Summary
本文描述了使用脊髓针定制钩在3天雏鸡胚胎中的缺血再灌注（I / R）建模，以更好地了解I / R发展和治疗。该模型简单，快速且价格低廉。
Abstract
缺血和再灌注 （I/R） 疾病（如心肌梗死、卒中和外周血管疾病）是疾病和死亡的一些主要原因。目前有许多 体外 和 体内 模型可用于研究疾病或受损组织中的I / R机制。然而，迄今为止，还没有报告 任何蛋内 I / R模型，这将允许更好地了解I / R机制和更快的药物筛选。本文描述了在3天雏鸡胚胎中使用脊柱针定制钩进行I / R建模，以了解I / R发育和治疗机制。我们的模型可用于研究DNA，RNA和蛋白质水平的异常。此方法简单，快速且价格低廉。当前模型可以独立使用，也可以与现有的 体外 和 体内 I / R模型结合使用。
Introduction
缺血再灌注组织损伤与许多病理有关，包括心脏病发作、缺血性卒中、创伤和外周血管疾病1，2，3，4，5。这主要是由于缺乏对疾病进展的全面了解以及缺乏有效的研究模型。缺血性损伤发生在组织特定区域的血液供应被切断时。结果，缺血组织最终坏死，尽管速率因组织而异。因此，恢复血液供应可能有助于减轻损害。然而，已经观察到，在某些情况下，再灌注比单独的缺血造成的组织损伤更多6，7，8。因此，需要了解缺血再灌注的分子和细胞机制，以开发有效的治疗干预措施。目前，尚无针对 I/R 损伤的有效治疗方法。这种差异促使创建了新的实验模型，从体外到体内模型，以解决现有问题9，10，11，12，13。
雏鸡胚胎（Gallus gallus domesticus）因其易于获取，道德可接受性，相对较大的尺寸（与其他胚胎相比），低成本和快速生长而被广泛用于研究14。我们使用雏鸡胚胎在发育72小时时通过在脊髓针的帮助下闭塞和释放右维特林动脉来创建 卵内 I / R。我们将其命名为 Hook-I/R 缺血再灌注模型（图 1）。本研究中使用的模型能够准确模拟所有下游过程，包括氧化和炎症途径，这些途径通常与I / R损伤相关15，16，17。
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Protocol
Era勒克瑙医学院和医院的机构动物伦理委员会发布了一份书面豁免，指出根据动物实验控制和监督委员会（CPCSEA）进行这些实验不需要正式批准。然而，遵循标准操作程序以尽量减少胚胎痛苦的可能性。
1. 缓冲液制备（表1）
- 准备林格的解决方案
- 为了制备林格溶液，将0.72克NaCl（123mM），0.017gCaCl2（1.53mM），0.037gKCl（4.96mM）溶解在70mL无菌蒸馏H2O中，最终体积为100mL。 将pH值调节至7.4。让它完全溶解并高压灭菌。然后，通过0.22μm过滤器过滤，等分试样成一次性使用量（约10mL）并在室温下储存。
- 准备生理盐水（0.9%氯化钠，氯化钠）。
- 在70 mL无菌蒸馏H2 O中，溶解0.9gNaCl（154mM）。将体积补到 100 mL。在121°C下高压灭菌15分钟。 如有必要，用0.1 N HCl或0.1 N NaOH调节pH值至7.4。在15 mL无菌离心管中制备10 mL等分试样，并在室温下储存。
- 准备70%乙醇（v / v）。
- 将 70 mL 纯乙醇（摩尔重量 46.07 g/L）与 30 mL 无菌 H2O 混合。无需消毒。
- 准备1x磷酸盐缓冲液盐水（1x PBS）。
- 将0.144克Na2HPO4·7H2O（5.37 mM），0.8 g NaCl（136.8 mM），0.2 g KCl（26.8 mM），0.2 g KH2PO4（14. 6 mM）加入70 mL蒸馏水中，准备100 mL 1x PBS。 溶解并补足体积至100 mL，并在121°C下高压灭菌15分钟。 如果需要，将pH值降至7.4，加入几滴0.1 N HCl或0.1 N NaOH。在15 mL无菌离心管中等分试样10 mL并储存在室温下。
2. 第一天
- 安排鸡蛋灭菌所需的所有工具（70%乙醇，清洁湿巾，蛋架和OHP标记）。
- 用薄纸巾用70%乙醇清洁0天鸡蛋。只使用0天卵子，因为较老的卵子可能不会产生胚胎。
- 用OHP标记在鸡蛋上写下当前日期。
- 将卵放入温度设置为36-37°C，湿度水平为60%-65%的蛋孵化器中。在接下来的24小时内孵化卵。
3. 第2天
- 安排必要的设备，以取出5-6毫升白蛋白（锋利的剪刀，5毫升注射器，18 G针头，注射器丢弃器和胶带）。
- 用70%乙醇擦拭手术剪刀，或在用70%乙醇擦拭后使用高压灭菌器灭菌。
- 现在从37°C的鸡蛋孵化器中取出鸡蛋进行分层。
- 将鸡蛋放在干净的蛋架上。
- 将一小块胶带（尺寸：长约1英寸x宽）绑在鸡蛋的边缘。
- 用尖尖的边缘剪刀在蛋壳的边缘打一个小洞。以大约 75° 的角度插入 5 mL 注射器。
注意：5 mL 注射器随附 24 G x 1 针头（无菌），但最好将 24 G x 1 针头替换为 18 G x 1.5 针头（无菌）。18 G x 1.5 针的宽度为 1.25 x 38 mm。因此，它将促进白蛋白的去除。 - 将针头插入卵黄囊后，慢慢取出5-6毫升白蛋白。
注意：这为胚胎提供了一个可以生长的床。撤回白蛋白可防止白蛋白溢出，同时建立窗口。最后，通过消除5-6mL白蛋白来减轻胚胎在开窗期间受损的风险。 - 除去白蛋白后，用胶带重新密封开口，并将卵在37°C下孵育48小时。
4. 第4天
- 按照方案第1节所述准备铃声溶液，0.9%生理盐水和1x PBS。然后，高压灭菌三种溶液。高压灭菌后，将相应的溶液置于室温下。
- 从37°C的鸡蛋孵化器中取出鸡蛋，并将蛋壳切成圆形。在切割蛋壳之前，用胶带覆盖要切割的区域。
注意：用胶带覆盖窗户区域可防止蛋壳破裂到不需要的地方。但是，如果您闯入不需要的地方，请用胶带密封该区域。用胶带覆盖要切割的地方，防止壳片掉落到蛋黄囊上。 - 在需要窗户的地方用尖尖的边缘剪刀在蛋壳上打一个小洞，然后开始切割一个圆形开口。此过程称为窗口化。
注意：确保圆形切口足够大，以便从任何方向轻松进入胚胎。如果需要，改变卵子的位置以适应胚胎的位置。 - 接下来，使用立体变焦手术显微镜，定位右侧的维特林动脉（RVA）。
注意：鸡胚胎在发育过程中通常会经历胸扭转（以及宫颈屈曲等），使得头部的左侧在72小时阶段与蛋黄相抵。更尾部，在卵形动脉离开身体的地方，胚胎没有太多扭曲，身体的这一部分位于腹侧朝向蛋黄。所以，直接看，胚胎的右边是研究人员的右边。 - 找到RVA后，使用26 G针在RVA的左侧和右侧创建两个小孔（图2）。
- 将多普勒血流成像探头放在RVA上方。确保将多普勒血流成像探头放置在距缺血部位5±1mm处，并朝向RVA的远端。取通量读数2分钟30秒（如果需要，则更长）。这将是正氧相读数。
- 同时，使用鼻钳和齿镊子，手动将脊髓针的边缘模塑成钩子的形状（图3）。通过弯曲脊柱针的边缘约1毫米来做到这一点。较大的尺寸将使在I / R过程中插入和取出脊柱针头更加困难。
- 使用显微操作器将脊髓针直接插入右外斜动脉下方。
注意：请极其小心地插入脊柱针，以避免损坏RVA或任何相邻动脉。最佳技术是调整脊柱针的定制设计的钩子，正好在RVA孔的右侧上方，然后在微机械手的帮助下，在立体变焦手术显微镜的指导下，通过右孔逐渐将脊柱针的定制设计边缘插入卵黄囊中。一旦脊髓针的钩子进入卵黄囊，逐渐调整RVA下方的钩子，使其边缘正好位于左孔下方。现在是时候抬起脊髓针了。 - 现在，在显微操作器的帮助下，逐渐抬起动脉，直到多普勒血流表明动脉血流至少减少80%。
- 一旦多普勒通量达到80%或更高的下降，将脊柱针抬起（向上拉动动脉）5分钟。这将是RVA缺血的时期。
注意：在缺血期间监测多普勒通量至关重要。如果发现大量波动，请终止测试。 - 缺血期5分钟后，逐渐松开动脉，恢复正常的血流水平。确保多普勒血流量计读数显示与正常氧期间获得的值相当的值。这将是RVA中再灌注的时期（图4）。
- 在I / R程序之后，将几滴（2-3）1x PBS滴到胚胎上，并观察2-3分钟。
注意：使用1x PBS有助于防止胚胎变干。 - 最后，用胶带重新密封窗口，并将鸡蛋放回鸡蛋孵化器中5小时55分钟。
- 5小时55分钟后，从鸡蛋孵化器中取出鸡蛋，将其放在蛋架上，重新打开窗口，然后按照下游处理方案进行。
5. 治疗
- 对于用药物，激活剂或抑制剂治疗动脉，在I / R过程1小时后切除RVA。
- 对于下游研究，首先将胚胎从蛋壳中取出，将其放在无菌的90毫米培养皿上。
- 一旦胚胎被释放到培养皿中，在立体变焦手术显微镜的指导下使用眼部虹膜切除RVA。
- 确保RVA的切除尺寸不超过15±1毫米（距躯干远端），动脉左侧和右侧各5±1毫米，±1毫米。
注意：可以使用尺子来测量要切除的区域（可选）。 - 切除RVA后，在含有1x PBS的无菌培养皿中用1x PBS洗涤。
- 对于所需的治疗，将动脉置于充满500μL林格溶液的1.5mL离心管（灭菌）中。将RVA置于离心管中，并将其置于37°C培养箱中5小时55分钟。
注意：根据治疗的不同，要么使用林格氏溶液而不进行任何治疗，要么使用所需体积和浓度的药物，激活剂或抑制剂进行治疗。 - 孵育5小时55分钟后，从37°C实验室培养箱中取出RVA，然后继续进行所需的处理。
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Representative Results
多普勒血流成像技术用于评估我们模型的有效性。简而言之，我们将来自对照组的数据与来自RVA组的数据进行了比较，以确定我们创建的成功。 图4A 描绘了与对照动物相关的典型通量，而 图4B 描绘了从RVA获得的结果。数字 1-8 表示与 I/R 阶段关联的各种事件。简而言之，数字1-3对应于正常氧的相位，而3点和4点的通量急剧下降代表了与RVA中血流量减少相关的事件。一旦达到80%或更高的下降，RVA在接下来的5分钟内就会升高。这是缺血的阶段（数字4-5）。在RVA提升5分钟后，RVA被释放，由数字6和7表示。从点7开始的通量代表再灌注阶段，该阶段发生在RVA达到正常血流水平之后，即再灌注阶段。该特定实验证明了I / R建模在3天发育的雏鸡胚胎中的有效性。
为了验证我们模型的实用性，我们通过ELISA，蛋白质印迹，qRT-PCR和凝胶电泳分析研究了蛋白质，RNA和DNA的表达模式。简而言之，我们将3天发育的卵子分为三个实验组：对照组，I / R和治疗+ I / R。在各自的I / R和对照组之间观察到蛋白质，基因和DNA完整性的表达显着差异。如下所述，与单独使用I / R治疗组相比，对I / R组的药物治疗有效地改善了该组观察到的结果;这与我们之前发布的协议1一致。ELISA18、蛋白质印迹19、qRT-PCR20和凝胶电泳21遵循标准实验室程序，本文未涵盖这些操作（图5，图6，图7，图8）。
缺血再灌注刺激几个过程，包括形成对组织有害的活性氧（ROS）。内在抗氧化身体防御系统对ROS的反应引起的有害影响是I / R损伤的一个重要特征。我们检查了缺血血管中氧调节蛋白150（ORP150），细胞质超氧化物歧化酶1（SOD1）和过氧化氢酶的活性。与对照组相比，I / R提高了ORP150，细胞质SOD1和过氧化氢酶的活性（图5A-C）。然而，补充N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC），一种ROS淬灭剂，减轻了I / R组的氧化应激。
为了评估我们模型的炎症潜力，我们使用ELISA来检查IL-1β和TNF-α表达（图6）。与对照组相比，两种白细胞介素在I / R组中均过度表达，表明我们的模型有可能用于炎症研究。接下来，我们测试了NOD样受体吡喃结构域含蛋白3（NLRP3）炎症小体途径22，23和促炎分子NF-kβ24，25的表达，它们参与放大炎症，以确认该模型对炎症研究的有效性。为了响应RVA中产生的I / R，该研究发现了NLRP3炎症小体（图7A）以及NF-kβ（图7B）激活的证据。然而，正如在药物治疗组中观察到的那样，用柚皮素（一种众所周知的抗炎药）治疗改善了炎症作用。
缺血再灌注激活程序化细胞死亡途径26，27，28。我们研究了I / R对雏鸡胚胎凋亡和自噬途径的影响。图8A描述了I/R对caspase-3和zVAD-fmk的影响。图8B-D表明，在蛋白质水平上，I/R组的LC3II和LC3II/I比（自噬体标记物）、Beclin1（哺乳动物细胞自噬的重要调节因子）和Atg7（基础自噬所需的）的表达分别高于对照组。相比之下，图8E显示了I / R对mRNA水平的影响。然而，添加自噬抑制剂3-MA逆转了结果。这些发现表明，该模型可用于研究不同的细胞死亡过程（例如，坏死性凋亡）。图9显示了使用我们的Hook-I / R模型研究DNA水平变化的效率。
最后，我们比较了 Hook-I/R 模型和大脑中动脉阻塞 （MCAO） 模型的结果，以了解我们的模型与其他模型相比的有效性。总而言之，I / R处理的RVA具有比对照RVA更高水平的凋亡蛋白切割半胱天冬酶-3，自噬蛋白Beclin1和Atg7以及炎症白细胞介素TNF-α和IFN-Ƴ。有趣的是，无论是分析炎症应激还是细胞死亡途径，Hook-I / R模型产生的结果与MCAO模型获得的结果非常相似（图10）。
图 1：Hook-I/R 雏鸡胚胎缺血再灌注模型的典型设置示意图。 图中显示了Hook-I/R雏鸡胚胎缺血再灌注实验要求，如立体变焦手术显微镜、激光多普勒血流量计、显微操作器、脊髓针、72小时发育的雏鸡胚胎和照明源。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：3天雏鸡胚胎的代表性图像 - 展示闭塞部位和组织切除区域。 （A）三角形显示了切除组织的位置，以进行蛋白质印迹，RNA和DNA分离。星形和圆点分别代表闭塞部位以及在RVA左侧和右侧形成的孔，以将针插入动脉下方以将其抬起。还提供了组织提取区域的放大图像。符号A代表眼睛，B代表心脏，C代表维特林动脉的左侧，C'代表维特林动脉的右侧。（B）雏鸡胚胎右侧的示意图显示了RVA附近的组织切除区域。直线代表从胚胎躯干中出来的RVA。垂直线上的星星象征着激光多普勒血流探头的位置。交叉点表示遮挡的部位。切除动脉的切除量高达15±1毫米（距躯干远端），动脉左侧和右侧各5±1毫米，2±1毫米朝向躯干。所有测量结果都显示了与遮挡部位的距离。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：带有定制钩子的脊髓针的代表性图片。请单击此处查看此图的放大版本。
图 4：典型激光多普勒血流量计信号的表示。 在来自对照组卵（A）的3天雏鸡胚胎动脉上测量典型的激光多普勒血流量计信号。基线（1），在正常氧化（2），立即提升RVA（3），立即提升RVA后（4），缺血期间（5），立即预释放RVA（6），立即再灌注后（7），在缺血治疗组的再灌注（8）期间的事件，如激光多普勒血流量计（B）记录的那样。这个数字来自Fauzia等人，2018年（药理学前沿;在CC-BY许可证下）1。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：缺血再灌注对氧化应激标志物蛋白表达的影响。 蛋白质印迹用于测定ORP150，SOD1和过氧化氢酶表达水平。（A） ORP150表达在I/R损伤后增加。NAC是一种泛ROS抑制剂，将ORP150降低到与对照相当的水平。（B） I/R 后，SOD1 表达升高。SOD1表达在NAC治疗后同样降低。（C）I/ R事件诱导过氧化氢酶的表达。用I / R处理并暴露于NAC的RVA显示过氧化氢酶水平降低。GAPDH（A，C）和β-肌动蛋白（B）被用作内部对照。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：使用ELISA估计IL-1β和TNF-α。 ELISA用于定量IL-1β和TNF-α，结果显示IL-1β和TNF-α表达增加，通过添加柚皮素减轻了该表达。对于这项研究，应用了方差分析，然后是纽曼-基尔斯检验。误差线表示均值± SD，n = 3。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：缺血再灌注对炎症标志物蛋白表达的影响（A）I / R治疗导致NLRP3表达增加。I / R处理的RVA与柚皮素的孵育降低了NLRP3的表达。（B）与NLRP3类似，I/R处理后NF-kβ的表达也增加。柚皮素的处理降低了NF-kβ的表达，GAPDH被用作内部对照。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：缺血再灌注对RVA细胞凋亡和自噬状态的影响（A）为了探索I / R过程诱导细胞凋亡，使用蛋白质印迹评估切割的半胱天冬酶3的表达。在I / R损伤后，裂解的半胱天冬酶3的水平增加。然而，用细胞凋亡抑制剂zVAD-fmk治疗会降低裂解的半胱天冬酶3表达。（B-D）为了评估I/R后自噬的诱导，测定了LC3II/I、Beclin1和Atg7的表达。在I / R之后，所有自噬标志物的表达增加，而I / R处理的RVA暴露于自噬抑制剂3-MA降低了所有蛋白质的表达以控制水平。作为内部控制，使用了GAPDH。（E）qRT-PCR用于确认自噬的诱导并确定Ambra1和Atg7 mRNA表达水平。与对照组相比，这两个基因在I / R组中的表达显着增加，在NAC治疗后恢复到接近正常水平。GAPDH被用作qRT-PCR实验的内部对照。对于实验（E），应用了方差分析，然后是Newman-Keuls检验。误差线表示均值± SD，n = 3。请点击此处查看此图的放大版本。
图9：缺血再灌注对DNA损伤的影响。 为了确定I / R是否诱导DNA切口，我们使用凝胶电泳检查DNA损伤。I / R导致基因组DNA降解，如I / R样品中的涂抹所示。I / R损伤RVA的NAC治疗减少了DNA损伤。采用1 kb DNA分子量标准品。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 10：Hook-I/R 模型与 MCAO 模型的比较。 对 Hook-I/R 模型生成的数据和 MCAO 模型生成的数据进行了比较。（A）与对照RVA中相同蛋白的表达相比，凋亡蛋白caspase-3和自噬蛋白Beclin1和Atg7在I/ R处理的RVA中的表达更高，这与MCAO实验中获得的结果一致。（B）与各自的对照组相比，RVA组和MCAO组的TNF-α和IFN-Ƴ水平均升高。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 材料/设备名称 | 浓度 | 高压 釜 | 存储 | ||
| 用于林格解决方案的试剂 | |||||
| 氯化钠 | 123 毫米 | ||||
| 氯化钾 | 4.96 毫米 | ||||
| 氯化钙 | 1.53 毫米M | ||||
| 无菌蒸馏水 | 100 毫升 | ||||
| 酸碱度 | 7.4 | 121 °C 下 15 分钟 | R.T. | ||
| 用于0.9%生理盐水的试剂 | |||||
| 氯化钠 | 1.54米 | ||||
| 无菌蒸馏水 | 100 毫升 | ||||
| 酸碱度 | 7.4 | 121 °C 下 15 分钟 | R.T. | ||
| 70%乙醇试剂 | |||||
| 70%乙醇 | 70 毫升 | ||||
| 无菌蒸馏水 | 30 毫升 | 不需要 | R.T. | ||
| 用于1x磷酸盐缓冲液盐水的试剂 | |||||
| 氯化钠 | 136.8 毫米 | ||||
| 氯化钾 | 26.8 毫米 | ||||
| 磷酸一元无水钾 | 14.6 毫米 | ||||
| 磷酸氢二钠七水合物 | 5.37 毫米M | ||||
| 无菌蒸馏水 | 100 毫升 | 121 °C 下 15 分钟 | R.T. | ||
表1：本研究中使用的溶液配方。
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Discussion
缺血再灌注研究的目标是制定预防细胞死亡和促进恢复的治疗策略29，30。为了克服当前I/R研究的限制，我们设计了一个Hook I/R雏鸡胚胎模型，以产生可靠且可重复的I/R模型。据我们所知，除了研究应激信号（例如，氧化和炎症应激）之外，我们还是在3天雏鸡胚胎中创建的第一个I / R模型，用于常规I / R实验。鉴于发育第3天的大小和可及性的好处31，雏鸡胚胎在72小时的发育阶段使用，因为该模型的高产量，使用简单性以及对常规分析的适应性32。简而言之，在发育第3天， 蛋 鸡是蛋内高度受控，但可访问且相当透明的模型，可用于可视化正常生理学，疾病病理学和实验治疗的效果。其巨大的尺寸使其特别适用于研究胚胎在正常生理学和压力下的形成和行为33。虽然可以使用较老的雏鸡胚胎（孵育4天或更长时间的雏鸡胚胎），并且我们确实尝试了较晚的时间点，但使用较老的胚胎作为模型系统受到严重限制，因为卵黄囊在发育超过3天后会长得如此之厚，以至于外科手术很困难。值得一提的是，虽然RVA在早期窗口（例如，在第1天或第2天）未完全形成，但窗口可能导致致畸性34。除了与发育的早期或晚期时间点相关的限制外，72小时的雏鸡胚胎是研究I / R过程的理想模型，因为3天的雏鸡胚胎具有明确定义的循环系统30。
了解 I/R 损伤的病理生理学是设计 I/R 模型的主要目标。目前，没有任何临床上有用的治疗方法可以减少缺血再灌注损伤1，35。因此，已经提出了广泛的 体外 和 活体模型。在此背景下，首次提出了在卵中发育3天的雏鸡胚胎 中的 I / R建模。先前的研究表明，动脉血流的闭塞 - 再灌注会导致实验模型中的病理改变，这些模型与人类36，37，38中看到的相似，因此我们希望我们的模型也能做同样的事情（在体内模型或患者中观察到的氧化和炎症应激）。根据我们研究的结果，上述假设被证明是正确的。
从胚胎到卵黄囊的血液循环由雏鸡胚胎中的维特林血管控制39。胚胎从蛋黄中获取营养， 并通过 维特林循环从空气中扩散氧气;因此，限制任何可能破坏营养和氧气转移的维特林血管。基于这些事实，通过阻塞RVA的血液供应5分钟，然后再灌注5小时和55分钟来诱导缺血。所提出的模型可用于检查与I / R相关的一系列各种疾病过程，并测试各种药物及其靶标。目前的模型可用于检查DNA，RNA和蛋白质的变化。它有可能提供高输出。除了对常规分析的简单性和适应性外，该模型还可以研究短期干细胞归巢，这将在以后的研究中进行研究。
与 体外 模型相比，我们的模型易于使用，具有成本效益，并且生长迅速，并且在道德上是无辜的32。微脉管系统、免疫系统和生理评估的存在都是优于 体外 模型的优势，而低成本、时间有效性和无伦理问题比体外模型更有利40。上述优点表明，我们的模型具有与当前使用的其他 I/R 模型相当的效果（图 10）。一个潜在的缺点是当前模型无法量化梗死区域。直接梗死评估可能是 I/R 介导损伤的有价值的生物标志物，也是绘制各种治疗药物效果的方法。因此，我们试图量化梗死区域，但由于72只h型雏鸡的微妙结构而无法量化。因此，需要进一步的研究来全面评估I / R过程的策略和途径。
总而言之，目前的模型可用于研究与I / R相关的各种疾病途径，并筛选各种药物及其靶标。由于其高可重复性，成本效益和简单性，我们预计我们的模型将成为基础科学和转化研究的宝贵资源。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们要感谢Hari Shankar先生在摄像和编辑期间提供的重要投入，Baqer Hussain先生提供画外音，Asghar Rizvi先生负责视频编辑，Mohammad Haider先生负责录像，Mohammad Danish Siddiqui先生在实验期间提供协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
