Summary
Dit artikel beschrijft ischemie-reperfusie (I / R) modellering in een 3-daags kuikenembryo met behulp van een spinale naald aangepaste haak om de I / R-ontwikkeling en -behandeling beter te begrijpen. Dit model is eenvoudig, snel en goedkoop.
Abstract
Ischemie en reperfusie (I / R) aandoeningen, zoals myocardinfarct, beroerte en perifere vaatziekten, zijn enkele van de belangrijkste oorzaken van ziekte en overlijden. Veel in vitro en in vivo modellen zijn momenteel beschikbaar voor het bestuderen van het I/R-mechanisme in ziekte of beschadigde weefsels. Tot op heden is er echter geen in ovo I / R-model gemeld, wat een beter begrip van I / R-mechanismen en snellere screening van geneesmiddelen mogelijk zou maken. Dit artikel beschrijft I / R-modellering met behulp van een spinale naald aangepaste haak in een 3-daags kuikenembryo om I / R-ontwikkelings- en behandelingsmechanismen te begrijpen. Ons model kan worden gebruikt om afwijkingen op DNA-, RNA- en eiwitniveau te onderzoeken. Deze methode is eenvoudig, snel en goedkoop. Het huidige model kan onafhankelijk of in combinatie met bestaande in vitro en in vivo I/R-modellen worden gebruikt.
Introduction
Ischemie-reperfusie weefselbeschadiging is in verband gebracht met een aantal pathologieën, waaronder hartaanvallen, ischemische beroerte, trauma en perifere vaatziekten1,2,3,4,5. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan een uitgebreid begrip van de ziekteprogressie en het ontbreken van een effectief onderzoeksmodel. Ischemische schade treedt op wanneer de bloedtoevoer naar een specifiek deel van het weefsel wordt afgesneden. Als gevolg hiervan necrotiseert ischemisch weefsel uiteindelijk, hoewel de snelheid varieert afhankelijk van het weefsel. Daarom kan het herstellen van de bloedtoevoer helpen om de schade te beperken. In sommige gevallen is echter waargenomen dat reperfusie meer weefselschade veroorzaakt dan ischemie alleen6,7,8. Daarom is het begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van ischemie-reperfusie vereist om een effectieve therapeutische interventie te ontwikkelen. Momenteel is er geen effectieve behandeling voor I/R-letsels bekend. Deze ongelijkheid heeft geleid tot de creatie van nieuwe experimentele modellen, variërend van in vitro tot in vivo modellen, om het bestaande probleem aan te pakken9,10,11,12,13.
Kuikenembryo's (Gallus gallus domesticus) worden veel gebruikt in onderzoek vanwege hun gemakkelijke toegang, ethische aanvaardbaarheid, relatief grote omvang (in vergelijking met andere embryo's), lage kosten en snelle groei14. We gebruikten een kuikenembryo na 72 uur ontwikkeling om een in ovo I / R te creëren door de juiste vitelline-slagader af te sluiten en vrij te geven met behulp van een spinale naald. We noemden het het Hook-I/R ischemie-reperfusiemodel (figuur 1). Het model dat in deze studie wordt gebruikt, is in staat om alle stroomafwaartse processen nauwkeurig te simuleren, inclusief oxidatieve en inflammatoire routes, die vaak worden geassocieerd met I / R-schade15,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Institutional Animal Ethical Committee van Era's Lucknow Medical College and Hospital heeft een schriftelijke verklaring van afstand afgegeven waarin staat dat er geen formele goedkeuring nodig was om deze experimenten uit te voeren in overeenstemming met het Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals (CPCSEA). Standaard operationele procedures werden echter gevolgd om elk potentieel voor embryonale nood te minimaliseren.
1. Buffervoorbereiding (tabel 1)
- Bereid de oplossing van Ringer voor
- Los voor de bereiding van ringeroplossing 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) op in 70 ml steriel gedestilleerd H2O, met een eindvolume van 100 ml. Stel de pH in op 7,4. Laat het volledig oplossen en autoclaaf. Filter vervolgens door een filter van 0,22 μm, aliquot in hoeveelheden voor eenmalig gebruik (ongeveer 10 ml) en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid normale zoutoplossing (0,9% natriumchloride, NaCl).
- Los in 70 ml steriel gedestilleerd H2O 0,9 g NaCl (154 mM) op. Maak het volume aan op 100 ml. Autoclaaf gedurende 15 min bij 121 °C. Stel de pH indien nodig in op 7,4 met 0,1 N HCl of 0,1 N NaOH. Maak 10 ml aliquots in een steriele centrifugebuis van 15 ml en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid 70% ethanol (v/v).
- Meng 70 ml zuivere ethanol (Mol. wt. 46,07 g/l) tot 30 ml steriel H2O. Bereid indien nodig voor of bewaar bij kamertemperatuur. Steriliseren is niet nodig.
- Bereid 1x fosfaatbufferzoutoplossing (1x PBS).
- Bereid 100 ml 1x PBS door 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14, 6 mM) toe te voegen aan 70 ml gedestilleerd water. Los het volume op en vul het aan tot 100 ml en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C. Breng de pH op 7,4 en voeg indien nodig een paar druppels van 0,1 N HCl of 0,1 N NaOH toe. Maak aliquots van 10 ml in een steriele centrifugebuis van 15 ml en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Dag 1
- Schik alle gereedschappen die nodig zijn voor het steriliseren van eieren (70% ethanol, reinigingsdoekjes, een eierrek en een OHP-marker).
- Reinig de eieren van 0 dagen met 70% ethanol met papieren doekjes. Gebruik alleen een ei van 0 dagen, omdat oudere eieren mogelijk geen aanleiding geven tot een embryo.
- Schrijf de huidige datum op eieren met een OHP-marker.
- Leg de eieren in een eierincuse die is ingesteld op een temperatuur van 36-37 °C en een vochtigheidsgraad van 60%-65%. Broed de eieren de volgende 24 uur uit.
3. Dag 2
- Regel de benodigde apparatuur voor het opzuigen van 5-6 ml albumine (scherpe randschaar, 5 ml spuit, 18 G naald, spuit discarder en plakband).
- Veeg de chirurgische schaar af met 70% ethanol of steriliseer met een autoclaaf na het afvegen met 70% ethanol.
- Neem nu het ei uit de 37 °C eierincuse voor gelaagdheid.
- Leg het ei op een schoon eierrek.
- Bevestig een klein stukje plakband (grootte: ongeveer 1 inch lengte x breedte) aan de rand van het ei.
- Maak een klein gaatje in de rand van de eierschaal met een scherppuntige schaar. Plaats een spuit van 5 ml onder een hoek van ongeveer 75°.
OPMERKING: De spuit van 5 ml wordt geleverd met een naald van 24 G x 1 (steriel), maar het is goed om de naald van 24 G x 1 te vervangen door een naald van 18 G x 1,5 (steriel). De naald van 18 G x 1,5 is 1,25 x 38 mm breed. Daarom zal het de verwijdering van albumine vergemakkelijken. - Nadat u de naald in de dooierzak hebt ingebracht, trekt u langzaam 5-6 ml albumine terug.
OPMERKING: Dit geeft het embryo een bed waarop het kan groeien. Het terugtrekken van albumine voorkomt overspill van albumine tijdens het opzetten van een venster. Ten slotte wordt het risico dat het embryo tijdens het vensteren wordt beschadigd, beperkt door 5-6 ml albumine te elimineren. - Na het verwijderen van het albumine, hersluit de opening met plakband en laat de eieren gedurende 48 uur uitbroeden bij 37 °C.
4. Dag 4
- Bereid de Ringer-oplossing, 0,9% normale zoutoplossing en 1x PBS zoals beschreven in rubriek 1 van het protocol. Autoclaaf vervolgens de drie oplossingen. Plaats na het autoclaveren de betreffende oplossing op kamertemperatuur.
- Haal het ei uit de 37 °C eierincuse en snijd de schaal in een ronde vorm. Voordat u de eierschaal snijdt, bedek u het te snijden gebied met plakband.
OPMERKING: Het bedekken van het raamgebied met plakband voorkomt het breken van de eierschaal op ongewenste plaatsen. Als u echter op een ongewenste plaats breekt, sluit u het gebied af met het plakband. Het afdekken van de te snijden plaatsen met plakband voorkomt dat schelpstukken op de dooierzak vallen. - Maak een klein gaatje in de eierschaal met een scherppuntige randschaar op de plaats waar de raamopening gewenst is en begin met het snijden van een cirkelvormige opening. Dit proces staat bekend als windowing.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cirkelvormige snede groot genoeg is om gemakkelijk toegang te hebben tot het embryo vanuit elke richting. Verander indien nodig de positie van het ei om de positie van het embryo te accommoderen. - Zoek vervolgens met behulp van een stereo zoom chirurgische microscoop de juiste vitelline-slagader (RVA).
OPMERKING: Kippenembryo's ondergaan normaal gesproken thoracale torsie (samen met cervicale flexie, enz.) terwijl ze zich ontwikkelen, zodanig dat de linkerkant van het hoofd tegen de dooier ligt in het 72 uur-stadium. Meer dichtgekit, waar de vitelline-slagaders het lichaam verlaten, is het embryo niet veel gedraaid en ligt dit deel van het lichaam ventrale kant naar beneden in de richting van de dooier. Dus, direct bekijkend, is het recht van het embryo rechts van de onderzoeker. - Zodra de RVA is gelokaliseerd, maakt u twee kleine gaatjes aan de linker- en rechterkant van de RVA met behulp van een naald van 26 G (figuur 2).
- Plaats de Doppler bloedstroombeeldsonde boven de RVA. Zorg ervoor dat de Doppler-bloedstroombeeldvormingssonde op 5 ± 1 mm van de plaats van ischemie en in de richting van het distale uiteinde van de RVA wordt geplaatst. Neem een fluxmeting gedurende 2 min en 30 s (of langer indien gewenst). Dit zal de normoxische fase meting zijn.
- In de tussentijd, met behulp van een neustang en getande tang, vorm de rand van de spinale naald handmatig in de vorm van een haak (figuur 3). Doe dit door de rand van de spinale naald ongeveer 1 mm te buigen. Een groter formaat maakt het moeilijker om de spinale naald in te brengen en te verwijderen tijdens de I / R-procedure.
- Breng de spinale naald direct onder de rechter vitelline-slagader in met behulp van een micromanipulator.
OPMERKING: Plaats de spinale naald met uiterste voorzichtigheid om beschadiging van de RVA of aangrenzende slagaders te voorkomen. De optimale techniek is om de op maat ontworpen haak van de spinale naald precies boven de rechterkant van het RVA-gat aan te passen, gevolgd door het geleidelijk inbrengen van de op maat ontworpen rand van de spinale naald in de dooierzak met behulp van een micromanipulator onder begeleiding van een stereo zoom chirurgische microscoop door het rechtergat. Zodra de haak van de spinale naald zich in de dooierzak bevindt, past u de haak geleidelijk aan onder de RVA aan, zodat de rand precies onder het linkergat wordt geplaatst. Nu is het tijd om de spinale naald op te tillen. - Til nu, met behulp van de micromanipulator, geleidelijk de slagader op totdat de Doppler-bloedstroomflux een minimale afname van 80% in de arteriële stroom aangeeft.
- Zodra een daling van 80% of meer in dopplerflux is bereikt, laat u de spinale naald gedurende 5 minuten opgeheven (de slagader naar boven trekken). Dit wordt de periode van ischemie in de RVA.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de Doppler-flux te controleren tijdens de duur van ischemie. Als er een aanzienlijke hoeveelheid fluctuatie wordt gevonden, beëindigt u de tests. - Na de ischemieperiode van 5 minuten, laat de slagader geleidelijk los om de normale bloedstroomniveaus te herstellen. Zorg ervoor dat een Doppler-bloedstroommeter waarden weergeeft die vergelijkbaar zijn met die verkregen tijdens normoxie. Dit wordt de periode van reperfusie in de RVA (figuur 4).
- Breng na de I / R-procedure een paar druppels (2-3) van 1x PBS aan op het embryo en bekijk het gedurende 2-3 minuten.
OPMERKING: Het gebruik van 1x PBS helpt voorkomen dat het embryo uitdroogt. - Sluit ten slotte het raam opnieuw met plakband en plaats het ei gedurende 5 uur en 55 minuten terug in de eierincuse.
- Neem na 5 uur en 55 minuten het ei uit de eierincuse, plaats het op het eierrek, open het raam en volg het stroomafwaartse behandelingsprotocol.
5. Behandelingen
- Voor de behandeling van de slagaders met geneesmiddelen, activatoren of remmers, snijdt u de RVA na 1 uur van het I/R-proces weg.
- Voor de stroomafwaartse onderzoeken verwijdert u eerst het embryo uit de eierschaal door het op een steriele petrischaal van 90 mm te plaatsen.
- Zodra het embryo in de petrischaal is vrijgegeven, snijdt u de RVA weg met behulp van de oculaire iris onder begeleiding van een stereo zoom chirurgische microscoop.
- Zorg ervoor dat de excisiemaat van RVA maximaal 15 ± 1 mm (distaal van de stam), 5 ± 1 mm elk aan de linker- en rechterkant van de slagader en 2 ± 1 mm naar de stam.
OPMERKING: Een liniaal kan worden gebruikt om het te verwijderen gebied te meten (optioneel). - Na het uitpakken van de RVA, was het met 1x PBS in een steriel petrischaaltje met 1x PBS.
- Plaats voor de gewenste behandelingen de slagader in een centrifugebuis van 1,5 ml (gesteriliseerd) gevuld met 500 μL Ringer's oplossing. Plaats de RVA in de centrifugebuis en plaats deze gedurende 5 uur en 55 min in een incubator van 37 °C.
OPMERKING: Afhankelijk van de behandelingen, gebruik de Ringer's oplossing zonder enige behandeling, of behandeling met het gewenste volume en de gewenste concentratie van geneesmiddel, activator of remmer. - Haal na 5 uur en 55 min incubatie de RVA uit de laboratoriumincubator van 37 °C en ga verder met de gewenste behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Doppler Blood Flow Imaging-techniek werd gebruikt om de effectiviteit van ons model te evalueren. Kortom, we vergeleken de gegevens van de controlegroep met de gegevens van de RVA-groep om het succes van onze creatie te bepalen. Figuur 4A toont een typische flux geassocieerd met het controledier, terwijl figuur 4B de resultaten van een RVA weergeeft. Het numerieke 1-8 vertegenwoordigt de verschillende gebeurtenissen die verband houden met I/R-fasen. Kortom, numeriek 1-3 komt overeen met de fase van normoxie, terwijl een sterke afname van de flux op punten 3 en 4 de gebeurtenissen vertegenwoordigt die verband houden met de afname van de bloedstroom in de RVA. Zodra een daling van 80% of meer was bereikt, werd de RVA de volgende 5 minuten verhoogd. Dit was de fase van ischemie (numeriek 4-5). Na een opheffing van de RVA van 5 minuten werd de RVA vrijgegeven, die wordt weergegeven door het cijfer 6 en 7. De flux vanaf punt 7 vertegenwoordigt de reperfusiefase, die optreedt nadat de RVA normale bloedstroomniveaus heeft bereikt, wat de fase van reperfusie was. Dit specifieke experiment toonde de effectiviteit van I / R-modellering aan in het 3-daagse ontwikkelde kuikenembryo.
Om het nut van ons model te verifiëren, hebben we de expressiepatronen van eiwitten, RNA en DNA bestudeerd via ELISA, western blotting, qRT-PCR en gel-elektroforese-analyse. In het kort verdeelden we de 3-daagse ontwikkelde eieren in drie experimentele groepen: controle, I / R en Behandelingen + I / R. Een significant verschil in expressie van eiwitten, genen en DNA-integriteit werd waargenomen tussen hun respectievelijke I / R- en controlegroepen. Zoals hieronder besproken, verbeterde medicamenteuze behandeling voor de I/R-groep effectief de uitkomst die in deze groep werd waargenomen in vergelijking met de met I/R behandelde groep alleen; dit is in overeenstemming met onze eerdere publicatie waarop dit protocol is gebaseerd1. Standaard laboratoriumprocedures werden gevolgd voor ELISA18, western blotting19, qRT-PCR20 en gel-elektroforese21, die niet in dit artikel worden behandeld (figuur 5, figuur 6, figuur 7, figuur 8).
Ischemie-reperfusie stimuleert verschillende processen, waaronder de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS) die schadelijk zijn voor weefsel. De schadelijke effecten veroorzaakt door de reactie van de intrinsieke antioxidant lichaamsafweersystemen op ROS is een belangrijk kenmerk van I / R-letsel. We onderzochten de activiteiten van zuurstofregulerende eiwitten 150 (ORP150), cytoplasmatisch superoxide dismutase 1 (SOD1) en catalase in ischemische vaten. In vergelijking met de controlegroep verhoogde I/R de activiteit van ORP150, cytoplasmatische SOD1 en catalase (figuur 5A-C). Suppletie met N-Acetyl-L-Cysteïne (NAC), een ROS-quencher, verminderde echter de oxidatieve stress van de I / R-groep.
Om het ontstekingspotentieel van ons model te beoordelen, gebruikten we ELISA om IL-1β en TNF-α expressie te onderzoeken (figuur 6). Beide interleukines kwamen overexpressie in de I/R-groep in vergelijking met de controlegroep, wat aangeeft dat ons model het potentieel heeft om te worden gebruikt in inflammatoir onderzoek. Vervolgens testten we de expressie van het NOD-achtige receptorpyrinedomeinbevattende eiwit 3 (NLRP3) inflammasoom pathway22,23 en pro-inflammatoir molecuul, NF-kβ24,25, die betrokken zijn bij het versterken van ontstekingen, om het nut van dit model voor inflammatoire studies te bevestigen. In reactie op I/R gegenereerd in de RVA, vond dit onderzoek bewijs van activering van het NLRP3-inflammasoom (figuur 7A), evenals NF-kβ (figuur 7B). Behandeling met Naringenin, een bekend ontstekingsremmend medicijn, verbeterde echter de ontstekingseffecten, zoals waargenomen in de met geneesmiddelen behandelde groepen.
Ischemie-reperfusie activeert geprogrammeerde celdoodroutes26,27,28. We bestudeerden de effecten van I/R op apoptose en autofagieroutes in het kuikenembryo. Figuur 8A toont het effect van I/R op caspase-3 en zVAD-fmk. Figuur 8B-D toont aan dat de I/R-groep een hogere expressie van LC3II en LC3II/I-ratio (autofagosomenmarker), Beclin1 (een significante regulator van autofagie in zoogdiercellen) en Atg7 (nodig voor basale autofagie) had dan de controlegroep, respectievelijk op eiwitniveaus. Figuur 8E toont daarentegen het effect van de I/R op mRNA-niveaus. De toevoeging van 3-MA, een autofagieremmer, draaide de resultaten echter om. Deze bevindingen suggereren dat het model kan worden gebruikt om verschillende celdoodprocessen te onderzoeken (bijvoorbeeld necroptose). Figuur 9 laat zien hoe efficiënt de veranderingen op DNA-niveau bestudeerd kunnen worden met behulp van ons Hook-I/R model.
Ten slotte vergelijken we de resultaten van het Hook-I/R-model en het middle cerebral artery occlusion (MCAO) model om te zien hoe effectief ons model is in vergelijking met andere modellen. Samenvattend hadden I/R-behandelde RVAs hogere niveaus van het apoptotische eiwit gekloofde caspase-3, de autofagie-eiwitten Beclin1 en Atg7, en de inflammatoire interleukines TNF-α en IFN-Ƴ dan controle-RVAs. Interessant is dat het Hook-I / R-model, of het nu gaat om het analyseren van ontstekingsstress of cellulaire doodsroutes, resultaten produceerde die extreem vergelijkbaar waren met die verkregen door het MCAO-model (figuur 10).
Figuur 1: Een schematisch diagram van een typische opstelling van het Hook-I/R kuikenembryo ischemie-reperfusiemodel. De foto toont de Hook-I / R kuiken embryo ischemie-reperfusie experimenten vereisten, zoals de stereo zoom chirurgische microscoop, laser Doppler bloed flowmeter, micromanipulator, spinale naald, 72 h ontwikkelde kuiken embryo's, en een verlichtingsbron. " Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief beeld van een 3-daagse kuikenembryo-vertonende plaats van occlusie en gebied van weefselexcisie. (A) De driehoek toont de locatie van excisie van het weefsel voor western blotting, RNA en DNA-isolatie. De ster en stippen vertegenwoordigen de plaats van de occlusie en de gaten die aan de linker- en rechterkant van de RVA zijn gemaakt om de naald onder de slagader in te brengen om deze op te tillen. Een vergroot beeld van het gebied van weefselextractie wordt ook meegeleverd. De notatie A vertegenwoordigt het oog, B vertegenwoordigt het hart, C vertegenwoordigt de linkerkant van de vitelline-slagader en C' vertegenwoordigt de rechterkant van de vitelline-slagader. (B) Een schematische weergave van de rechterkant van het kuikenembryo toont het gebied van weefselexcisie in de buurt van rva. De rechte lijn stelt de RVA voor die uit de embryostam komt. De ster op de verticale lijn symboliseert de positie van de Laser Doppler bloedstroomsonde. De kruising duidt de plaats van occlusie aan. Excisie van de slagaders werd gedaan tot 15 ± 1 mm (distale van de romp), 5 ± 1 mm elk aan de linker- en rechterkant van de slagader en 2 ± 1 mm naar de romp. Alle metingen tonen afstanden tot de plaats van occlusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve foto van een spinale naald met een op maat gemaakte haak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Weergave van een typisch Laser Doppler bloedstroommeter signaal. Een typisch Laser Doppler-bloedstroommetersignaal werd gemeten op een 3-daagse kuikenembryoslagader van een controlegroepei (A). Voorvallen bij baseline (1), tijdens normoxie (2), onmiddellijke pre-lifting van RVA (3), onmiddellijk na opheffing van RVA (4), tijdens ischemie (5), onmiddellijke pre-release van RVA (6), onmiddellijke post-reperfusie (7), tijdens reperfusie (8) in de met ischemie behandelde groep zoals geregistreerd door de Laser Doppler bloedstroommeter (B). Dit cijfer is overgenomen van Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; onder een CC-BY-licentie)1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effect van ischemie-reperfusie op de expressie van oxidatieve stressmarkereiwitten. Western blotting werd gebruikt om de ORP150-, SOD1- en catalase-expressieniveaus te bepalen. (A) ORP150-expressie was verhoogd na I/R-schade. NAC, een pan-ROS-remmer, verlaagde ORP150 tot een niveau dat vergelijkbaar is met dat van controle. (B) Na I/R was de SOD1-expressie verhoogd. De SOD1-expressie was eveneens afgenomen na behandeling met NAC. (C) De I/R-gebeurtenis veroorzaakte de expressie van catalase. RVA behandeld met I/R en blootgesteld aan NAC vertoonde een afname van de catalasespiegels. GAPDH (A,C) en β-Actin (B) werden gebruikt als interne controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Schatting van IL-1β en TNF-α met behulp van ELISA. ELISA werd gebruikt om IL-1β en TNF-α te kwantificeren, en de resultaten toonden aan dat er een toename was in IL-1β en TNF-α expressie, die werd verzacht door de toevoeging van Naringenin. Voor deze studie werd de ANOVA gevolgd door de Newman-Keuls test toegepast. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Effect van ischemie-reperfusie op de expressie van ontstekingsmarkereiwitten. (A) I/R-behandeling resulteerde in een verhoogde expressie van NLRP3. Incubatie van met I/R behandelde RVA met Naringenine verminderde de expressie van NLRP3. (B) Net als bij NLRP3 was de expressie van NF-kβ ook verhoogd na I/R-behandeling. De behandeling van Naringenine verminderde de expressie van NF-kβ. GAPDH werd gebruikt als interne controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Effect van ischemie-reperfusie op de apoptotische en autofagische status van RVA-cellen. (A) Om de inductie van apoptose door het I/R-proces te onderzoeken, werd de expressie van gekloofde caspase 3 geëvalueerd met behulp van western blotting. Na I/R-schade werd het niveau van gekloofde caspase 3 verhoogd. Behandeling met zVAD-fmk, een apoptoseremmer, verminderde echter de gekloofde caspase 3-expressie. (B-D) Om de inductie van autofagie na I/R te evalueren, werd de expressie van LC3II/I, Beclin1 en Atg7 bepaald. Na I/R nam de expressie van alle autofagische markers toe, terwijl de blootstelling van met I/R behandelde RVA aan de autofagieremmer 3-MA de expressie van alle eiwitten verminderde om de niveaus te beheersen. Als interne controle werd GAPDH gebruikt. (E) qRT-PCR werd gebruikt om de inductie van autofagie te bevestigen en de Ambra1- en Atg7-mRNA-expressieniveaus te bepalen. Beide genen vertoonden een aanzienlijke toename in expressie in de I/R-groep in vergelijking met controle, die na NAC-therapie werd hersteld tot bijna normale niveaus. GAPDH werd gebruikt als interne controle voor qRT-PCR experimenten. Voor experiment (E) werd de ANOVA, gevolgd door de Newman-Keuls test, toegepast. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Effect van ischemie-reperfusie op DNA-schade. Om te bepalen of I/R DNA-inkepingen induceert, onderzochten we DNA-schade met behulp van gel-elektroforese. I/R resulteerde in genomische DNA-degradatie, zoals blijkt uit uitsmeren in het I/R-monster. NAC-therapie van I/R-beschadigde RVA verminderde DNA-schade. Er werd gebruik gemaakt van een DNA-ladder van 1 kb. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Vergelijking van het Hook-I/R model met het MCAO model. Er is een vergelijking gemaakt tussen de data gegenereerd door het Hook-I/R model en de data gegenereerd door het MCAO model. (A) De expressie van het apoptotische eiwit caspase-3 en de autofagie-eiwitten Beclin1 en Atg7 was hoger in met I/R behandelde RVAs in vergelijking met de expressie van dezelfde eiwitten in controle-RVAs, wat in overeenstemming was met de bevindingen verkregen in de MCAO-experimenten. (B) TNF-α en IFN-Ƴ niveaus bleken verhoogd te zijn in zowel de RVA- als mcao-groepen in vergelijking met hun respectieve controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van het materiaal/de apparatuur | Concentratie | Autoclaaf | Opslag | ||
| Reagentia voor ringer's oplossing | |||||
| Tafelzout | 123m | ||||
| Kaliumchloride | 4,96 mM | ||||
| Calciumchloride | 1,53 mM | ||||
| Steriel gedestilleerd water | 100 ml | ||||
| Ph | 7.4 | 15 min bij 121 °C | R.T. | ||
| Reagentia voor 0,9% normale zoutoplossing | |||||
| Tafelzout | 154m | ||||
| Steriel gedestilleerd water | 100 ml | ||||
| Ph | 7.4 | 15 min bij 121 °C | R.T. | ||
| Reagentia voor 70% ethanol | |||||
| 70% ethanol | 70 ml | ||||
| Steriel gedestilleerd water | 30 ml | Niet verplicht | R.T. | ||
| Reagentia voor 1x fosfaatbufferzoutoplossing | |||||
| Tafelzout | 136,8 mM | ||||
| Kaliumchloride | 26,8 mM | ||||
| Kaliumfosfaat monobasisch watervrij | 14,6 mM | ||||
| di-Natrium waterstoffosfaat heptahydraat | 5,37 mM | ||||
| Steriel gedestilleerd water | 100 ml | 15 min bij 121 °C | R.T. | ||
Tabel 1: Recept van oplossingen die in deze studie zijn gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van ischemie-reperfusieonderzoek is om therapeutische strategieën te creëren die celdood voorkomen en herstel bevorderen29,30. Om de huidige beperkingen in I/R-onderzoek te overwinnen, hebben we een Hook I/R-kuikenembryomodel ontworpen om een betrouwbaar en reproduceerbaar I/R-model te produceren. Voor zover wij weten, is het onze het eerste I / R-model ooit gemaakt in een 3-daags kuikenembryo voor routinematige I / R-experimenten, naast het bestuderen van stresssignalen (bijv. Oxidatieve en inflammatoire stress). Gezien de voordelen van grootte en toegankelijkheid op dag 3 van ontwikkeling31, werd het kuikenembryo gebruikt in een ontwikkelingsstadium van 72 uur, vanwege de hoge output van het model, de eenvoud om te gebruiken en het aanpassingsvermogen voor routinematige analyse32. Kortom, op ontwikkelingsdag 3 is het in ovo-kuiken een zeer gecontroleerd, maar toch toegankelijk en redelijk transparant model in het ei dat kan worden gebruikt om normale fysiologie, ziektepathologie en de effecten van experimentele behandeling te visualiseren. De enorme omvang maakt het bijzonder nuttig voor het bestuderen van de vorming en het gedrag van het embryo tijdens normale fysiologie en stress33. Hoewel oudere kuikenembryo's (die 4 dagen of langer worden geïncubeerd) kunnen worden gebruikt, en we hebben het een later tijdstip geprobeerd, wordt het gebruik van oudere embryo's als modelsystemen ernstig beperkt door het feit dat de dooierzak zo dik wordt na 3 dagen ontwikkeling dat chirurgische procedures moeilijk zijn. Het is opmerkelijk om te vermelden dat hoewel de RVA niet volledig is gevormd op een vroeg tijdstip (bijvoorbeeld op dag 1 of 2), venstering kan leiden tot teratogeniciteit34. Naast de beperkingen die gepaard gaan met een vroeg of laat tijdstip van ontwikkeling, dient een 72-uurskuikenembryo als een ideaal model om het I / R-proces te onderzoeken, omdat 3-daagse kuikenembryo's een goed gedefinieerde bloedsomloop hebben30.
Het begrijpen van de pathofysiologie van I/R letsel is een belangrijk doel van het ontwerpen van een I/R-model. Momenteel is er geen klinisch bruikbare therapie voor het verminderen van ischemie-reperfusieschade1,35. Als gevolg hiervan is een breed scala aan in vitro en in vivo-modellen voorgesteld. In deze context werd voor het eerst I/R-modellering in een 3-daags ontwikkelend kuikenembryo in ovo voorgesteld. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat occlusie-reperfusie van arteriële bloedstroom pathologische veranderingen veroorzaakt in experimentele modellen die vergelijkbaar zijn met die bij mensen36,37,38, dus we waren hoopvol dat ons model hetzelfde zou doen (dergelijke oxidatieve en inflammatoire stress waargenomen in in vivo modellen of bij patiënten). Met de bevindingen van onze studie bleek bovenstaande hypothese juist te zijn.
De circulatie van bloed van embryo's naar de dooierzak wordt gecontroleerd door vitellinevaten in kuikenembryo's39. Embryo's krijgen voedingsstoffen uit de dooier en diffuse zuurstof uit de lucht via vitelline-circulatie; dus het beperken van een van de vitelline-vaten die de voeding en zuurstofoverdracht kunnen verstoren. Op basis van deze feiten werd ischemie geïnduceerd door de bloedtoevoer naar de RVA gedurende 5 minuten af te sluiten, gevolgd door reperfusie gedurende nog eens 5 uur en 55 minuten. Het voorgestelde model kan worden gebruikt om een reeks verschillende ziekteprocessen in verband met I / R te onderzoeken en een verscheidenheid aan geneesmiddelen en hun doelen te testen. Het huidige model kan worden gebruikt om veranderingen in DNA, RNA en eiwitten te onderzoeken. Het heeft het potentieel om een hoge output te geven. Naast de eenvoud en het aanpassingsvermogen voor regelmatige analyse, kan het model ook kortdurende stamcel homing onderzoeken, die in toekomstige studies zal worden onderzocht.
In vergelijking met in vitro modellen is ons model eenvoudig te gebruiken, kosteneffectief en groeit het snel, maar ook ethisch onschuldig32. De aanwezigheid van microvasculatuur, het immuunsysteem en fysiologische beoordelingen zijn allemaal voordelen ten opzichte van in vitro modellen, terwijl lage kosten, tijdseffectiviteit en geen ethische problemen voordelen zijn ten opzichte van in vivo modellen40. Bovenstaande voordelen geven aan dat ons model een vergelijkbaar effect heeft als de andere I/R modellen die momenteel in gebruik zijn (figuur 10). Een mogelijke tekortkoming is het onvermogen van het huidige model om het infarctgebied te kwantificeren. Directe infarctbeoordeling kan een waardevolle biomarker zijn voor I / R-gemedieerde schade en een methode om de effecten van verschillende therapiemedicijnen in kaart te brengen. We probeerden dus het infarctgebied te kwantificeren, maar konden dit niet doen vanwege de delicate structuur van de 72 uur ontwikkelde kuikens. Daarom is aanvullend onderzoek nodig om de strategieën en paden voor I/R-processen uitgebreid te beoordelen.
Samenvattend kan het huidige model worden gebruikt om verschillende ziekteroutes te onderzoeken die verband houden met I / R en een verscheidenheid aan geneesmiddelen en hun doelen te screenen. Vanwege de hoge reproduceerbaarheid, kosteneffectiviteit en eenvoud verwachten we dat ons model een waardevolle bron zal zijn voor fundamenteel wetenschappelijk en translationeel onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We willen onze dankbaarheid uitspreken aan Hari Shankar voor zijn kritische input tijdens videografie en montage, de heer Baqer Hussain voor voice-over, de heer Asghar Rizvi voor videobewerking, de heer Mohammad Haider voor video-opnamen, de heer Mohammad Danish Siddiqui voor hulp tijdens de experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
