des médicaments, des activateurs ou des inhibiteurs, excisez le RVA après 1 h du processus I /R.
- Pour les études en aval, retirez d’abord l’embryon de la coquille de l’œuf en le plaçant sur une boîte de Petri stérile de 90 mm.
- Une fois l’embryon libéré dans la boîte de Pétri, excisez le RVA à l’aide de l’iris oculaire sous la direction d’un microscope chirurgical à zoom stéréo.
- Assurez-vous que la dimension d’excision de l’ARV peut atteindre 15 ± 1 mm (distale du tronc), 5 ± 1 mm chacune sur les côtés gauche et droit de l’artère et 2 ± 1 mm vers le tronc.
REMARQUE: Une règle peut être utilisée pour mesurer la surface à exciser (facultatif). - Après avoir excisé le RVA, lavez-le avec 1x PBS dans une boîte de Petri stérile contenant 1x PBS.
- Pour les traitements souhaités, placer l’artère dans un tube centrifuge de 1,5 mL (stérilisé) rempli de 500 μL de solution de Ringer. Placez le RVA dans le tube de la centrifugeuse et placez-le dans un incubateur à 37 °C pendant 5 h et 55 min.
REMARQUE: Selon les traitements, utilisez soit la solution de Ringer sans aucun traitement, soit le traitement avec le volume et la concentration souhaités de médicament, d’activateur ou d’inhibiteur. - Après 5 h et 55 min d’incubation, retirez le RVA de l’incubateur de laboratoire à 37 °C et procédez aux traitements souhaités.
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Representative Results
La technique d’imagerie du flux sanguin Doppler a été utilisée pour évaluer l’efficacité de notre modèle. En bref, nous avons comparé les données du groupe témoin avec les données du groupe RVA pour déterminer le succès de notre création. La figure 4A illustre un flux typique associé à l’animal témoin, tandis que la figure 4B illustre les résultats obtenus à partir d’un ARV. Le numérique 1-8 représente les différents événements associés aux phases I/R. En bref, les chiffres 1 à 3 correspondent à la phase de normoxie, tandis qu’une forte baisse du flux aux points 3 et 4 représente les événements associés à la diminution du flux sanguin dans le RVA. Une fois qu’une baisse de 80% ou plus avait été obtenue, le RVA a été laissé levé pendant les 5 minutes suivantes. C’était la phase de l’ischémie (numérique 4-5). Après une levée de 5 minutes du RVA, le RVA a été libéré, qui est représenté par les chiffres 6 et 7. Le flux à partir du point 7 représente la phase de reperfusion, qui se produit après que le RVA a atteint des niveaux de flux sanguin normaux, qui était la phase de reperfusion. Cette expérience particulière a démontré l’efficacité de la modélisation I/R dans l’embryon de poussin développé à 3 jours.
Pour vérifier l’utilité de notre modèle, nous avons étudié les modèles d’expression des protéines, de l’ARN et de l’ADN par ELISA, Western blotting, qRT-PCR et analyse par électrophorèse sur gel. En bref, nous avons divisé les œufs développés sur 3 jours en trois groupes expérimentaux: témoin, I / R et Traitements + I / R. Une différence significative dans l’expression des protéines, des gènes et de l’intégrité de l’ADN a été observée entre leurs groupes I/R et témoins respectifs. Comme indiqué ci-dessous, le traitement médicamenteux du groupe I/R a efficacement amélioré les résultats observés dans ce groupe par rapport au groupe traité par I/R seul ; ceci est conforme à notre publication antérieure sur laquelle ce protocole est basé1. Les procédures de laboratoire standard ont été suivies pour ELISA18, Western blotting19, qRT-PCR20 et l’électrophorèse sur gel21, qui ne sont pas couvertes dans le présent document (Figure 5, Figure 6, Figure 7, Figure 8).
L’ischémie-reperfusion stimule plusieurs processus, y compris la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont préjudiciables aux tissus. Les effets néfastes causés par la réponse des systèmes de défense intrinsèques antioxydants du corps aux ROS sont une caractéristique importante des lésions I / R. Nous avons examiné les activités des protéines régulatrices de l’oxygène 150 (ORP150), de la superoxyde dismutase 1 cytoplasmique (SOD1) et de la catalase dans les vaisseaux ischémiques. Par rapport au groupe témoin, I/R a élevé l’activité de l’ORP150, de la SOD1 cytoplasmique et de la catalase (Figure 5A-C). Cependant, la supplémentation en N-acétyl-L-cystéine (NAC), un quencher ROS, a atténué le stress oxydatif du groupe I / R.
Pour évaluer le potentiel inflammatoire de notre modèle, nous avons utilisé ELISA pour examiner l’expression de l’IL-1β et du TNF-α (Figure 6). Les deux interleukines ont été surexprimées dans le groupe I /R par rapport au groupe témoin, ce qui indique que notre modèle a le potentiel d’être utilisé dans les investigations inflammatoires. Ensuite, nous avons testé l’expression de la voie de l’inflammasome de la protéine 3 (NLRP3) contenant le récepteur de type NOD pyrin (NLRP3)22,23, et de la molécule pro-inflammatoire, NF-kβ24,25, qui sont impliquées dans l’amplification de l’inflammation, afin de confirmer l’utilité de ce modèle pour les études inflammatoires. En réponse aux I/R générés dans le RVA, cette enquête a trouvé des preuves d’activation de l’inflammasome NLRP3 (figure 7A), ainsi que du NF-kβ (figure 7B). Cependant, le traitement par Naringenin, un médicament anti-inflammatoire bien connu, a amélioré les effets inflammatoires, comme observé dans les groupes traités par médicament.
L’ischémie-reperfusion active les voies de mort cellulaire programmées26,27,28. Nous avons étudié les effets de l’I/R sur l’apoptose et les voies d’autophagie dans l’embryon de poussin. La figure 8A illustre l’effet de l’I/R sur la caspase-3 et la zVAD-fmk. La figure 8B-D démontre que le groupe I/R avait une expression plus élevée de LC3II ainsi que de rapport LC3II/I (marqueur des autophagosomes), Beclin1 (un régulateur significatif de l’autophagie dans les cellules de mammifères) et Atg7 (nécessaire pour l’autophagie basale) que le groupe témoin, respectivement, au niveau des protéines. En revanche, la figure 8E montre l’effet de l’I/R sur les niveaux d’ARNm. L’ajout de 3-MA, un inhibiteur de l’autophagie, a toutefois inversé les résultats. Ces résultats suggèrent que le modèle pourrait être utilisé pour étudier différents processus de mort cellulaire (p. ex., nécroptose). La figure 9 montre l’efficacité avec laquelle les changements au niveau de l’ADN peuvent être étudiés à l’aide de notre modèle Hook-I/R.
Enfin, nous comparons les résultats du modèle Hook-I/R et du modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) pour voir l’efficacité de notre modèle par rapport à d’autres modèles. Pour résumer, les AJR traités par I/R présentaient des niveaux plus élevés de caspase-3 clivée par la protéine apoptotique, de protéines d’autophagie Beclin1 et Atg7, et d’interleukines inflammatoires TNF-α et IFN-Ƴ que les AJR témoins. Fait intéressant, qu’il s’agisse d’analyser le stress inflammatoire ou les voies de mort cellulaire, le modèle Hook-I/R a produit des résultats extrêmement similaires à ceux obtenus par le modèle MCAO (Figure 10).
Figure 1 : Diagramme schématique d’une configuration typique du modèle d’ischémie-reperfusion d’embryons de poussins Hook-I/R. L’image montre les exigences d’expérimentation de l’ischémie-reperfusion d’embryons de poussins Hook-I /R, telles que le microscope chirurgical à zoom stéréo, le débitmètre sanguin laser Doppler, le micromanipulateur, l’aiguille spinale, les embryons de poussins développés pendant 72 h et une source d’éclairage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Image représentative d’un site d’occlusion et d’excision tissulaire présentant un embryon de poussin de 3 jours. (A) Le triangle montre l’emplacement de l’excision du tissu pour le transfert occidental, l’ARN et l’isolement de l’ADN. L’étoile et les points représentent le site de l’occlusion et les trous créés sur les côtés gauche et droit du RVA pour insérer l’aiguille sous l’artère pour la soulever, respectivement. Une image agrandie de la zone d’extraction tissulaire est également fournie avec elle. La notation A représente l’œil, B représente le cœur, C représente la gauche de l’artère vitelline et C’représente la droite de l’artère vitelline. (B) Une représentation schématique du côté droit de l’embryon de poussin montre la zone d’excision tissulaire à proximité de l’ARV. La ligne droite représente l’ARR émergeant du tronc de l’embryon. L’étoile sur la ligne verticale symbolise la position de la sonde de flux sanguin Laser Doppler. L’intersection indique le site d’occlusion. L’excision des artères a été faite jusqu’à 15 ± 1 mm (distale du tronc), 5 ± 1 mm chacune sur les côtés gauche et droit de l’artère, et 2 ± 1 mm vers le tronc. Toutes les mesures montrent les distances par rapport au site d’occlusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Image représentative d’une aiguille rachidienne avec un crochet sur mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Représentation d’un signal de débitmètre sanguin Doppler laser typique. Un signal de débitmètre sanguin Doppler laser typique a été mesuré sur une artère embryonnaire de poussin de 3 jours à partir d’un ovule du groupe témoin (A). Événements au départ (1), pendant la normoxie (2), pré-levée immédiate de la RVA (3), immédiatement après la levée de la RVA (4), pendant l’ischémie (5), pré-libération immédiate de la RVA (6), post-reperfusion immédiate (7), pendant la reperfusion (8) dans le groupe traité par ischémie tel qu’enregistré par le débitmètre sanguin Laser Doppler (B). Ce chiffre a été adopté à partir de Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; under a CC-BY license)1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effet de l’ischémie-reperfusion sur l’expression des protéines marqueurs du stress oxydatif. Le transfert western a été utilisé pour déterminer les niveaux d’expression ORP150, SOD1 et catalase. (A) L’expression d’ORP150 a été augmentée après des dommages I/R. NAC, un inhibiteur pan-ROS, a abaissé ORP150 à un niveau comparable à celui du contrôle. (B) Après I/R, l’expression de SOD1 était élevée. L’expression de SOD1 a également diminué après un traitement par NAC. (C) L’événement I/R a induit l’expression de la catalase. La RVA traitée par I/R et exposée à la NAC a montré une diminution des taux de catalase. Le GAPDH (A,C) et le β-Actin (B) ont été utilisés comme contrôles internes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Estimation de l’IL-1β et du TNF-α à l’aide d’ELISA. ELISA a été utilisé pour quantifier l’IL-1β et le TNF-α, et les résultats ont révélé qu’il y avait une augmentation de l’expression de l’IL-1β et du TNF-α, qui a été atténuée par l’ajout de Naringenin. Pour cette étude, l’ANOVA suivie du test de Newman-Keuls a été appliquée. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SD, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Effet de l’ischémie-reperfusion sur l’expression des protéines marqueurs de l’inflammation. (A) Le traitement I/R a entraîné une augmentation de l’expression de NLRP3. L’incubation de RVA traité par I/R avec naringénine a diminué l’expression de NLRP3. (B) Comme pour NLRP3, l’expression de NF-kβ a également augmenté après un traitement I/R. Le traitement de la naringénine a réduit l’expression de NF-kβ. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Effet de l’ischémie-reperfusion sur l’état apoptotique et autophagique des cellules RVA. (A) Pour explorer l’induction de l’apoptose par le processus I/R, l’expression de la caspase 3 clivée a été évaluée à l’aide du transfert western. Suite à des dommages I/R, le niveau de caspase 3 clivée a été augmenté. Cependant, le traitement par zVAD-fmk, un inhibiteur de l’apoptose, a diminué l’expression de la caspase 3 clivée. (B-D) Pour évaluer l’induction de l’autophagie après I/R, l’expression de LC3II/I, Beclin1 et Atg7 a été déterminée. Après I/R, l’expression de tous les marqueurs autophagiques a augmenté, tandis que l’exposition de l’ARR traité par I/R à l’inhibiteur d’autophagie 3-MA a diminué l’expression de toutes les protéines aux niveaux de contrôle. En tant que contrôle interne, GAPDH a été utilisé. (E) La qRT-PCR a été utilisée pour confirmer l’induction de l’autophagie et déterminer les niveaux d’expression de l’ARNm Ambra1 et Atg7. Les deux gènes ont montré une augmentation considérable de l’expression dans le groupe I / R par rapport au groupe témoin, qui a été restauré à des niveaux presque normaux après un traitement par NAC. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne pour les expériences qRT-PCR. Pour l’expérience (E), l’ANOVA, suivie du test de Newman-Keuls, a été appliquée. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SD, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Effet de l’ischémie-reperfusion sur les dommages à l’ADN. Pour déterminer si I/R induit des entailles d’ADN, nous avons examiné les dommages à l’ADN à l’aide de l’électrophorèse sur gel. I/R a entraîné une dégradation de l’ADN génomique, comme le montre le frottis dans l’échantillon I/R. La thérapie NAC de RVA endommagé par I / R a réduit les dommages à l’ADN. Une échelle d’ADN de 1 kb a été utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Comparaison du modèle Hook-I/R par rapport au modèle MCAO. Une comparaison a été faite entre les données générées par le modèle Hook-I/R et les données générées par le modèle MCAO. (A) L’expression de la protéine apoptotique caspase-3 et des protéines d’autophagie Beclin1 et Atg7 était plus élevée dans les AJR traités par I/R par rapport à l’expression des mêmes protéines dans les AJR témoins, ce qui était en accord avec les résultats obtenus dans les expériences MCAO. (B) Les taux de TNF-α et d’IFN-Ƴ se sont avérés élevés dans les groupes RVA et MCAO par rapport à leurs témoins respectifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom du matériel/de l’équipement | Concentration | Autoclave | Stockage | ||
| Réactifs pour la solution de Ringer | |||||
| Chlorure de sodium | 123 mM | ||||
| Chlorure de potassium | 4,96 mM | ||||
| Chlorure de calcium | 1,53 mM | ||||
| Eau distillée stérile | 100 mL | ||||
| pH | 7.4 | 15 min à 121 °C | R.T. | ||
| Réactifs pour une solution saline normale à 0,9 % | |||||
| Chlorure de sodium | 154mM | ||||
| Eau distillée stérile | 100 mL | ||||
| pH | 7.4 | 15 min à 121 °C | R.T. | ||
| Réactifs pour 70% d’éthanol | |||||
| 70% d’éthanol | 70 mL | ||||
| Eau distillée stérile | 30 mL | Non requis | R.T. | ||
| Réactifs pour 1x phosphate buffer Saline | |||||
| Chlorure de sodium | 136,8 mM | ||||
| Chlorure de potassium | 26,8 mM | ||||
| Phosphate de potassium monobasique anhydre | 14,6 mM | ||||
| di-sodium hydrogénophosphate heptahydraté | 5,37 mM | ||||
| Eau distillée stérile | 100 mL | 15 min à 121 °C | R.T. | ||
Tableau 1 : Recette des solutions utilisées dans cette étude.
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Discussion
L’objectif de la recherche sur l’ischémie-reperfusion est de créer des stratégies thérapeutiques qui préviennent la mort cellulaire et favorisent la récupération29,30. Pour surmonter les contraintes actuelles dans la recherche I/R, nous avons conçu un modèle d’embryon de poussin Hook I/R pour produire un modèle I/R fiable et reproductible. À notre connaissance, le nôtre est le premier modèle I/R jamais créé dans un embryon de poussin de 3 jours pour des expériences I/R de routine, en plus d’étudier les signaux de stress (par exemple, le stress oxydatif et inflammatoire). Compte tenu des avantages de la taille et de l’accessibilité au jour 3 du développement31, l’embryon de poussin a été utilisé à un stade de développement de 72 h, en raison du rendement élevé du modèle, de sa simplicité d’utilisation et de son adaptabilité pour l’analyse de routine32. En bref, au jour de développement 3, le poussin in ovo est un modèle hautement contrôlé, mais accessible et raisonnablement transparent dans l’œuf qui peut être utilisé pour visualiser la physiologie normale, la pathologie de la maladie et les effets du traitement expérimental. Sa taille énorme le rend particulièrement utile pour étudier la formation et le comportement de l’embryon pendant la physiologie normale ainsi que le stress33. Bien que des embryons de poussins plus âgés (ceux incubés pendant 4 jours ou plus) puissent être utilisés, et nous avons essayé un moment ultérieur, l’utilisation d’embryons plus âgés comme systèmes modèles est sévèrement limitée par le fait que le sac vitellin devient si épais au-delà de 3 jours de développement que les procédures chirurgicales sont difficiles. Il convient de mentionner que, bien que la RVA ne soit pas complètement formée à un moment précoce (par exemple, le jour 1 ou 2), le fenêtrage pourrait conduire à la tératogénicité34. Outre les limites associées à un point de développement précoce ou tardif, un embryon de poussin de 72 h sert de modèle idéal pour étudier le processus I/R puisque les embryons de poussin de 3 jours ont un système circulatoire bien défini30.
Comprendre la physiopathologie des lésions I/R est un objectif majeur de la conception d’un modèle I/R. Actuellement, il n’existe aucun traitement cliniquement utile pour réduire les dommages d’ischémie-reperfusion1,35. En conséquence, une large gamme de modèles in vitro et in vivo a été proposée. Dans ce contexte, la modélisation I/R dans un embryon de poussin en développement de 3 jours en ovo a été proposée pour la première fois. Des recherches antérieures ont montré que l’occlusion-reperfusion du flux sanguin artériel provoque des altérations pathologiques dans des modèles expérimentaux similaires à ceux observés chez l’homme36,37,38, nous espérions donc que notre modèle ferait de même (tel stress oxydatif et inflammatoire observé dans des modèles in vivo ou chez des patients). Avec les résultats de notre étude, l’hypothèse ci-dessus s’est avérée correcte.
La circulation du sang des embryons vers le sac vitellin est contrôlée par les vaisseaux vitellines dans les embryons de poussins39. Les embryons obtiennent des nutriments du jaune et diffusent de l’oxygène de l’air via la circulation vitelline; ainsi, en limitant l’un des vaisseaux vitelline qui peuvent perturber la nutrition et le transfert d’oxygène. Sur la base de ces faits, l’ischémie a été induite en obstruant l’apport sanguin à la RVA pendant 5 min, suivie d’une reperfusion pendant 5 h et 55 min supplémentaires. Le modèle proposé peut être utilisé pour examiner une gamme de divers processus pathologiques associés à l’I/R et tester une variété de médicaments et leurs cibles. Le modèle actuel peut être utilisé pour examiner les changements dans l’ADN, l’ARN et les protéines. Il a le potentiel de donner un rendement élevé. Outre sa simplicité et son adaptabilité pour une analyse régulière, le modèle peut également étudier le repérage à court terme des cellules souches, qui sera étudié dans de futures études.
Par rapport aux modèles in vitro , notre modèle est facile à utiliser, rentable et se développe rapidement, tout en étant éthiquement innocent32. La présence de microvascularisation, le système immunitaire et les évaluations physiologiques sont tous des avantages par rapport aux modèles in vitro , tandis que le faible coût, l’efficacité temporelle et l’absence de problèmes éthiques sont des avantages par rapport aux modèles in vivo40. Les avantages ci-dessus indiquent que notre modèle a un effet comparable aux autres modèles I/R actuellement utilisés (Figure 10). Une lacune potentielle est l’incapacité du modèle actuel à quantifier la zone d’infarctus. L’évaluation directe de l’infarctus peut être un biomarqueur précieux pour les dommages médiés par l’I/ R et une méthode pour cartographier les effets de divers médicaments thérapeutiques. Ainsi, nous avons cherché à quantifier la zone d’infarctus mais n’avons pas pu le faire en raison de la structure délicate des poussins développés 72 h. Par conséquent, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour évaluer les stratégies et les voies pour les processus d’I/R de manière exhaustive.
Pour résumer, le modèle actuel peut être utilisé pour étudier diverses voies de maladie liées à l’I/R et dépister une variété de médicaments et leurs cibles. En raison de sa reproductibilité élevée, de sa rentabilité et de sa simplicité, nous prévoyons que notre modèle sera une ressource précieuse pour la science fondamentale et la recherche translationnelle.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous tenons à exprimer notre gratitude à Hari Shankar pour ses contributions critiques lors de la vidéographie et du montage, à M. Baqer Hussain pour la voix off, à M. Asghar Rizvi pour le montage vidéo, à M. Mohammad Haider pour les tournages vidéo, à M. Mohammad Danish Siddiqui pour l’assistance pendant les expériences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
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