Summary
Questo documento descrive la modellazione ischemia-riperfusione (I / R) in un embrione di pulcino di 3 giorni utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale per comprendere meglio lo sviluppo e il trattamento I / R. Questo modello è semplice, veloce e poco costoso.
Abstract
I disturbi da ischemia e riperfusione (I / R), come infarto miocardico, ictus e malattia vascolare periferica, sono alcune delle principali cause di malattia e morte. Molti modelli in vitro e in vivo sono attualmente disponibili per lo studio del meccanismo I/R in malattie o tessuti danneggiati. Tuttavia, ad oggi, non è stato riportato alcun modello I/R in ovo, il che consentirebbe una migliore comprensione dei meccanismi I/R e uno screening farmacologico più rapido. Questo documento descrive la modellazione I / R utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale in un embrione di pulcino di 3 giorni per comprendere i meccanismi di sviluppo e trattamento I / R. Il nostro modello può essere utilizzato per studiare le anomalie a livello di DNA, RNA e proteine. Questo metodo è semplice, veloce e poco costoso. Il modello attuale può essere utilizzato indipendentemente o in combinazione con modelli I/R esistenti in vitro e in vivo.
Introduction
La lesione tissutale da ischemia-riperfusione è stata collegata a una serie di patologie, tra cui infarti, ictus ischemico, traumi e malattie vascolari periferiche1,2,3,4,5. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di una comprensione completa della progressione della malattia e alla mancanza di un modello di ricerca efficace. La lesione ischemica si verifica quando l'afflusso di sangue a un'area specifica del tessuto viene interrotto. Di conseguenza, il tessuto ischemico alla fine necrotizza, anche se il tasso varia a seconda del tessuto. Quindi, ripristinare l'afflusso di sangue può aiutare a mitigare il danno. Tuttavia, è stato osservato, in alcuni casi, che la riperfusione provoca più danni ai tessuti rispetto all'ischemia da sola6,7,8. Pertanto, è necessaria la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari dell'ischemia-riperfusione per sviluppare un intervento terapeutico efficace. Attualmente, non è noto alcun trattamento efficace per le lesioni I / R. Questa disparità ha spinto la creazione di nuovi modelli sperimentali, che vanno dai modelli in vitro a quelli in vivo, per affrontare il problema esistente9,10,11,12,13.
Gli embrioni di pulcino (Gallus gallus domesticus) sono ampiamente utilizzati nella ricerca a causa della loro facilità di accesso, accettabilità etica, dimensioni relativamente grandi (rispetto ad altri embrioni), basso costo e rapida crescita14. Abbiamo usato un embrione di pulcino a 72 ore di sviluppo per creare un in ovo I / R occludendo e rilasciando l'arteria vitellina destra con l'assistenza di un ago spinale. L'abbiamo chiamato hook-I/R ischemia-riperfusione modello (Figura 1). Il modello utilizzato in questo studio è in grado di simulare accuratamente tutti i processi a valle, comprese le vie ossidative e infiammatorie, che sono frequentemente associate al danno I/R15,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L'Institutional Animal Ethical Committee presso il Lucknow Medical College and Hospital di Era ha emesso una rinuncia scritta affermando che non era richiesta alcuna approvazione formale per condurre questi esperimenti in conformità con il Comitato per lo scopo del controllo e della supervisione degli esperimenti sugli animali (CPCSEA). Tuttavia, sono state seguite procedure operative standard per ridurre al minimo qualsiasi potenziale di sofferenza embrionale.
1. Preparazione del tampone (tabella 1)
- Preparare la soluzione di Ringer
- Per preparare la soluzione di Ringer, sciogliere 0,72 g di NaCl (123 mM), 0,017 g di CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g di KCl (4,96 mM) in 70 mL di H2O distillato sterile, con un volume finale di 100 mL. Regolare il pH a 7,4. Lasciare sciogliere completamente e autoclave. Quindi, filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm, aliquotare in quantità monouso (circa 10 ml) e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la normale soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio, NaCl).
- In 70 mL di H2O distillato sterile, sciogliere 0,9 g di NaCl (154 mM). Portare il volume a 100 ml. Autoclave per 15 min a 121 °C. Regolare il pH a 7,4 con 0,1 N HCl o 0,1 N NaOH, se necessario. Produrre aliquote da 10 ml in un tubo di centrifuga sterile da 15 ml e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare il 70% di etanolo (v/v).
- Miscelare 70 mL di etanolo puro (Mol. wt. 46,07 g/L) a 30 mL di H2O sterile. Preparare secondo necessità o conservare a temperatura ambiente. Non c'è bisogno di sterilizzare.
- Preparare 1x tampone fosfato salino (1x PBS).
- Preparare 100 mL di 1x PBS aggiungendo 0,144 g di Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g di NaCl (136,8 mM), 0,2 g di KCl (26,8 mM), 0,2 g di KH2PO4 (14, 6 mM) a 70 ml di acqua distillata. Sciogliere e portare il volume a 100 ml e autoclave per 15 minuti a 121 °C. Portare il pH a 7,4, aggiungendo un paio di gocce di 0,1 N HCl o 0,1 N NaOH, se necessario. Effettuare aliquote di 10 mL in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL e conservare a temperatura ambiente.
2. Giorno 1
- Disporre tutti gli strumenti necessari per la sterilizzazione delle uova (etanolo al 70%, salviette per la pulizia, un portauova e un pennarello OHP).
- Pulire le uova di 0 giorni con il 70% di etanolo usando salviette di carta velina. Utilizzare solo un uovo di 0 giorni, poiché le uova più vecchie potrebbero non dare origine a un embrione.
- Scrivi la data corrente sulle uova con un marcatore OHP.
- Mettere le uova in un'incubatrice impostata su una temperatura di 36-37 °C e un livello di umidità del 60%-65%. Incubare le uova per le prossime 24 ore.
3. Giorno 2
- Disporre l'attrezzatura necessaria per il ritiro di 5-6 ml di albumina (forbici taglienti, siringa da 5 ml, ago da 18 G, scartatore di siringhe e nastro adesivo).
- Pulire le forbici chirurgiche con etanolo al 70% o sterilizzare con un'autoclave dopo averle pulite con etanolo al 70%.
- Ora prendi l'uovo dall'incubatrice a 37 °C per la stratificazione.
- Metti l'uovo su un portaoggetti pulito.
- Attaccare un piccolo pezzo di nastro adesivo (dimensioni: circa 1 pollice di lunghezza x larghezza) al bordo dell'uovo.
- Fai un piccolo foro nel bordo del guscio d'uovo usando forbici a punta affilata. Inserire una siringa da 5 mL con un angolo approssimativo di 75°.
NOTA: La siringa da 5 ml viene fornita con un ago da 24 G x 1 (sterile), ma è bene sostituire l'ago da 24 G x 1 con un ago da 18 G x 1,5 (sterile). L'ago da 18 G x 1,5 ha una larghezza di 1,25 x 38 mm. Pertanto, faciliterà la rimozione dell'albumina. - Dopo aver inserito l'ago nel sacco vitellino, prelevare lentamente 5-6 ml di albumina.
NOTA: Questo fornisce all'embrione un letto su cui può crescere. Il ritiro dell'albumina previene la fuoriuscita eccessiva di albumina mentre si stabilisce una finestra. Infine, il rischio che l'embrione venga danneggiato durante la finestra è mitigato eliminando 5-6 ml di albumina. - Dopo aver rimosso l'albumina, richiudere l'apertura con del nastro adesivo e lasciare incubare le uova a 37 °C per 48 ore.
4. Giorno 4
- Preparare la soluzione di Ringer, soluzione salina normale allo 0,9% e 1 PBS come descritto nella sezione 1 del protocollo. Quindi, autoclave le tre soluzioni. Dopo l'autoclave, posizionare la rispettiva soluzione a temperatura ambiente.
- Estrarre l'uovo dall'incubatrice a 37 °C e tagliare il guscio a forma circolare. Prima di tagliare il guscio d'uovo, coprire l'area da tagliare con del nastro adesivo.
NOTA: Coprire l'area della finestra con nastro adesivo impedisce la rottura del guscio d'uovo in luoghi indesiderati. Tuttavia, se si rompe in un luogo indesiderato, sigillare l'area con il nastro adesivo. Coprire i punti da tagliare con nastro adesivo impedisce ai pezzi di guscio di cadere sul sacco vitellino. - Creare un piccolo foro nel guscio d'uovo con una forbice a spigolo appuntito nel punto in cui si desidera la finestra e iniziare a tagliare un'apertura circolare. Questo processo è noto come windowing.
NOTA: Assicurarsi che il taglio circolare sia abbastanza grande da consentire un facile accesso all'embrione da qualsiasi direzione. Se necessario, modificare la posizione dell'uovo per adattarsi alla posizione dell'embrione. - Successivamente, utilizzando un microscopio chirurgico con zoom stereo, individuare l'arteria vitellina destra (RVA).
NOTA: Gli embrioni di pollo normalmente subiscono una torsione toracica (insieme alla flessione cervicale, ecc.) mentre si sviluppano, in modo tale che il lato sinistro della testa sia contro il tuorlo nella fase di 72 ore. Più caudale, dove le arterie vitelline escono dal corpo, l'embrione non è molto contorto, e questa parte del corpo si trova lato ventrale verso il basso verso il tuorlo. Quindi, visualizzando direttamente, il diritto dell'embrione è a destra del ricercatore. - Una volta individuato l'RVA, creare due piccoli fori sui lati sinistro e destro dell'RVA utilizzando un ago da 26 G (Figura 2).
- Posizionare la sonda doppler per l'imaging del flusso sanguigno sopra l'RVA. Assicurarsi che la sonda doppler per l'imaging del flusso sanguigno sia posizionata a 5 ± 1 mm dal sito di ischemia e verso l'estremità distale dell'RVA. Prendi una lettura del flusso per 2 minuti e 30 s (o più a lungo se lo desideri). Questa sarà la lettura della fase normossica.
- Nel frattempo, utilizzando una pinza per il naso e una pinza dentata, modellare manualmente il bordo dell'ago spinale a forma di gancio (Figura 3). Fallo piegando il bordo dell'ago spinale per circa 1 mm. Una dimensione maggiore renderà più difficile l'inserimento e la rimozione dell'ago spinale durante la procedura I / R.
- Inserire l'ago spinale direttamente sotto l'arteria vitellina destra utilizzando un micromanipolatore.
NOTA: Inserire l'ago spinale con estrema cautela per evitare di danneggiare l'RVA o le arterie adiacenti. La tecnica ottimale è quella di regolare il gancio personalizzato dell'ago spinale esattamente sopra il lato destro del foro RVA, seguito dall'inserimento graduale del bordo personalizzato dell'ago spinale nel sacco vitellino con l'assistenza di un micromanipolatore sotto la guida di un microscopio chirurgico stereo zoom attraverso il foro destro. Una volta che il gancio dell'ago spinale è nel sacco vitellino, regolare gradualmente il gancio sotto l'RVA in modo che il suo bordo sia esattamente posizionato sotto il foro sinistro. Ora è il momento di sollevare l'ago spinale. - Ora, con l'assistenza del micromanipolatore, sollevare gradualmente l'arteria fino a quando il flusso sanguigno Doppler indica una diminuzione minima dell'80% del flusso arterioso.
- Una volta raggiunto un dropdown dell'80% o più nel flusso Doppler, lasciare l'ago spinale sollevato (tirando l'arteria verso l'alto) per 5 minuti. Questo sarà il periodo di ischemia nella RVA.
NOTA: è fondamentale monitorare il flusso Doppler durante la durata dell'ischemia. Se viene rilevata una quantità significativa di fluttuazione, terminare i test. - Dopo il periodo di ischemia di 5 minuti, rilasciare gradualmente l'arteria per ripristinare i normali livelli di flusso sanguigno. Assicurarsi che la lettura di un misuratore di portata sanguigna Doppler visualizzi valori paragonabili a quelli ottenuti durante la normossia. Questo sarà il periodo di riperfusione nell'RVA (Figura 4).
- Dopo la procedura I/R, applicare alcune gocce (2-3) di 1x PBS all'embrione e guardarlo per 2-3 min.
NOTA: L'uso di 1x PBS aiuta a prevenire l'essiccazione dell'embrione. - Infine, richiudere la finestra con del nastro adesivo e rimettere l'uovo nell'incubatrice per 5 ore e 55 minuti.
- Dopo 5 ore e 55 minuti, prendere l'uovo dall'incubatrice, posizionarlo sul portauova, riaprire la finestra e seguire il protocollo di trattamento a valle.
5. Trattamenti
- Per il trattamento delle arterie con farmaci, attivatori o inibitori, asportare l'RVA dopo 1 ora del processo I / R.
- Per gli studi a valle, rimuovere prima l'embrione dal guscio d'uovo ponendolo su una capsula di Petri sterile da 90 mm.
- Una volta che l'embrione viene rilasciato nella capsula di Petri, asportare l'RVA usando l'iride oculare sotto la guida di un microscopio chirurgico stereo zoom.
- Assicurarsi che la dimensione di escissione di RVA sia fino a 15 ± 1 mm (distale dal tronco), 5 ± 1 mm ciascuna sul lato sinistro e destro dell'arteria e 2 ± 1 mm verso il tronco.
NOTA: un righello può essere utilizzato per misurare l'area da asportare (opzionale). - Dopo aver asportato l'RVA, lavarlo con 1x PBS in una capsula di Petri sterile contenente 1x PBS.
- Per i trattamenti desiderati, posizionare l'arteria in un tubo centrifugo da 1,5 mL (sterilizzato) riempito con 500 μL di soluzione di Ringer. Posizionare l'RVA nel tubo della centrifuga e posizionarlo in un incubatore a 37 °C per 5 ore e 55 minuti.
NOTA: A seconda dei trattamenti, utilizzare la soluzione di Ringer senza alcun trattamento o il trattamento con il volume e la concentrazione desiderati di farmaco, attivatore o inibitore. - Dopo 5 ore e 55 minuti di incubazione, estrarre l'RVA dall'incubatore di laboratorio a 37 °C e procedere con i trattamenti desiderati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La tecnica Doppler Blood Flow Imaging è stata utilizzata per valutare l'efficacia del nostro modello. In breve, abbiamo confrontato i dati del gruppo di controllo con i dati del gruppo RVA per determinare il successo della nostra creazione. La Figura 4A raffigura un flusso tipico associato all'animale di controllo, mentre la Figura 4B illustra i risultati ottenuti da un RVA. Il numero 1-8 rappresenta i vari eventi associati alle fasi I/R. In breve, il numero 1-3 corrisponde alla fase della normossia, mentre un forte calo del flusso ai punti 3 e 4 rappresenta gli eventi associati alla diminuzione del flusso sanguigno nell'RVA. Una volta raggiunto un drop-down dell'80% o superiore, l'RVA è stato lasciato sollevato per i successivi 5 minuti. Questa era la fase dell'ischemia (numerico 4-5). Dopo un sollevamento di 5 minuti dell'RVA, è stato rilasciato l'RVA, che è rappresentato dai numeri 6 e 7. Il flusso dal punto 7 in poi rappresenta la fase di riperfusione, che si verifica dopo che l'RVA ha raggiunto livelli normali di flusso sanguigno, che era la fase di riperfusione. Questo particolare esperimento ha dimostrato l'efficacia della modellazione I / R nell'embrione di pulcino sviluppato a 3 giorni.
Per verificare l'utilità del nostro modello, abbiamo studiato i modelli di espressione di proteine, RNA e DNA attraverso ELISA, western blotting, qRT-PCR e analisi di elettroforesi su gel. In breve, abbiamo diviso le uova sviluppate a 3 giorni in tre gruppi sperimentali: controllo, I / R e Trattamenti + I / R. È stata osservata una differenza significativa nell'espressione di proteine, geni e integrità del DNA tra i rispettivi gruppi I/R e di controllo. Come discusso di seguito, il trattamento farmacologico per il gruppo I / R ha effettivamente migliorato l'esito osservato in questo gruppo rispetto al solo gruppo trattato I / R; ciò è coerente con la nostra precedente pubblicazione su cui si basa questo protocollo1. Sono state seguite procedure di laboratorio standard per ELISA18, western blotting19, qRT-PCR20 ed elettroforesi su gel21, che non sono trattate in questo documento (Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8).
Ischemia-riperfusione stimola diversi processi, tra cui la formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono dannose per i tessuti. Gli effetti dannosi causati dalla risposta intrinseca dei sistemi di difesa del corpo antiossidante ai ROS sono una caratteristica importante della lesione I / R. Abbiamo esaminato le attività delle proteine regolatrici dell'ossigeno 150 (ORP150), della superossido dismutasi 1 citoplasmatica (SOD1) e della catalasi nei vasi ischemici. Rispetto al gruppo di controllo, I/R ha elevato l'attività di ORP150, SOD1 citoplasmatica e catalasi (Figura 5A-C). Tuttavia, l'integrazione con N-acetil-L-cisteina (NAC), un quencher ROS, ha mitigato lo stress ossidativo del gruppo I / R.
Per valutare il potenziale infiammatorio del nostro modello, abbiamo usato ELISA per esaminare l'espressione di IL-1β e TNF-α (Figura 6). Entrambe le interleuchine sono state sovraespresse nel gruppo I/R rispetto al gruppo di controllo, indicando che il nostro modello ha il potenziale per essere utilizzato nelle indagini infiammatorie. Successivamente, abbiamo testato l'espressione della proteina 3 contenente il dominio della pirina simile al NOD (NLRP3) inflammasoma pathway22,23 e della molecola pro-infiammatoria, NF-kβ24,25, che sono coinvolti nell'amplificazione dell'infiammazione, per confermare l'utilità di questo modello per studi infiammatori. In risposta all'I/R generato nell'RVA, questa indagine ha trovato prove di attivazione dell'inflammasoma NLRP3 (Figura 7A) e di NF-kβ (Figura 7B). Tuttavia, il trattamento con Naringenin, un noto farmaco antinfiammatorio, ha migliorato gli effetti infiammatori, come osservato nei gruppi trattati con farmaci.
L'ischemia-riperfusione attiva le vie programmate di morte cellulare26,27,28. Abbiamo studiato gli effetti di I/R sull'apoptosi e sulle vie di autofagia nell'embrione di pulcino. La Figura 8A illustra l'effetto di I/R sulla caspasi-3 e zVAD-fmk. La Figura 8B-D dimostra che il gruppo I/R aveva una maggiore espressione di LC3II e del rapporto LC3II/I (marcatore degli autofagosomi), Beclin1 (un regolatore significativo dell'autofagia nelle cellule di mammifero) e Atg7 (necessario per l'autofagia basale) rispetto al gruppo di controllo, rispettivamente, a livelli proteici. Al contrario, la Figura 8E mostra l'effetto dell'I/R sui livelli di mRNA. L'aggiunta di 3-MA, un inibitore dell'autofagia, tuttavia, ha invertito i risultati. Questi risultati suggeriscono che il modello potrebbe essere utilizzato per studiare diversi processi di morte cellulare (ad esempio, necroptosi). La Figura 9 mostra l'efficienza con cui i cambiamenti a livello di DNA possono essere studiati utilizzando il nostro modello Hook-I/R.
Infine, confrontiamo i risultati del modello Hook-I / R e del modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) per vedere quanto sia efficace il nostro modello rispetto ad altri modelli. Per riassumere, gli RVA trattati con I / R avevano livelli più elevati della proteina apoptotica scissa caspasi-3, delle proteine autofagiche Beclin1 e Atg7 e delle interleuchine infiammatorie TNF-α e IFN-Ƴ rispetto ai VA di controllo. È interessante notare che, sia che si analizzasse lo stress infiammatorio o le vie di morte cellulare, il modello Hook-I / R ha prodotto risultati estremamente simili a quelli ottenuti dal modello MCAO (Figura 10).
Figura 1: Un diagramma schematico di un tipico set-up del modello di ischemia-riperfusione dell'embrione di pulcino Hook-I/R. L'immagine mostra i requisiti di sperimentazione dell'ischemia-riperfusione dell'embrione di pulcino Hook-I / R, come il microscopio chirurgico con zoom stereo, il flussometro sanguigno laser Doppler, il micromanipolatore, l'ago spinale, gli embrioni di pulcino sviluppati per 72 ore e una fonte di illuminazione. " Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine rappresentativa di un sito di occlusione e area di escissione tissutale di 3 giorni che mostra embrioni di pulcino. (A) Il triangolo mostra la posizione di escissione del tessuto per il western blotting, l'RNA e l'isolamento del DNA. La stella e i punti rappresentano il sito dell'occlusione e i fori creati sul lato sinistro e destro dell'RVA per inserire l'ago sotto l'arteria per sollevarlo, rispettivamente. Viene fornita anche un'immagine ingrandita dell'area di estrazione del tessuto. La notazione A rappresenta l'occhio, B rappresenta il cuore, C rappresenta la sinistra dell'arteria vitellina e C' rappresenta la destra dell'arteria vitellina. (B) Una rappresentazione schematica del lato destro dell'embrione di pulcino mostra l'area di escissione tissutale in prossimità di RVA. La linea retta rappresenta l'RVA che emerge dal tronco embrionale. La stella sulla linea verticale simboleggia la posizione della sonda laser doppler del flusso sanguigno. L'intersezione denota il sito di occlusione. L'escissione delle arterie è stata effettuata fino a 15 ± 1 mm (distale dal tronco), 5 ± 1 mm ciascuna sul lato sinistro e destro dell'arteria e 2 ± 1 mm verso il tronco. Tutte le misurazioni mostrano distanze dal sito di occlusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagine rappresentativa di un ago spinale con un gancio su misura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione di un tipico segnale del flussometro sanguigno Laser Doppler. Un tipico segnale del flussometro sanguigno Laser Doppler è stato misurato su un'arteria embrionale di pulcino di 3 giorni da un uovo del gruppo di controllo (A). Eventi al basale (1), durante normossia (2), immediato pre-lifting di RVA (3), immediato post-lifting di RVA (4), durante ischemia (5), immediato pre-rilascio di RVA (6), immediato post-riperfusione (7), durante la riperfusione (8) nel gruppo trattato con ischemia come registrato dal misuratore di sangue Laser Doppler (B). Questa cifra è stata adottata da Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; sotto licenza CC-BY)1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetto dell'ischemia-riperfusione sull'espressione delle proteine marker dello stress ossidativo. Il western blotting è stato utilizzato per determinare i livelli di espressione di ORP150, SOD1 e catalasi. (A) L'espressione di ORP150 è aumentata dopo un danno I/R. NAC, un inibitore pan-ROS, ha abbassato ORP150 a un livello paragonabile a quello di controllo. (B) Dopo I/R, l'espressione di SOD1 è stata elevata. Anche l'espressione di SOD1 è diminuita dopo il trattamento con NAC. (C) L'evento I/R ha indotto l'espressione della catalasi. L'RVA trattata con I/R ed esposta a NAC ha mostrato una diminuzione dei livelli di catalasi. GAPDH (A,C) e β-Actin (B) sono stati utilizzati come controlli interni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Stima di IL-1β e TNF-α utilizzando ELISA. ELISA è stato utilizzato per quantificare IL-1β e TNF-α e i risultati hanno rivelato che c'era un aumento dell'espressione di IL-1β e TNF-α, che è stato mitigato dall'aggiunta di Naringenina. Per questo studio, è stato applicato l'ANOVA seguito dal test di Newman-Keuls. Le barre di errore rappresentano la media ± SD, n = 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Effetto dell'ischemia-riperfusione sull'espressione delle proteine marcatori dell'infiammazione. (A) Il trattamento I/R ha determinato un aumento dell'espressione di NLRP3. L'incubazione di RVA trattato con I/R con Naringenina ha ridotto l'espressione di NLRP3. (B) Analogamente a NLRP3, anche l'espressione di NF-kβ è aumentata dopo il trattamento con I/R. Il trattamento di Naringenina ha ridotto l'espressione di NF-kβ. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Effetto dell'ischemia-riperfusione sullo stato apoptotico e autofagico delle cellule RVA. (A) Per esplorare l'induzione dell'apoptosi da parte del processo I/R, l'espressione della caspasi 3 scissa è stata valutata utilizzando il western blotting. A seguito di danni I/R, il livello di caspasi 3 scissa è stato aumentato. Tuttavia, il trattamento con zVAD-fmk, un inibitore dell'apoptosi, ha ridotto l'espressione di caspasi 3 scissa. (B-D) Per valutare l'induzione dell'autofagia dopo I/R, è stata determinata l'espressione di LC3II/I, Beclin1 e Atg7. Dopo I/R, l'espressione di tutti i marcatori autofagici è aumentata, mentre l'esposizione di RVA trattati con I/R all'inibitore dell'autofagia 3-MA ha ridotto l'espressione di tutte le proteine per controllare i livelli. Come controllo interno, è stato utilizzato GAPDH. (E) la qRT-PCR è stata utilizzata per confermare l'induzione dell'autofagia e determinare i livelli di espressione dell'mRNA Ambra1 e Atg7. Entrambi i geni hanno mostrato un notevole aumento dell'espressione nel gruppo I/R rispetto al controllo, che è stato riportato a livelli quasi normali dopo la terapia con NAC. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno per esperimenti qRT-PCR. Per l'esperimento (E), è stato applicato l'ANOVA, seguito dal test di Newman-Keuls. Le barre di errore rappresentano la media ± SD, n = 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Effetto dell'ischemia-riperfusione sul danno al DNA. Per determinare se I / R induce nick del DNA, abbiamo esaminato il danno al DNA usando l'elettroforesi su gel. I/R ha provocato la degradazione genomica del DNA, come dimostrato dallo spalmamento nel campione I/R. La terapia NAC dell'RVA danneggiato da I/R ha ridotto il danno al DNA. È stata impiegata una scala del DNA da 1 kb. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Confronto tra il modello Hook-I/R e il modello MCAO. È stato effettuato un confronto tra i dati generati dal modello Hook-I/R e i dati generati dal modello MCAO. (A) L'espressione della proteina apoptotica caspasi-3 e delle proteine autofagiche Beclin1 e Atg7 era più elevata negli VA trattati con I/R rispetto all'espressione delle stesse proteine negli VA di controllo, il che era in accordo con i risultati ottenuti negli esperimenti MCAO. (B) I livelli di TNF-α e IFN-Ƴ sono risultati elevati in entrambi i gruppi RVA e MCAO rispetto ai rispettivi controlli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del materiale/attrezzatura | Concentrazione | Autoclave | Immagazzinamento | ||
| Reagenti per la soluzione di Ringer | |||||
| Cloruro di sodio | 123 mM | ||||
| Cloruro di potassio | 4,96 mM | ||||
| Cloruro di calcio | 1,53 mM | ||||
| Acqua distillata sterile | 100 ml | ||||
| ph | 7.4 | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
| Reagenti per soluzione salina normale allo 0,9% | |||||
| Cloruro di sodio | 154mM | ||||
| Acqua distillata sterile | 100 ml | ||||
| ph | 7.4 | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
| Reagenti per etanolo al 70% | |||||
| 70% etanolo | 70 ml | ||||
| Acqua distillata sterile | 30 ml | Non richiesto | R.T. | ||
| Reagenti per 1x Fosfato Tampone Soluzione Salina | |||||
| Cloruro di sodio | 136,8 mM | ||||
| Cloruro di potassio | 26,8 mM | ||||
| Fosfato di potassio monobasico anidro | 14,6 mM | ||||
| di-Sodio idrogeno fosfato eptaidrato | 5,37 mM | ||||
| Acqua distillata sterile | 100 ml | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
Tabella 1: Ricetta delle soluzioni utilizzate in questo studio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'obiettivo della ricerca ischemia-riperfusione è quello di creare strategie terapeutiche che prevengano la morte cellulare e promuovano il recupero29,30. Per superare gli attuali vincoli nella ricerca I/R, abbiamo progettato un modello di embrione di pulcino Hook I/R per produrre un modello I/R affidabile e riproducibile. Per quanto ne sappiamo, il nostro è il primo modello I / R mai creato in un embrione di pulcino di 3 giorni per esperimenti I / R di routine, oltre a studiare i segnali di stress (ad esempio, stress ossidativo e infiammatorio). Dati i vantaggi delle dimensioni e dell'accessibilità al giorno 3 dello sviluppo31, l'embrione di pulcino è stato utilizzato in una fase di sviluppo di 72 ore, a causa dell'elevata produttività del modello, della semplicità di impiego e dell'adattabilità per l'analisi di routine32. In breve, al giorno di sviluppo 3, il pulcino in ovo è un modello altamente controllato, ma accessibile e ragionevolmente trasparente all'interno dell'uovo che può essere utilizzato per visualizzare la normale fisiologia, la patologia della malattia e gli effetti del trattamento sperimentale. Le sue enormi dimensioni lo rendono particolarmente utile per studiare la formazione e il comportamento dell'embrione durante la normale fisiologia e lo stress33. Sebbene gli embrioni di pulcino più vecchi (quelli incubati per 4 giorni o più) possano essere impiegati, e abbiamo provato un punto temporale successivo, l'uso di embrioni più vecchi come sistemi modello è fortemente limitato dal fatto che il sacco vitellino cresce così spesso oltre i 3 giorni di sviluppo che le procedure chirurgiche sono difficili. È interessante notare che mentre l'RVA non è completamente formato in una finestra temporale precoce (ad esempio, il giorno 1 o 2), la finestra potrebbe portare alla teratogenicità34. Oltre alle limitazioni associate a un punto di sviluppo precoce o tardivo, un embrione di pulcino di 72 ore funge da modello ideale per la ricerca del processo I / R poiché gli embrioni di pulcino di 3 giorni hanno un sistema circolatorio ben definito30.
Comprendere la fisiopatologia della lesione I / R è uno degli obiettivi principali della progettazione di un modello I / R. Attualmente, non esiste alcuna terapia clinicamente utile per ridurre il danno da ischemia-riperfusione1,35. Di conseguenza, è stata proposta una vasta gamma di modelli in vitro e in vivo. In questo contesto, per la prima volta è stata proposta la modellazione I/R in un embrione di pulcino in via di sviluppo di 3 giorni in ovo. Ricerche precedenti hanno dimostrato che l'occlusione-riperfusione del flusso sanguigno arterioso provoca alterazioni patologiche in modelli sperimentali simili a quelle osservate negli esseri umani36,37,38, quindi eravamo fiduciosi che il nostro modello avrebbe fatto lo stesso (tale stress ossidativo e infiammatorio osservato in modelli in vivo o in pazienti). Con i risultati del nostro studio, l'ipotesi di cui sopra si è dimostrata corretta.
La circolazione del sangue dagli embrioni al sacco vitellino è controllata dai vasi vitellini negli embrioni di pulcino39. Gli embrioni ottengono sostanze nutritive dal tuorlo e diffondono l'ossigeno dall'aria attraverso la circolazione vitellina; quindi, limitando uno qualsiasi dei vasi di vitellina che possono interrompere la nutrizione e il trasferimento di ossigeno. Sulla base di questi fatti, l'ischemia è stata indotta occludendo l'afflusso di sangue all'RVA per 5 minuti, seguito da riperfusione per ulteriori 5 ore e 55 minuti. Il modello proposto può essere utilizzato per esaminare una serie di vari processi patologici associati a I / R e testare una varietà di farmaci e i loro obiettivi. Il modello attuale può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nel DNA, nell'RNA e nelle proteine. Ha il potenziale per dare un alto rendimento. Oltre alla sua semplicità e adattabilità per l'analisi regolare, il modello può anche studiare l'homing delle cellule staminali a breve termine, che sarà studiato in studi futuri.
Rispetto ai modelli in vitro , il nostro modello è facile da usare, economico e cresce rapidamente, oltre ad essere eticamente innocente32. La presenza di microvascolarizzazione, il sistema immunitario e le valutazioni fisiologiche sono tutti vantaggi rispetto ai modelli in vitro , mentre il basso costo, l'efficacia in termini di tempo e l'assenza di problemi etici sono vantaggi rispetto ai modelli in vivo40. I vantaggi di cui sopra indicano che il nostro modello ha un effetto comparabile agli altri modelli I/R attualmente in uso (Figura 10). Una potenziale lacuna è l'incapacità del modello attuale di quantificare l'area dell'infarto. La valutazione diretta dell'infarto può essere un prezioso biomarcatore per il danno mediato da I / R e un metodo per mappare gli effetti di vari farmaci terapeutici. Pertanto, abbiamo cercato di quantificare l'area dell'infarto, ma non abbiamo potuto farlo a causa della delicata struttura dei pulcini sviluppati da 72 ore. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per valutare in modo completo le strategie e i percorsi per i processi I / R.
Per riassumere, il modello attuale può essere utilizzato per studiare vari percorsi patologici legati all'I / R e lo screening di una varietà di farmaci e dei loro obiettivi. Grazie alla sua elevata riproducibilità, economicità e semplicità, prevediamo che il nostro modello sarà una risorsa preziosa per la scienza di base e la ricerca traslazionale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Vogliamo esprimere la nostra gratitudine a Hari Shankar per i suoi input critici durante la videografia e il montaggio, Baqer Hussain per la voce fuori campo, Asghar Rizvi per il montaggio video, Mohammad Haider per le riprese video, Mohammad Danish Siddiqui per l'assistenza durante gli esperimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
