Summary
Dette papiret presenterer en fabrikasjonsprotokoll for en ny type kultursubstrat med hundrevis av mikrobeholdere per mm2, hvor organoider kan dyrkes og observeres ved hjelp av høyoppløselig mikroskopi. Cellesåings- og immunfargingsprotokollene er også detaljerte.
Abstract
Karakteriseringen av et stort antall tredimensjonale (3D) organotypiske kulturer (organoider) på forskjellige oppløsningsskalaer er for tiden begrenset av standard bildebehandlingsmetoder. Denne protokollen beskriver en måte å forberede mikrofabrikerte organoidkulturbrikker på, som muliggjør multiskala, 3D-live-bildebehandling på et brukervennlig instrument som krever minimal manipulasjon og er i stand til opptil 300 organoider/t-bildegjennomstrømning. Disse kulturbrikkene er kompatible med både luft- og nedsenkningsmål (luft, vann, olje og silikon) og et bredt spekter av vanlige mikroskoper (f.eks. spinnskive, punktskanner konfokal, bredt felt og brightfield). Videre kan de brukes med lysarkmodaliteter som single-objective, single-plane illumination microscopy (SPIM) teknologi (soSPIM).
Protokollen beskrevet her gir detaljerte trinn for fremstilling av mikrofabrikerte kulturbrikker og kultur og farging av organoider. Bare kort tid er nødvendig for å bli kjent med, og forbruksvarer og utstyr kan lett finnes i vanlige biolaboratorier. Her vil 3D-bildebehandlingsmulighetene kun bli demonstrert med kommersielle standardmikroskoper (f.eks. Spinning disk for 3D-rekonstruksjon og bredfeltsmikroskopi for rutinemessig overvåking).
Introduction
I organotypiske 3D-cellekulturer, heretter kalt organoider, differensierer og organiserer stamceller seg til romlige strukturer som deler sterke morfologiske og funksjonelle likheter med virkelige organer. Organoider tilbyr verdifulle modeller for å studere menneskelig biologi og utvikling utenfor kroppen 1,2,3. Et økende antall modeller utvikles som etterligner leveren, hjernen, nyren, lungen og mange andre organer 2,4,5. Differensiering i organoider styres ved tilsetning av løselige vekstfaktorer og en ekstracellulær matrise i en presis tidssekvens. Men i markert kontrast til organer er utviklingen av organoider ganske heterogen.
Utover mange biologiske utfordringer6,7, utgjør organoidkulturer også teknologiske utfordringer når det gjelder cellekulturmetoder, karakterisering av transkriptomikk og avbildning. In vivo organutvikling skjer i et biologisk miljø som resulterer i en svært stereotyp selvorganisering av cellearrangementer. Enhver fenotypisk endring kan brukes som en proxy for å diagnostisere en syk tilstand. I motsetning til dette utvikler organoider in vitro i minimalt kontrollerte mikromiljøer som er kompatible med cellekulturforhold, noe som resulterer i stor variasjon i utviklingsbanen og formdannelsen for hver enkelt organoid.
En nylig studie8 viste at kvantitativ avbildning av organoid form (fenotypebeskrivelser) kombinert med vurderingen av noen få genetiske markører tillater definisjonen av fenotypiske utviklingslandskap. Uten tvil er evnen til å relatere mangfoldet av genomisk uttrykk i organoider med deres fenotypiske oppførsel et stort skritt mot å frigjøre det fulle potensialet til organotypiske kulturer. Dermed ber det om utvikling av dedikerte bildebehandlingsmetoder med høyt innhold som tillater karakterisering av organoide egenskaper på subcellulære, flercellede og helorganoide skalaer i 3D 9,10.
Vi utviklet en allsidig screeningplattform med høyt innhold (HCS) som muliggjør strømlinjeformet organoidkultur (fra isolerte humane embryonale stamceller [hESC], humaninduserte pluripotente stamceller [hIPSC] eller primære celler til 3D, flercellede, differensierte organoider) og rask, ikke-invasiv 3D-avbildning. Den integrerer en neste generasjons, miniatyrisert, 3D-cellekulturenhet, kalt JeWells-brikken ( brikken heretter), som inneholder tusenvis av godt arrangerte mikrobrønner flankert med 45 ° speil som tillater rask, 3D, høyoppløselig avbildning ved enkeltobjektiv lysarkmikroskopi11. Kompatibelt med ethvert standard, kommersielt, invertert mikroskop, muliggjør dette systemet avbildning av 300 organoider i 3D med subcellulær oppløsning på <1 time.
Mikrofabrikasjonen av cellekulturenheten starter fra en eksisterende mikrostrukturert form, som inneholder hundrevis av mikropyramider (figur 1A) med en firkantet base og sidevegger ved 45 ° i forhold til basen. Figur 1C viser elektronmikroskopbilder (EM) av slike strukturer. Formen i seg selv er laget av poly (dimetylsiloksan) (PDMS) og kan gjøres som en kopi av en primær mold (ikke vist her) med tilsvarende funksjoner (som hulrom) ved hjelp av standard myk-litografiske prosedyrer. Den primære formen kan produseres ved forskjellige prosedyrer. Den som ble brukt til denne protokollen ble laget ved hjelp av silisium våt etsing som rapportert i Galland et al. 11; Prosedyren for fremstilling av primærformen er ikke kritisk for denne protokollen. Pyramidene er ordnet i en kvadratisk matrise, med samme tonehøyde for X- og Y-retningene (i dette tilfellet er tonehøyden 350 μm).
Som en illustrasjon ble proof-of-concept-eksperimenter12 publisert for å demonstrere at brikken tillater langsiktig kultur (måneder) og differensieringsprotokoller mens den nøyaktig definerer antall innledende celler i brønnene. Individuell utvikling av et stort antall organoider kan automatisk overvåkes live ved hjelp av standard lysfelt og 3D lysarkfluorescensmikroskoper. Videre kan organoider hentes for å utføre ytterligere biologiske undersøkelser (f.eks. Transkriptomisk analyse). Dette papiret skisserer detaljerte protokoller for fremstilling av cellekulturdekselene, såings- og fargeprosedyren for fluorescensmikroskopi, samt gjenfinning av organoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Den første delen av denne protokollen beskriver mikrofabrikasjonen av cellekulturenheten. En original primærform med pyramidale hulrom kan produseres internt hvis mikrofabrikasjonsanlegg er tilgjengelige eller outsourcet til eksterne selskaper. Den primære formen som brukes i dette arbeidet er produsert internt, med fabrikasjonsprosesstrinn beskrevet andre steder11,13. En grunnleggende protokoll for mikrofabrikasjon av formen er tilgjengelig i tilleggsfil 1. KRITISK: Operasjonene i trinn 1 til 6 må utføres i et støvfritt miljø. En avtrekkshette med laminær luftstrøm eller et rent rom, hvis tilgjengelig. Gjennom alle disse trinnene må personlig verneutstyr (PPE) brukes, for eksempel hansker, laboratoriefrakk og vernebriller.
1. Terninger av PDMS-mugg
- Klipp små deler av PDMS-formen til dimensjonen som kreves for den endelige enheten (f.eks. 1 cm x 1 cm [figur 1B]). Klipp dem parallelt med XY-retningene til matrisen.
KRITISK: Når du skjærer PDMS-formen i terninger på 1 cm x 1 cm, må du utføre kuttene i enkle trinn; Bruk et ensidig barberblad, trykk og skjær gjennom PDMS i ett enkelt trinn. Dette er for å forhindre dannelse av små partikler av PDMS, som kan avsette seg på overflaten av formen og påvirke kvaliteten på replikatrinnene (trinn 3).
2. Klargjøring av flate PDMS-substrater
- Vei ~ 15-20 g PDMS-baseharpiks og 1,5-2 g av retikulasjonsmiddelet (dvs. et forhold på 10: 1), bland dem forsiktig og degas i en vakuumburk i ~ 20 minutter.
- Hell sakte de avgassede PDM-ene på en plast, 15 cm bred (diameter) petriskål.
- Herd PDMS ved å holde petriskålen i en ovn satt til 65 ° C i 2 timer. Etter å ha ventet på at herdingen skal fullføres, er en flat PDMS-film på ~ 1,5 mm tykkelse (inneholdt i petriskålen) klar til bruk (figur 2A).
- Bruk et skarpt blad til å kutte 2 cm x 2 cm biter ut av PDMS (figur 2B-D).
MERK: Den nøyaktige tykkelsen på dette PDMS-arket er ikke kritisk; ~1-2 mm er et passende område. Dimensjonen for kuttet skal være større enn den strukturerte formen, men ikke mye større, noe som vil føre til sløsing med materiale.
3. Produksjon av det strukturerte laget laget av UV-herdbart lim
- Plasser én PDMS-formterning (som forberedt i trinn 1) med forsiden ned på toppen av det flate PDMS-kuttet (som forberedt i trinn 2) (figur 3A, B).
MERK: Forsikre deg om at pyramidefremspringene i formen er orientert mot det flate PDMS-substratet, og at bare den øverste overflaten av de avkortede pyramidene er i kontakt. Vurder riktig plassering med et optisk mikroskop (figur 3C,D). - Til den ene siden av formen, ved hjelp av en pipette, slipp en liten mengde (to dråper, ca. 0,1-0,2 ml) UV-herdbart lim (figur 4A).
MERK: Når væsken kommer i kontakt med kanten av formen, vil kapillariteten drive væsken til å fylle hulrommet mellom selve formen og det flate kuttet av PDMS som brukes som substrat.- Følg væskens progresjon inne i hulrommet, for eksempel ved hjelp av et invertert optisk mikroskop med et 10x forstørrelsesmål (figur 4B,C).
- Utsett det UV-herdbare limet for UV-lys for å kurere det. Juster eksponeringstiden avhengig av strømtettheten til UV-kilden som brukes (f.eks. en UV-LED-boks med en effekttetthet på 35 mW/cm 2;2 minutter ved 50 % effekt i denne protokollen for å herde limet fullstendig).
- Bruk overflødig mengde lim på den ene kanten, hold det herdede limet på det flate PDMS-underlaget ved å trykke forsiktig med en finger (figur 5A, B). I mellomtiden bruker du pinsett til å klemme det ene hjørnet av formen ved siden av den samme kanten som holdes nede, og sakte skrelle den av mens du sørger for at den teksturerte filmen ikke løftes opp også.
MERK: Figur 5C viser resultatet av en riktig muggfjerningsprosedyre; Figur 5E-G viser feil prosedyre. - Trim overflødig lim og overflødig PDMS-substrat ved hjelp av et barberblad for å la det herdede, strukturerte, selvklebende laget være flatt på PDMS med overflødig PDMS bare på den ene kanten (figur 5D), som vil være nødvendig i trinn 5.
4. Klargjøring av coverslip substrat
NOTAT: Som underlag for den endelige enheten brukes standard avrundede 1.5H deksler med 25 mm diameter. Før de kan brukes, må de rengjøres for å fjerne støv og/eller organiske rester fra overflaten.
- Coverslip rengjøring
- Dypp dekslene i såpevann i 5 minutter mens ultralydet påføres (40 kHz, 110 W sonisk effekt).
- Vask dekkene i rent avionisert (DI) vann, først ved nedsenking og til slutt med rennende DI-vann fra en kran. Tørk dekslene med en N2 gassblåsepistol.
- Fordyp dekslene i et acetonbad i 5 minutter; Flytt umiddelbart til et 2-propanol (IPA) bad i ytterligere 5 minutter.
- Skyll dekkslipsene med ren IPA med en klemmeflaske. Tørk dekslene med N2 gassblåsepistol.
MERK: Coverslips rengjort ved hjelp av denne prosedyren kan lagres i en lukket beholder til nødvendig. Hold dem i et tørt skap for å unngå fuktighet på overflaten.
- Når det er klart til bruk, behandle et rent deksel med en kort O 2 plasmaprosess for å forbedre hydrofiliteten: O2 20 sccm, 3 mbar trykk, 60 W ved RF-strømgeneratoren og 60 s varighet.
- Umiddelbart etter plasmaaktiveringen, fortsett med å spinnbelegge det tynne laget av UV-herdbart lim ved å plassere dekselet på vakuumklumpen til en standard sentrifugerer og helle en liten dråpe lim i midten av dekselet (figur 6). Kjør spinnbeleggprosessen: spre i 5 s ved 500 o / min, belegg ved 3000 o / min i 45 sekunder (med akselerasjon og retardasjon satt til 100 o / s).
- Hvis spinnbelegg ikke er tilgjengelig, bruk følgende alternative måte å produsere en tynn film av UV-lim på dekslene:
- På et rent deksel slipper du ~0,1 ml UV-herdbart lim med en pipette (figur 7A).
- Ta en ekstra dekkseddel og legg den på toppen av den første for å få det flytende limet til å spre seg jevnt mellom de to dekslene (figur 7B-D).
- Når spredningslimet har nådd kantene på dekslene, skiller du dem forsiktig ved å skyve det ene over det andre. Når de er separert, er begge dekkene fullstendig belagt med et tynt lag flytende lim (figur 7E).
MERK: Belegget er kanskje ikke jevnt og glatt bare hvis separasjonen ikke gjøres med en jevn og kontinuerlig bevegelse.
- Hvis spinnbelegg ikke er tilgjengelig, bruk følgende alternative måte å produsere en tynn film av UV-lim på dekslene:
- Precuring av UV-herdbart lim
- Etter spinnbelegg, forsterk limet ved eksponering for UV. Juster eksponeringstiden avhengig av strømtettheten til UV-kilden som brukes (her ble en UV-LED-boks med en effekttetthet på 35 mW/cm2 brukt i 1 min ved 50% effekt).
KRITISK: Limet som brukes her er et optisk lim. Se diskusjonen for viktige punkter knyttet til energidosene for herding.
- Etter spinnbelegg, forsterk limet ved eksponering for UV. Juster eksponeringstiden avhengig av strømtettheten til UV-kilden som brukes (her ble en UV-LED-boks med en effekttetthet på 35 mW/cm2 brukt i 1 min ved 50% effekt).
5. Overføring av teksturfilmen til det endelige substratet
- Ta en av de teksturerte filmene (klargjort i trinn 3) og plasser den i kontakt med den selvklebende deksleseddelen (klargjort i trinn 4). Sørg for at kontakten mellom det delvis herdede limet på dekselet og den strukturerte filmen er så jevn som mulig (figur 8A-C).
KRITISK: På dette stadiet bør limet på dekselet være solid nok til å unngå å flyte igjen, noe som vil fylle pyramidehulene i den strukturerte filmen når den plasseres i kontakt, men også være plastisk og lim nok til at kontakten kan optimaliseres ved å trykke forsiktig på den strukturerte filmen. - Utsett dekslene for UV-lys til det selvklebende laget som er belagt på dekselet, er fullstendig herdet. Dette vil forsegle den teksturerte filmen på dekselet og gi lekkasjesikker isolasjon mellom pyramidehulene.
- Til slutt, riv av det flate PDMS-underlaget (figur 8D-F). Bruk pinsett, klem PDMS på det ene hjørnet ved kanten der overflødig materiale ble igjen etter trimming (trinn 3.5). På denne måten blir det teksturerte filmlaget limt til dekselet med åpen tilgang øverst for cellesåing. KRITISK: Når du skreller av den flate PDMS-en, bør den teksturerte filmen forbli godt festet til dekselet. Adhesjonsfeil bekreftes lett hvis den strukturerte filmen kan løsnes fra dekselet etter endelig eksponering for UV uten anstrengelse.
6. Langsiktig passivering av cellekulturdekselet for cellekultur
MERK: Passivering oppnås ved å generere et konform og kontinuerlig belegg av en biomimetisk kopolymer med en struktur som ligner den polare gruppen fosfolipider i cellemembranen. Dette konforme belegget forhindrer celleadhesjon til cellekulturenheten
- Lag en oppløsning med 0,5 % (w/v) av den biomimetiske kopolymeren oppløst i ren etanol. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C for fremtidig bruk.
- Plasser cellekulturdekselet i en 35 mm petriskål og dekk det helt med den biomimetiske kopolymerløsningen.
- Etter 5 minutter, fjern cellekulturdekselet fra beholderen med den biomimetiske kopolymeroppløsningen og la det tørke ved romtemperatur inne i den endelige parabolen i en biosikkerhetshette (>1 time).
MERK: Et tykkere belegg kan produseres ved å øke konsentrasjonen av den biomimetiske kopolymeren i beleggoppløsningen; resultatene av et tykkere belegg er synlige under et lysfeltmikroskop (figur 9A).
7. Cellesåing
- Avgassing og sterilisering
- Like før cellesåing, dispenser sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) i cellekulturskålene (vanligvis 1 ml for en 35 mm petriskål). Degas parabolen med den sterile PBS ved hjelp av en ultralydsenhet i ~ 10 minutter, etterfulgt av flere runder med pipettering for å fjerne alle boblene.
KRITISK: Hvis luft er fanget inne i pyramidehulene, vil det forhindre at cellene kommer inn i dem. For å sikre at det ikke er luft fanget i pyramiden før cellesåing, anbefales det å visuelt sikre (under et stasjonært lysfeltmikroskop ved 10x eller 20x forstørrelse) fraværet av luft i disse hulrommene (figur 10). - Bytt PBS med sterilt kulturmedium og steriliser platen med UV-lys i 30 minutter under en cellekulturhette.
MERK: Fra dette trinnet og fremover bør parabolen betraktes som steril og manipuleres ved hjelp av sterile teknikker. En alternativ måte å fjerne fanget luft fra cellekulturenheten på er å bruke en vakuumkrukke med en vakuumpumpe.
- Like før cellesåing, dispenser sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) i cellekulturskålene (vanligvis 1 ml for en 35 mm petriskål). Degas parabolen med den sterile PBS ved hjelp av en ultralydsenhet i ~ 10 minutter, etterfulgt av flere runder med pipettering for å fjerne alle boblene.
- Klargjøring av cellesuspensjon
MERK: Celler kan frøes som enkelt- eller småcelleaggregater og gå inn i prøvebrønnene gjennom den øverste blenderåpningen. Over tid aggregerer og vokser de innsatte cellene inne i prøvebrønnene til sfæroider med en størrelse som er større enn blenderåpningens størrelse. Som validerte cellelinjemodeller, bruk HCT116 (CCL-247 ATCC) eller MCF7 (HTB-22 ATCC) kreftceller opprettholdt i anbefalt kulturmedium (ATCC-retningslinjer).- Forbered en cellesuspensjon (f.eks. ved hjelp av en trypsiniseringsprosess etter ATCC-retningslinjer). Følg anbefalinger for trypsinisering / cellesuspensjonsforberedelse for interessecellene.
- Tell og juster cellekonsentrasjonen til 0,5 × 106 celler/ml i anbefalt dyrkningsmedium.
- Cell dispensering
- Fjern PBS-bufferen fra 35 mm cellekulturskålen og dispenser deretter 1 ml av den justerte cellesuspensjonen. Se figur 11A for et optisk mikroskopbilde av en cellesåingsprosedyre med tilstrekkelig celletetthet og homogenitet.
- Sett cellekulturfatet tilbake i celleinkubatoren (37 °C, 5% CO2 og 100% fuktighet) i 10 minutter. Omtrent 80-100 celler vil komme inn i hvert pyramidehule.
MERK: Det er mulig å øke antall celler per cellekulturrett ved å øke enten cellekonsentrasjonen eller tiden brukt før cellesuspensjonen fjernes. Vanligvis tar sfæroiddannelse flere timer (avhengig av celletype) etter cellesåing og kan følges med et lysfeltmikroskop (4x til 40x mål; Figur 11). Herfra kan kulturmedium, ekstracellulære matriser og differensieringsvekstfaktorer endres eller legges til cellekulturskålen som inneholder sfæroidene i samsvar med typiske differensieringsprotokoller som kan vare noen dager, uker eller måneder. - Etter 10 minutters inkubasjon, gjenopprett cellekulturskålen fra inkubatoren og aspirer forsiktig den cellulære suspensjonen for å fjerne untrapped celler. Tilsett 1 ml kulturmedium til en 35 mm tallerken og legg den tilbake i celleinkubatoren.
Kritisk: På dette stadiet, fordi sfæroider ikke har dannet seg ennå, er det svært viktig å unngå sterk aspirasjon eller dispensering som vil resultere i tap av cellene. Visuell kontroll ved hjelp av et stasjonært lysfeltmikroskop anbefales på dette trinnet.
8. Immunfarging og avbildning
- Fiksering og farging
MERK: Ulike klassiske prosedyrer for fiksering og immunfarging er helt kompatible med cellekulturskålen. En typisk protokoll er beskrevet her.- Fest organoider/sfæroider i cellekulturskålen i 20 min i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur.
- Permeabiliser organoidene i 24 timer i 1 % surfaktantløsning i steril PBS ved 4 °C på en orbital shaker og inkuber i 24 timer i blokkerende buffer (2 % bovint serumalbumin [BSA] og 1 % surfaktant i steril PBS) ved 4 °C på en orbital shaker.
- Inkuber prøvene med primære antistoffer av interesse ved en fortynning mellom 1/50 og 1/200 (eller i henhold til produsentens anbefalinger) i antistofffortynningsbuffer (2 % BSA og 0,2 % surfaktant i steril PBS) ved 4 °C i 48 timer.
- Skyll prøvene 3x med vaskebuffer på en orbital shaker (3% NaCl og 0,2% surfaktant i steril PBS) og inkuber med tilsvarende sekundære antistoffer i antistofffortynningsbuffer (fortynning mellom 1/100 og 1/300 eller i henhold til produsentens anbefalinger), 0,5 μg / ml 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og 0,2 μg / ml Alexa Fluor 647 eller 488 Phalloidin ved 4 ° C i 24 timer på en orbital shaker, etterfulgt av fem skylletrinn med PBS. Monter eventuelt prøvene med et vannløselig clearingmiddel som er forvarmet til 37 °C.
- Imaging
MERK: På dette stadiet kan organoider i mikrobrønnplaten betraktes som en vanlig kulturskål som inneholder faste og fargede prøver for avbildning: enhver standard bildebehandlingsprosedyre kan brukes uten tilpasning eller modifikasjon nødvendig. Figur 12 illustrerer et representativt resultat av bilder og 3D-rekonstruksjon oppnådd ved hjelp av et spinnende diskkonfokalmikroskop, med et 40x luftobjektiv (numerisk blenderåpning 0,75).- Bruk konstruktørprogramvare for automatisk bildeopptaksprosess med følgende innstillinger: eksponeringstid = 50 ms, med et z motorisert trinn for å oppnå en z-stabel (1 μm Z-trinn, for en total høyde på 70 μm).
- Utfør 3D-rekonstruksjon ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
9. Utgivelse og innsamling av organoider
MERK: Det teksturerte klebende laget av cellekulturskålen kan løsnes fra dekselet for å frigjøre de levende sfæroidene / organoidene (før fiksering) inneholdt inne i pyramidale hulrom for analyse av cellene med andre prosedyrer som RNA-sekvensering, -omiske tilnærminger, in vitro-eksperimenter og in vivo-transplantasjon .
- Med prøven fortsatt i petriskålen og i en biosikkerhetshette, bruk et blad som en skalpell for å kutte et hjørne av det strukturerte limlaget.
- Med pinsett, klem det teksturerte klebende laget på kuttkanten og fjern det forsiktig fra glassdekselet, men hold det nedsenket i mediet (noen organoider kan være igjen med limlaget, figur 13).
- Skyll 3x med kulturmedium og samle organoider ved pipettering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 8F viser det typiske aspektet ved et cellekulturdeksel etter vellykket fabrikasjon. Det UV-herdbare klebende laget virker flatt og fester seg godt til dekselet. Overføringen av det selvklebende laget på dekselet kan mislykkes hvis laget på dekkslipen er overherdet, eller hvis fjerningen av det flate PDMS-substratet gjøres feil (som vist i figur 8G,H). I begge tilfeller er feilen tydelig da ingen strukturert film overføres til dekselet.
For at mikrobrønnene skal fungere, må den strukturerte filmen som produseres (som beskrevet i protokolltrinn 3) ha både toppen og undersiden av pyramidene åpne for å sikre at celler under såingen i trinn 7 kan komme inn i hulrommene og forbli inneholdt når organoidene begynner å dannes. Figur 9 viser økningen i tykkelsen på belegget ved å øke konsentrasjonen av den biomimetiske kopolymeren i beleggoppløsningen. Figur 10 viser resultatene av avgassing av cellekulturskålene for å sikre at det ikke fanges luft i pyramidehulrommene. Figur 10A,B viser fullstendig avgassing, mens figur 10C,D viser luftbobler i pyramidehulrommene.
I figur 11 er celler fanget inne i pyramidene, og de tilsvarende organoidene dannes etter dag 2 og 15 av dyrking. Hvis toppåpningen til mikrobrønnene i stedet lukkes (som følge av feil trinn 3), vil det ikke være celler igjen etter skylling av prøven etter cellesåing. Figur 12 viser representative bilder av organoidene og en 3D-rekonstruksjon oppnådd ved hjelp av et spinnende disk konfokalmikroskop med et 40x luftmål (numerisk blenderåpning 0,75). Etter frigjøring og oppsamling kan organoidene lagres i et lite hetteglass og brukes til videre analyse (f.eks. RNA-sekvensering). Figur 13B viser et eksempel på et utvalg organoider samlet inn som beskrevet.
Figur 1: Poly (dimetylsiloksan) mugg. (A) Start-PDMS-formen oppnådd som en støpt kopi av en 4" teksturert wafer (se tilleggsfil 1). (B) 1 cm x 1 cm bredt kutt av startformen for PDMS. (C) Skanning elektronmikroskop bilder av trapesformede søyler arrangert i en kvadratisk matrise, som befolker overflaten av formen. Skalastenger = 1 cm (A), 100 μm og 200 μm (henholdsvis C-topp og bunn). Forkortelse: PDMS = poly (dimetysiloksan). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flatt PDMS-substrat . (A) Et lag med PDMS, ~ 1 mm tykt, tilberedes i en standard 15 cm bred petriskål. (B) Peeling ut av et nytt kutt av PDMS. (C) De resterende PDMS på petriskålen kan kuttes i flere stykker for videre bruk. (D) Flat PDMS kutt og PDMS mold side om side; den flate PDMS er større enn formen. Forkortelse: PDMS = poly (dimetysiloksan). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av formen på underlaget . (A) Formen er plassert på det flate underlaget med pyramidene vendt ned. (B) Forskjellig utseende av dårlig kontakt (øverst) og god kontakt (nederst) mellom formen og PDMS-substratet. (C) Optisk mikroskopbilde av et område med dårlig kontakt; De røde sirklene markerer søylene som ikke er i kontakt med underlaget - de ser ut til å ha en lysere farge enn de som er i kontakt i samme bilde. (D) Optisk bilde av et område med alle søyler i god kontakt. Skalastenger = 200 μm (C,D). Forkortelse: PDMS = poly (dimetysiloksan). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kapillær fylling av UV-herdbart lim. (A) Denne sekvensen av bilder viser (fra venstre til høyre) hellingen av en liten mengde lim på den ene kanten og progresjonen av væskelimet i hulrommet mellom formen og substratet. De gule pilene peker i retning av væskestrømmen. (B) Sekvens av optiske bilder (40x forstørrelse) av væskefronten som beveger seg; Når du er i god kontakt, beveger væskens front seg rundt kantene på pyramidene uten lekkasjer. De gule pilene peker på strømningsretningen og de røde pilene peker på forkanten av væskefronten som beveger seg rundt kontaktkantene. (C) Sekvens av optiske bilder (40x) av væskefronten som beveger seg når kontakten er dårlig; De røde pilene peker på forkanten av væsken som infiltrerer mellom formen og underlaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fjerning av formen etter limherding. (A-C) Riktig prosedyre for avskalling av formen: mens du forsiktig trykker på overskudd av lim ved venstre kant med pinsett, klemmes formen nær samme kant og bøyes sakte for å skrelle av. (D) Resultatet av riktig prosedyre; overskuddet er trimmet ut på tre kanter, mens et lite overskudd av PDMS er igjen på den fjerde siden (gul pil). (VG Nett) Eksempel på feil prosedyre for fjerning av formen: formen klemmes med pinsett fra motsatt kant, noe som resulterer i avskalling fra det flate underlaget til limfilmen sammen med formen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Belegg på glassdekselet. (A,B) Eksempel på en god beleggprosedyre: glassdekselet er plassert på vakuumklumpen til en spinnbelegg, og nok lim dispenseres i midten, noe som gir et homogent belegg av dekselet. (C,D) Eksempel på en dårlig beleggprosedyre: ikke nok lim blir dispensert, noe som resulterer i ujevnt belegg på dekselet. (E) Fra venstre mot høyre, eksempler på godt, akseptabelt og dårlig belegg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Alternativ belegningsprosess . (A) En liten dråpe flytende lim er plassert i midten av dekselet. (B) En annen dekkslip plasseres forsiktig på toppen av den første. (C,D) Væsken spredte seg mellom de to dekslene og ble jevnt fordelt. (E) Eksempler på resultater etter korrekt separasjon av dekksedlene (venstre) eller feil separasjon (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Overføring til dekselet . (A) Den herdede og trimmede limfilmen (figur 5D) er plassert på dekselet med delvis herdet lim. (B) Eksempel på god kontakt mellom den teksturerte filmen og dekselet. Innsatsen er et optisk bilde som viser jevn kontakt av områdene mellom trapesformede hulrom (mørk ensartet farge). (C) Eksempel på dårlig kontakt mellom den strukturerte filmen og omslagsseddelen. De lysere områdene er ikke i kontakt, de røde pilene peker på disse områdene. Innfellingen er et optisk bilde som viser forskjellig utseende av god kontakt (to til venstre) og dårlig kontakt (to til høyre). Skalastenger (gul, B,C) = 200 μm. (D,E) Riktig prosedyre for å fjerne PDMS flatt underlag: pinsett brukes til å klemme PDMS på kanten med overskudd av PDMS og bøye for å forsiktig skrelle av. (F) Resultatet med UV-limteksturert film vellykket overført til dekselet. (G,H) Eksempel på feil peeling prosedyre: pinsett brukes til å klemme den flate PDMS på en av kantene der overflødig materiale ble trimmet av; Dermed fjernes filmen sammen med den flate PDMS. Forkortelse: PDMS = poly (dimetysiloksan). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Belegg med biomimetisk kopolymer. (A) Cellekulturanordning belagt med biomimetisk kopolymer ved bruk av en løsning på 0,5% (venstre) eller (B) 1% (høyre) (w / v) i ren etanol. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Avgassing av cellekulturenhet. (A) Cellekulturenhet før fullstendig avgassing. (B) Cellekulturenhet etter fullstendig avgassing; (C,D) cellekulturenhet med bare delvis avgassing der luftbobler er fanget i pyramidene. Skalastenger = 200 μm (A-D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Representative lysfeltbilder av cellesåing og vekst av organoider . (A) Celler er synlige flytende på toppen. (B) Celler fanget i pyramidehulene etter å ha skylt bort cellesuspensjonen. Bare fangede celler beholdes som vist. (C) Celler aggregerer for å danne sfæroider i hvert hulrom (dag 2 etter cellesåing). (D) Bilde på dag 15 etter cellesåing av en organoid som har vokst i et pyramidehule. Skalastenger = 200 μm (A B), 120 μm (C) og 150 μm (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: 3D-avbildning av organoider. (A) Tre forskjellige Z-planer ervervet ved hjelp av en spinnskivekonfokal (linse 40x, luft, numerisk blenderåpning: 0,75) av en organoid under nevroektodermdifferensiering (dag 7etter cellesåing). Aktinfarging med falloidin (Alexa Fluor 647) i oransje og N-cadherin immunfarging (Alexa Fluor 561) i blått. (B) En 3D-rekonstruksjon ved hjelp av bildeanalyseprogramvare av de tilsvarende organoider (80 Z-planer, total høyde på 100 μm). Hvite piler: klynger av celler rundt en strek med høyt aktinuttrykk. Blå piler: celleklynger positive for N-cadherin proteinuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13: Frigjøring av organoider. (A) Fjerne det teksturerte klebende laget med pinsett; (B) brightfield-bilde av en organoid suspensjon oppnådd etter fjerning. Skala bar = 200 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: En trinnvis protokoll for mikrofabrikasjon av en Si-form med pyramidale mikrohulrom presenteres. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren for fremstilling av mikrobrønnkulturskålen, som tillater organoidkultur og differensiering med høy tetthet, er beskrevet i dette papiret. På grunn av geometrien og arrangementet av mikrohulrommene, kan tusenvis av sfæroider dyrkes og farges i en enkelt plate i lange perioder (flere uker eller mer) med nesten ingen tap av materiale. Til sammenligning kan et område på 4 mm x 2 mm på cellekulturplaten inneholde så mange sfæroider som en enkelt 384-brønnplate med et areal på 12 cm x 8 cm.
Den regelmessige fordelingen av mikrohulrommene og den flate standarddekselet som brukes som substrat, muliggjør overvåking av tusenvis av levende eller faste organoider i 3D, uten behov for komplisert og tidkrevende prøvemanipulering mellom dyrkingsbeholdere og avbildningsstøtter. På grunn av pyramideformen med en mindre topp enn basen, er det ikke noe tap av organoider på grunn av pipetteringstrinn under mediumutvekslingen, dispensering av ekstracellulære matriser eller fargeprosedyrer. Alle disse trinnene kan utføres direkte, som for et 2D-cellemonolag uten ekstra forholdsregler, i motsetning til klassiske organoidgenereringsteknikker (f.eks. hengende dråper, lave festeplater, Aggrewell).
Dessuten, sammenlignet med disse eksisterende teknikkene, har mikrobrønnene blitt designet for høyoppløselig 3D-bildebehandling kompatibel med alle typer nedsenkningslinser (luft, vann, olje og silisium). Langsiktig vedlikehold av organoider lukket til et flatt glassdeksel gjør cellekulturdekselet kompatibelt med høyoppløselige lysmikroskoper, noe som er umulig med eksisterende metoder uten komplisert håndtering og begeistret organoidoverføring. Videre unngår en optimalisert passiveringsprosedyre adhesjon av celler / organoider for langsiktig kultur, og kontrollerer dermed differensieringen av 3D-kulturen Til slutt, siden det teksturerte klebemiddellaget er flyttbart, kan levende organoider hentes for å utføre andre typer eksperimenter som -omics-analyser eller in vivo-transplantasjon .
Det skal bemerkes at pyramideformen og array-arrangementet av mikrohulrommene som brukes til denne protokollen, er avledet fra den primære formen, som har blitt fremstilt ved hjelp av silisium våtetsing for å gi overflater med speillignende etterbehandling og 45 ° tilbøyelighet for å muliggjøre enkeltobjektiv lysarkmikroskopi (soSPIM11). Mens en diskusjon av disse kravene og en fullstendig beskrivelse av hvordan man produserer slike former finnes andre steder12,13, er det også gitt en enkel protokoll i tilleggsfil 1. Ulike måter å produsere en primærform på er tilgjengelige, som er fullt kompatible med fabrikasjonen av sjetongene i denne protokollen. Laseretsing av glass og høyoppløselig 3D-utskrift, for eksempel, kan brukes til å produsere en primærform med egnede hulrom for inneslutning av organoider, men er ikke egnet for soSPIM-avbildning.
Fabrikasjonsprotokollen beskrevet her kan tilpasses for bruk i ethvert standard biologisk laboratorium, da det ikke kreves dedikerte, avanserte mikrofabrikasjonsverktøy. Noen kritiske trinn i fabrikasjonen av mikrobrønnene er produksjonen gjennom kapillær fylling av den strukturerte limfilmen og overføringen til glasssubstratet. Men etter vår erfaring kan de mestres med høy reproduserbarhet på kort tid. Avstanden mellom pyramidene skal være så liten som mulig for å øke tettheten av hulrom for vekst av organoider, men den må også være stor nok til at hulrommene kan forsegles på underlaget uten lekkasje eller mangel på tetting mellom dem. Vi fant ut at en avstand på 50 μm er et godt kompromiss for dette tilfellet.
Under cellesåing er et kritisk aspekt fjerning av luftbobler fanget inne i hulrommene for å sikre celleinngang. Vi beskriver her en validert løsning, som bare bruker klassisk laboratorieutstyr (f.eks. En ultralyd homogenisator eller en vakuumkrukke). For å tillate bedre homogenisering av antall celler per cellekulturfat, anbefales det å dispensere cellesuspensjonen fra siden av parabolen og ikke rett over dekselet. Lett manuell agitasjon kan også bidra til å homogenisere den cellulære løsningen.
Etter såing av celler kan cellekulturskålen med organoider behandles som enhver annen klassisk kulturstøtte; Ingen spesifikk manipulasjon eller kritiske trinn er nødvendig. Alle protokollene som har blitt brukt med microwell-enhetene, er praktisk talt de samme som de som brukes i retter med lite vedlegg som U-bunnplater. Derfor krever organoidkultur i disse mikrobrønnene ingen endring i kulturforhold sammenlignet med andre standarder.
En annen kritisk faktor er at limet som brukes her er et optisk lim. I den foreslåtte beste bruken (se også applikasjonsnotater fra leverandøren), er to optiske elementer som skal limes justert og UV-herdbart lim påføres på grensesnittet. En første eksponering for UV av en energi som ikke er tilstrekkelig til å forårsake full polymerisering, brukes til å størkne limet samtidig som klebende egenskaper opprettholdes. De optiske komponentene kan flyttes for å oppnå optimal justering, og deretter blir limet fullstendig herdet til sin endelige tilstand med en annen eksponering for UV for å gi permanent vedheft. Energidosene ved første og andre eksponering (dvs. eksponeringstider hvis en kilde med kjent og konstant energitetthet brukes) må optimaliseres avhengig av energitettheten til UV-kilden som brukes, tykkelsen på limlaget, overføringen av UV gjennom de optiske elementene og overflatetekstureringen (eller mangelen på den) på overflaten som skal limes.
Mens vedheftet mellom den strukturerte filmen og den limbelagte dekselet er nødvendig for å være sterk nok til å sørge for lekkasjesikker forsegling, må det også være mulig å fjerne den teksturerte filmen for å hente organoidene etter avbildning, hvis det kreves ytterligere analyse, for eksempel genotypisk profilering. Et korrekt kompromiss mellom lekkasjesikker tetning og evnen til å skrelle av den strukturerte filmen er oppnådd med protokollen beskrevet her, men ytterligere optimalisering av de forherdende og endelige herdetidene for det klebende tynne laget på dekselet kan være nødvendig, da det avhenger av UV-eksponeringssystemet og filmtykkelsen som brukes.
En begrensning i dagens microwells-versjon er i såingsprosedyren; celler må frøes før ECM-komponentene for å tillate dem å komme inn i nærheten av pyramiden. Forbedringer pågår for å belegge mikrobrønnene med ekstracellulære matrikskomponenter, som et første skritt. Vi har ennå ikke utført elektronmikroskopi (EM) på de fikserte organoidene i hulrommene. Noen modifikasjoner av disse fabrikasjons- og cellekulturprotokollene vil være nødvendig før avbildning av organoider i mikrobrønnene med EM blir et levedyktig alternativ.
En naturlig fremtidig utvidelse av denne metoden er å gi screeningkapasitet med høyt innhold for å tillate testing av flere tilstander i en enkelt arbeidsflyt (flerbrønnsplate). Denne cellekulturenheten gir et unikt alternativ til eksisterende organoidteknikker, og tilbyr uovertruffen dyrking og bildebehandlingsgjennomstrømning og åpner nye perspektiver innen organoidforskning for biomedisinsk anvendelse og narkotikaoppdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En internasjonal patentsøknad er publisert med publikasjonsnummer WO 2021/167535 A1.
Acknowledgments
Forskningen støttes av CALIPSO-prosjektet støttet av National Research Foundation, Prime Minister's Office, Singapore, under sitt Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) -program. VV anerkjenner støtten fra NRF-etterforsker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-frøfinansiering og ANR ADGastrulo. AB og GG anerkjenner støtten fra MBIs kjernefinansiering. AB anerkjenner Andor Technologies for lån av BC43 mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
