Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

توليد وتصوير الفئران والكائنات العضوية الظهارية البشرية من الأنسجة الثديية الطبيعية والأورام دون المرور

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64626
Automatic Translation
1,2, 2,3,4,5, 1,2, 1,2, 1,2, 6, 1,2, 2,3,4,5, 1,2,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 6Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

يناقش هذا البروتوكول نهجا لتوليد العضويات الظهارية من الأنسجة الثديية الطبيعية الأولية والأورام من خلال الطرد المركزي التفاضلي. علاوة على ذلك ، يتم تضمين تعليمات للزراعة ثلاثية الأبعاد وكذلك التصوير المناعي للعضويات المدمجة.

Abstract

تعتبر المواد العضوية طريقة موثوقة لنمذجة أنسجة الأعضاء نظرا لخصائصها ذاتية التنظيم والاحتفاظ بالوظيفة والبنية بعد الانتشار من الأنسجة الأولية أو الخلايا الجذعية. تتخلى طريقة توليد الخلايا العضوية هذه عن تمايز الخلية الواحدة من خلال ممرات متعددة وتستخدم بدلا من ذلك الطرد المركزي التفاضلي لعزل الكائنات العضوية الظهارية الثديية عن الأنسجة المنفصلة ميكانيكيا وإنزيميا. يوفر هذا البروتوكول تقنية مبسطة لإنتاج المواد العضوية الظهارية الصغيرة والكبيرة بسرعة من كل من أنسجة الفئران والأنسجة الثديية البشرية بالإضافة إلى تقنيات التضمين العضوي في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم توفير تعليمات للتثبيت داخل الهلام وتلطيخ الفلورسنت المناعي لغرض تصور مورفولوجيا العضوية وكثافتها. هذه المنهجيات مناسبة لعدد لا يحصى من التحليلات النهائية ، مثل الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية ونمذجة ورم خبيث خارج الجسم الحي عبر مقايسة غزو الكولاجين. تعمل هذه التحليلات على توضيح سلوك الخلايا الخلوية بشكل أفضل وخلق فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات داخل البيئة المكروية للورم.

Introduction

كانت القدرة على نمذجة الخلايا الظهارية في المختبر أساس البحوث الطبية الحيوية الحديثة لأنها تلتقط الميزات الخلوية التي لا يمكن الوصول إليها في الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن أن توفر خطوط الخلايا الظهارية المتنامية في مستوى ثنائي الأبعاد تقييما للتغيرات الجزيئية التي تحدث في الخلية الظهارية أثناء الانتشار1. علاوة على ذلك ، فإن قياس التنظيم الديناميكي بين الإشارات والتعبير الجيني محدود في أنظمة الجسم الحي 2. في أبحاث السرطان ، مكنت نمذجة خط الخلايا الظهارية السرطانية من تحديد الدوافع الجزيئية لتطور المرض وأهداف الأدوية المحتملة3. ومع ذلك ، فإن نمو خطوط الخلايا الظهارية السرطانية على مستوى ثنائي الأبعاد له قيود ، حيث أن معظمها يتم تخليده وتعديله وراثيا ، وغالبا ما يكون نسيليا بطبيعته ، ويتم اختياره لقدرته على النمو في ظروف غير فسيولوجية ، ومحدود في تقييمه لبنية أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد (3D) ، ولا يقوم بنمذجة تفاعلات البيئة المكروية بشكل كاف داخل بيئة أنسجة واقعية4. هذه القيود واضحة بشكل خاص في نمذجة ورم خبيث ، والذي يتضمن في الجسم الحي عدة مراحل بيولوجية متميزة ، بما في ذلك الغزو والانتشار والدورة الدموية والاستعمار في موقع العضو البعيد5.

تم تطوير الكائنات العضوية الظهارية للسرطان لتلخيص بيئة 3D وسلوك الأورام6،7،8 بشكل أفضل. تم تطوير المواد العضوية لأول مرة من خلايا سرداب معوية LRG5 + مفردة ومتباينة لتمثيل البنية ثلاثية الأبعاد لوحدات crypt-villus التي حافظت على الهيكل الهرمي للأمعاء الدقيقة في المختبر9. سمح هذا النهج بالتصور والتوصيف في الوقت الفعلي لبنية الأنسجة ذاتية التنظيم في ظل ظروف الاستتباب والإجهاد. كامتداد طبيعي ، تم تطوير العضويات الظهارية للسرطان لنمذجة العديد من أنواع السرطان المختلفة ، بما في ذلك القولون والمستقيم 10 ، والبنكرياس 11 ، والثدي 12 ، والكبد 13 ، والرئة 14 ، والدماغ 15 ، وسرطان المعدة 16. تم استغلال العضويات الظهارية السرطانية لتوصيف تطور السرطان17,18 والسلوكيات الزمانية المكانيةالنقيلي 19,20 واستجواب عدم تجانس الورم 21 ، واختبار العلاجات الكيميائية 22. كما تم عزل الكائنات العضوية الظهارية للسرطان وجمعها خلال التجارب السريرية الجارية للتنبؤ باستجابة المريض للعوامل المضادة للسرطان والعلاج الإشعاعي خارج الجسم الحي8،23،24،25. علاوة على ذلك ، يمكن دمج الأنظمة التي تتضمن عضويات ظهارية سرطانية مع خلايا أخرى غير سرطانية ، مثل الخلايا المناعية ، لتشكيل نموذج أكثر شمولا للبيئة المكروية للورم لتصور التفاعلات في الوقت الفعلي ، والكشف عن كيفية تغيير الخلايا الظهارية السرطانية للطبيعة الأساسية للخلايا المناعية المستجيبة السامة للخلايا مثل الخلايا القاتلة الطبيعية ، واختبار العلاجات المناعية المحتملة والنشاط السام للخلايا المعتمد على الأجسام المضادة26 ، 27,28. توضح هذه المقالة طريقة لتوليد المواد العضوية الظهارية دون المرور والتضمين في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية (ECM). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا مشاركة تقنيات التصوير النهائي للعضويات المعزولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم جمع جميع أنسجة الفئران المستخدمة في هذه المخطوطة بشكل أخلاقي وفقا للوائح وإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) للمركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس. وبالمثل ، وافق جميع المرضى قبل التبرع بالأنسجة تحت إشراف مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ، وتم تحديد العينات.

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول توليد المواد العضوية من الأنسجة الأولية.

1. إعداد المواد بين عشية وضحاها

  1. للتضمين في المصفوفة خارج الخلية في الطابق السفلي (BECM) ، قم بإذابة قسامة BECM عن طريق تركها عند 4 درجات مئوية.

2. تحضير محلول طلاء كولاجيناز وألبومين مصل البقر (BSA)

  1. تحضير محلول طلاء 2.64٪ BSA / PBS (محلول BSA): مرشح معقم 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 4.10 مل من محلول BSA 30٪ باستخدام دورق مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. يمكن تصفية حل BSA هذا واستخدامه مرة أخرى.
  2. تحضير محلول كولاجيناز للأنسجة الثديية للفئران: مرشح معقم 27 مل من وسط الخلايا القاعدية ، 1.5 مل من مصل الجنين البقري (FBS) ، 30 ميكرولتر من 50 مجم / مل جنتاميسين ، 15 ميكرولتر من 10 مجم / مل أنسولين ، 600 ميكرولتر من 0.1 جم / مل كولاجيناز أ ، و 600 ميكرولتر من 0.1 جم / مل من التربسين باستخدام دورق مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. خصص ما بين 10 مل و 30 مل من محلول كولاجيناز لكل ماوس ، اعتمادا على كتلة الأنسجة.
  3. تحضير محلول كولاجيناز لأنسجة الثدي البشرية: مرشح معقم 18 مل من RPMI-1640 ، 200 ميكرولتر من محلول 100x البنسلين والستربتومايسين (قلم / جرطة) ، 200 ميكرولتر من 10 مللي مول 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينإيثان سلفونيك حمض (HEPES) عازلة ، 1 مل من FBS ، و 400 ميكرولتر من 0.1 جم / مل كولاجيناز أ باستخدام دورق مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. خصص ما بين 10 مل و 20 مل لكل عينة من الأنسجة ، اعتمادا على كتلة الأنسجة.

3. إعداد وسائل الإعلام

  1. تحضير الوسائط العضوية: وسط الخلية القاعدية للمرشح المعقم مع 1٪ قلم / بكتيريا ، و 1٪ أنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (ITS) باستخدام قارورة مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. لجعل وسائط عامل النمو العضوي ، أضف عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 نانومتر.
  2. تحضير الوسائط الظهارية الثديية: لصنع 100 مل من الوسائط الظهارية الثديية ، مرشح معقم وسط قاعدي مشترك عالي الجلوكوز مع 1 مل من مكمل الجلوتامين 100x ، 1 مل من القلم / البكتيريا ، 1 مل من 10 مللي مول HEPES buffer (7.3 درجة حموضة) ، 250 ميكرولتر من مخزون 30٪ BSA ، 1 ميكرولتر من 1 مجم / مل مخزون توكسين الكوليرا ، 1 مل من 50 ميكروغرام / مل من مخزون الهيدروكورتيزون في برنامج تلفزيوني ، 50 ميكرولتر من محلول الأنسولين البشري 10 مجم / مل ، و 10 ميكرولتر من مخزون عامل نمو البشرة (EGF) 50 ميكروغرام / مل ، و 1٪ FBS باستخدام دورق مرشح 150 مل / 0.2 ميكرومتر. تخزين الوسائط في 4 درجة مئوية واستخدامها لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  3. تحضير غسل الأمفوتريسين: مرشح معقم PBS مع 2٪ قلم / بكتيريا و 2٪ أمفوتريسين ب. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

4. جمع وهضم الأنسجة

  1. الأنسجة الثديية الفأر
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق وضعه في غرفة CO 2 لمدة2-5 دقائق ، ثم يتبع ذلك بخلع عنق الرحم. مع توجيه الجانب البطني لأعلى ، قم بتحريك أطراف الماوس واستخدم أربع إبر 19 G لتثبيت الماوس من الكفوف على لوح مغطى بوسادة ماصة. رش بالإيثانول بنسبة 70٪ لتنعيم الفراء وتعقيم البشرة. امسح البراز بقطعة شاش أو منديل.
    2. بدءا من المنطقة التناسلية مباشرة ، قم بقطع خط الوسط لأعلى باستخدام مقص جراحي ، مع الحرص على عدم اختراق الصفاق. عند الوصول إلى الذقن ، قم بعمل قطع جانبية لكل من الترقوة والساقين الخلفيتين لأسفل ، وقم بتثبيت جلد الفأر مشدودا على اللوحة لفضح منصات الدهون الثديية.
    3. حدد موقع منصات الدهون الثديية الأربية على الفئران البرية عن طريق تحديد العقدة الليمفاوية الأربية الموجودة بالقرب من الأطراف الخلفية. حدد موقع منصات الدهون الثديية الصدرية على الفئران البرية مثل الأنسجة الوعائية الأكثر سمكا تحت الأطراف الأمامية.
    4. استخدم الملقط لرفع وسادة الدهون الثديية. تجنب جمع العضلات الكامنة. باستخدام الطرف الحاد للمقص الحاد الحاد ، قم بإنشاء جيب أسفل وسادة الدهون الثديية ، بعيدا عن الجلد. قطع وسادة الدهون الثديية في قطعة واحدة كاملة.
    5. بمجرد إزالة ضمادات الدهون الثديية ، اشطفها في برنامج تلفزيوني قبل وضعها في طبق زراعة الأنسجة المعقمة. نقل بسرعة إلى غطاء زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: بالنسبة لأورام الثدي ، استخدم قطعة قطن مبللة ب PBS لدحرجة الورم برفق بعيدا عن الجلد. تأكد من تجنب المناطق الداكنة أو الناعمة ، حيث يشير تغير اللون الداكن إلى النخر ، والذي لن ينتج عنه عضويات صحية.
    6. فرم أورام الثدي بمشرط # 10 أو # 11 لتخفيف الأنسجة حتى تصل إلى قوام يشبه العجينة. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 10-30 مل من محلول كولاجيناز باستخدام مشرط. لضمان جمع جميع الأنسجة ، ماصة 1 مل من محلول كولاجيناز على لوحة زراعة الأنسجة والعودة إلى الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: لإنتاج عضويات أكبر ، يجب تقليل الهضم الميكانيكي ، وترك بعض القطع الصغيرة المرئية من الأنسجة سليمة. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الأنسجة مجمدة لإعدادها لاحقا مع الحد الأدنى من الخسارة في البقاء. للقيام بذلك ، اغسل الأنسجة في محلول من PBS أو وسائط الخلايا القاعدية + 1٪ FBS ، ثم فرم خشن لزيادة مساحة السطح (الحفاظ على الأنسجة في قطعة واحدة أو قطعتين صلبتين). انقل المنديل إلى قنينة باردة ، مع وسائط تجميد (90٪ FBS + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)). قم بتجميد القوارير في حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه طوال الليل قبل الانتقال إلى التخزين في النيتروجين السائل.
    7. ضع الأنبوب المخروطي في حاضنة اهتزاز منضدية 37 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة حتى يصبح النسيج خيطيا ويصبح محلول كولاجيناز غائما. على سبيل المثال ، تستغرق كتلة الأنسجة الكبيرة (حوالي 500-800 ملغ) من الورم 30-60 دقيقة. تستغرق كتلة الأنسجة الأصغر (حوالي 100-300 مجم) من منصات الدهون الثديية من النوع البري حوالي 20-30 دقيقة. إذا لم تكن متأكدا ، فتحقق على فترات 5 دقائق.
    8. بعد الحضانة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالأنبوب المخروطي لمدة 10 دقائق عند 550 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT).
    9. نضح بعناية طاف من الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: من الآن فصاعدا ، قم بتغطية جميع أطراف الماصة والماصات المصلية والأنابيب المخروطية مسبقا بمحلول BSA لتجنب فقدان المواد العضوية بسبب الالتصاق بالبلاستيك.
    10. أضف 8 مل من وسائط الخلايا القاعدية و 80 ميكرولتر من محلول DNase [2 وحدة / ميكرولتر] إلى الأنبوب. اقلب برفق لمدة 1-3 دقائق.
    11. أضف 12 مل من وسائط الخلايا القاعدية إلى الأنبوب واخلطها بعناية عن طريق سحب الأنبوب أو تدويره برفق 15 مرة للخلط.
    12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 550 × ز في RT.
    13. نضح المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسائط الخلايا القاعدية.
    14. دع أثقل شظايا الأنسجة تستقر في القاع. جمع طافت مع ماصة مصلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. يحتوي هذا المعلق على عضويات ظهارية وخلايا انسجة / مناعية.
  2. أنسجة الثدي البشرية
    1. معالجة عينات أنسجة الثدي البشرية للعضويات أو تخزينها في غضون 24 ساعة من جمعها. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية في وسائط CO2-Independent مع 1٪ 100x مضاد حيوي ومضاد للفطريات.
    2. نقل الأنسجة إلى لوحة زراعة الأنسجة. قم بإمالة اللوحة وشفط وسائط التخزين الزائدة ، ثم اشطف المنديل ب 5 مل من غسل الأمفوتريسين ب. قم بإزالة غسول الأمفوتريسين B على الفور.
    3. فرم عينة الأنسجة بمشرط # 10 أو # 11 لفك الأنسجة حتى تصل إلى قوام يشبه العجينة. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 10-30 مل من محلول كولاجيناز باستخدام مشرط. لضمان جمع جميع الأنسجة ، ماصة 1 مل من محلول كولاجيناز على لوحة زراعة الأنسجة والعودة إلى الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: لإنتاج عضويات أكبر ، يجب تقليل الهضم الميكانيكي ، وترك بعض القطع الصغيرة المرئية من الأنسجة سليمة. تراوحت كتلة الأنسجة الأولية لهذا البروتوكول بين 100-250 ملغ. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الأنسجة مجمدة لتحضيرها لاحقا مع الحد الأدنى من الخسارة في الجدوى بعد الخطوة 4.2.2 في 90٪ FBS + 10٪ DMSO على النحو الوارد أعلاه.
    4. ضع الأنبوب المخروطي في حاضنة اهتزاز منضدية 37 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة حتى يصبح النسيج أصغر ويصبح كولاجيناز غائما. افحص المنديل على فترات 5 دقائق. يستغرق تفكك كولاجيناز العينات البشرية حوالي 5-20 دقيقة.
    5. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنبوب المخروطي لمدة 10 دقائق عند 550 × جم في RT.
    6. نضح بعناية طاف من الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: من الآن فصاعدا ، قم بطلاء جميع أطراف الماصة والماصات المصلية والأنابيب المخروطية مسبقا بمحلول BSA لتجنب فقدان المواد العضوية بسبب الالتصاق بالبلاستيك.
    7. أضف 4 مل من وسائط الخلايا القاعدية و 40 ميكرولتر من محلول DNase [2 وحدة / ميكرولتر] إلى الأنبوب المخروطي. اقلب برفق لمدة 3 دقائق.
    8. أضف 6 مل من وسائط الخلايا القاعدية إلى الأنبوب واخلطها بعناية عن طريق سحب الأنبوب المخروطي أو تدويره برفق 15 مرة للخلط.
    9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 550 × ز في RT.
    10. نضح المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط الخلايا القاعدية.
    11. دع أثقل شظايا الأنسجة تستقر في القاع. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يحتوي هذا المعلق على عضويات ظهارية وخلايا انسجة / مناعية.

5. الطرد المركزي التفاضلي

  1. نبض إلى 550 × جم لمدة 3-4 ثوان في RT ، ونضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط الخلايا القاعدية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى (ما مجموعه أربع دورات).
  2. بعد كل طرد مركزي, تأكد من أن الحبيبات تصبح معتمة بشكل متزايد. هذه الحبيبات المتبقية ستكون عضويات ظهارية.

6. جمع المواد العضوية الصغيرة

  1. نبض إلى 80-100 × جم لمدة 3 ثوان في RT. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد مطلي ب BSA ، ثم اخفقه إلى 550 × جم لمدة 3 ثوان في RT لحبيبات الكائنات العضوية الصغيرة.

7. تضمين المواد العضوية في BECM

  1. تعليق مناسب للقسمة من المواد العضوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا لكثافة العضوية بالنسبة لكمية BECM لكل بئر (الجدول 1). على سبيل المثال ، استخدم 50-100 عضوي مقابل 20 ميكرولتر من BECM في بئر واحد من صفيحة 96 بئرا.
    ملاحظة: يمكن حساب كثافة المواد العضوية باستخدام الصيغة التالية: ((متوسط عدد الكائنات العضوية) / 50 ميكرولتر) × عامل التخفيف.
  2. نفذ جميع الخطوات على الجليد. ضع BECM المذاب على الثلج في غطاء زراعة الأنسجة. أثناء تحضير الغطاء ، ضع جميع أطراف الماصة على الثلج لتبرد.
  3. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 300 × جم في RT. تخلص من المادة الطافية من الأنابيب. انقل الأنابيب ذات الكريات العضوية إلى الثلج وأضف الحجم المناسب من BECM إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق (الجدول 1).
    ملاحظة: نظرا لأن BECM لزج ، أضف كميات إضافية (حوالي 10٪ -20٪ إضافية من حجم القبة) من BECM لحساب الخسارة في طرف الماصة.
  4. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق المواد العضوية في BECM ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
  5. قم ببطء وبعناية بسحب المواد العضوية المعلقة BECM على سطح الطلاء. أثناء السحب ، قم بإحضار الماصة ببطء لإنشاء قبة. املأ جميع الآبار الفارغة ب PBS للحفاظ على الرطوبة.
  6. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح ل BECM بالتصلب ، ثم قم بتغطيتها بالحجم المناسب من الوسائط (الجدول 1).

8. تضمين المواد العضوية في الكولاجين

  1. نفذ جميع الخطوات على الجليد. تحضير محلول الكولاجين عن طريق الجمع ، بترتيب تسلسلي ، 375 ميكرولتر من 10x DMEM ، 100 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، و 3 مل من محلول الكولاجين I ذيل الفئران في أنبوب مخروطي 15 مل. مزيج ماصة ، مع الحرص على عدم صنع فقاعات. قم بمعايرة المحلول إلى درجة حموضة 7.2-7.4 بكميات صغيرة (زيادات 1-3 ميكرولتر) من هيدروكسيد الصوديوم أو 10x DMEM حسب الحاجة.
  2. قم بتغطية قاع الآبار بأقل كمية من الكولاجين المطلوبة لتغطية قاع البئر بالكامل. تتمثل إحدى الطرق في وضع كمية صغيرة من الكولاجين وهز الطبق من جانب إلى آخر لتغطيته. اترك طبقات الكولاجين السفلية ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة -2 ساعة.
  3. القسمة التعليق المناسب للعضويات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا لكثافة العضو بالنسبة لكمية الكولاجين لكل بئر (الجدول 1). ضعه في حاضنة 37 درجة مئوية.
  4. قم بتخزين محلول الكولاجين في درجة حرارة 4 درجات مئوية ومراقبة البلمرة عن طريق التحقق من تكوين الألياف تحت المجهر كل 10 دقائق. سيصل الكولاجين إلى البلمرة المناسبة بين 30 دقيقة و 2 ساعة.
    ملاحظة: يمكن تحديد البلمرة المناسبة من خلال وجود ألياف متفرعة في جميع أنحاء المصفوفة. انتقل إلى الخطوة 8.5 على الفور بمجرد ملاحظة بعض الألياف في مجال الرؤية.
  5. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في 300 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية من الأنابيب. انقل الكريات العضوية إلى الثلج وأضف الحجم المناسب من الكولاجين إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق (الجدول 1).
    ملاحظة: نظرا لأن الكولاجين لزج ، أضف كميات إضافية (حوالي 10٪ -20٪ إضافية من حجم القبة) من الكولاجين لحساب الخسارة في طرف الماصة.
  6. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لإعادة تعليق المواد العضوية في الكولاجين ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
  7. قم ببطء وبعناية بسحب المواد العضوية المعلقة بالكولاجين على سطح الطلاء. أثناء السحب ، قم بإحضار الماصة ببطء لإنشاء قبة. املأ جميع الآبار الفارغة ب PBS للحفاظ على الرطوبة.
  8. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للكولاجين بالتصلب ، ثم قم بتغطيتها بالحجم المناسب من الوسائط (الجدول 1).
  9. ملاحظة: تحافظ المواد العضوية على الصلاحية في مصفوفة 3D لمدة تصل إلى 7 أيام. إذا تم استخدام التصوير للتحليل ، فانتقل إلى الخطوتين 9 و 10.

9. إصلاح المواد العضوية المضمنة

  1. استخدم ماصة لإزالة جميع الوسائط من الآبار دون الاتصال بقباب ECM.
  2. ثبت بمحلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA) / PBS لمدة 5 دقائق.
  3. اغسل مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق تطبيق برنامج تلفزيوني على الآبار بعد وضعها على شاكر يتحرك ببطء. بعد الغسيل ، ضعي برنامج تلفزيوني طازج على القباب وخزني الطبق على حرارة 4 درجات مئوية.

10. تلطيخ مناعي من المواد العضوية المدمجة

  1. تحضير حلول للتلطيخ المناعي
    1. المخزن المؤقت للنفاذية: قم بإعداد حل PBS بنسبة 10٪ Triton X-100.
    2. حظر المخزن المؤقت: قم بإعداد حل PBS بنسبة 10٪ FBS و 0.2٪ Triton X-100.
    3. المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة: قم بإعداد محلول PBS باستخدام 2٪ FBS و 0.2٪ Triton X-100.
  2. النفاذية والحجب
    1. ماصة كافية العازلة نفاذية لتغطية قباب ECM. احتضان لمدة 1 ساعة في RT على شاكر يتحرك ببطء.
    2. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية باستخدام ماصة وقم بتطبيق نفس الحجم من المخزن المؤقت للحظر لمدة 3 ساعات.
  3. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع باستخدام ماصة وقم بتطبيق المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة الذي يحتوي على الجسم المضاد الأساسي بتركيزات محددة من قبل الشركة المصنعة. احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة على شاكر بطيء الحركة.
    2. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS في RT على شاكر يتحرك ببطء.
  4. حضانة الأجسام المضادة الثانوية والبقع النووية
    1. قم بنضح غسول PBS المتبقي وقم بتطبيق المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي بتركيزات محددة من قبل الشركة المصنعة. بالإضافة إلى ذلك ، أضف DAPI أو Hoechst (لتسمية النوى) أو phalloidin (لتسمية الأكتين) إلى المخزن المؤقت بنسبة 1: 250. احتضان لمدة 2-4 ساعات في RT على شاكر بطيء الحركة.
    2. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني في RT على شاكر. قم بتخزين العينات في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقدم الصور الموضحة في الشكل 1 مثالا على العضويات الطلائية الثديية من النوع البري والورم من أنسجة الإنسان والفئران. يتم توفير رسم توضيحي سريع لطريقة عزل الكائنات العضوية الظهارية من خلال الطرد المركزي التفاضلي في سير عمل الرسوم المتحركة في الشكل 1 أ ، مما يدل على أنه يمكن معالجة الأنسجة الأولية من الأنواع المختلفة بطرق شبه متطابقة مع إنتاج الأنسجة الظهارية كما هو موضح في صور برايت فيلد (الشكل 1 ب ). علاوة على ذلك ، يمكن رؤية أوجه التشابه في تكوين الأنسجة بين الأنواع في الصور المناعية للعضويات المدمجة إما في مصفوفة خارج الخلية القاعدية أو الكولاجين المعروض في الشكل 2A-D. يمكن تصور الهيكل العضوي إما من خلال وضع العلامات على غشاء الطماطم (mTomato) أو تلطيخ phalloidin للأكتين. توضح هذه الأرقام أيضا التركيب والحجم العضوي المتوقع باستخدام هذه الطريقة. يمكن استخدام المواد العضوية المضمنة في مصفوفة الكولاجين لفحص الغزو وتحليلها من خلال تتبع تمدد المحلاق المتفرع من العضو نفسه ، كما هو موضح في الشكل 2C. أخيرا ، يظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) للعضويات المضمنة في البارافين أن المواد العضوية تحافظ على نفس أنسجة سرطان الثدي (الشكل 2E).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لتوليد العضويات الطلائية مع أمثلة على الكائنات العضوية. (أ) مخطط سير العمل لتوليد العضويات من الفأر أو الأنسجة البشرية دون المرور. (ب) صور تمثيلية للعضويات الظهارية المعزولة من الغدد الثديية WT للفأر ، وأورام الثدي في الفأر ، وأورام الثدي البشرية في الوسائط بعد العزل. تم ضبط كل صورة على حدة للسطوع والتباين لتحسين التصور. تم التقاط الصور في برايت فيلد على مجهر فلوري مقلوب عند تكبير 10x. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. تم عزل أورام الثدي من الفئران MMTV-PyMT. تم عزل الأنسجة الثديية الطبيعية من الفئران FVB. تراوحت الفئران من 8-14 أسبوعا من عمر29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصوير العضويات في المصفوفة خارج الخلية. تم ضبط كل صورة على حدة للسطوع والتباين لتحسين التصور لهذه المجموعة. قبل التصوير ، تم تثبيت العينات بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد. تم تلطيخ العينات من النوع البري ب phalloidin 568 لتصور غشاء الخلية وتم تلطيخ جميع العينات باستخدام Hoechst لتصور النوى ، مما يدل على مورفولوجيا العضوية وكثافتها. تم التقاط الصور بتكبير 10x على مجهر متحد البؤر وتم تكبيرها بشكل أكبر باستخدام تكبير مسح ضوئي يبلغ 3.003. كان الطول الموجي الليزري المستخدم للكشف عن DAPI 405 نانومتر بقوة 5 وكان الطول الموجي بالليزر المستخدم للكشف عن phalloidin 561.0 نانومتر للقناة 3 بقوة 0.5. تم الحفاظ على حجم الثقب البؤري عند 19.16 لجميع الصور. (أ) صورة برايتفيلد التمثيلية للفأر الثديي WT العضوي المضمن في BECM في اليوم 0. (A') 1:250 نوى وسم Hoechst و (A'') 1: 250 صور الفلورسنت المناعي للأكتين ل A. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. تم عزل الأنسجة الثديية الطبيعية من الفئران FVB. تراوحت الفئران من 8-12 أسبوعا من العمر. (ب) صورة برايتفيلد التمثيلية لورم الثدي الفأر العضوي المضمن في BECM في اليوم 0. (B') 1: 250 نوى وسم Hoechst و (B'') صورة الفلورسنت المناعي الموسومة بالطماطم ل B. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. تم عزل أورام الثدي من الفئران MMTV-PyMT. تراوحت الفئران من 12-14 أسبوعا من العمر. (ج) صورة برايتفيلد التمثيلية لورم الثدي الفأر العضوي المضمن في الكولاجين الأول في اليوم 3. تمثل الصورة عضويا يوضح خاصية "غازية". (C') 1: 250 نوى وسم Hoechst و (C') صورة الفلورسنت المناعي الموسومة بالطماطم لشريط مقياس C. يمثل 20 ميكرومتر. تم عزل أورام الثدي من الفئران MMTV-PyMT. تراوحت الفئران من 12-14 أسبوعا من العمر. (د) صورة برايتفيلد التمثيلية لورم الثدي البشري المدمج في BECM في اليوم 0. (د') نوى وسم Hoechst و (D'') 1: 250 صورة الفلورسنت المناعي الموسومة بالقضيبيدين التي تستهدف الأكتين لشريط مقياس D. يمثل 20 ميكرومتر. (E) صورة مجزأة لعضو عضوي مضمن في BECM وملطخة ب H&E مأخوذة بتكبير 20x. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. تم إجراء تلطيخ H& E بواسطة المورد المشترك30 لإدارة الأنسجة بجامعة تكساس الجنوبية الغربية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لوحة الثقافة حجم قبة ECM العدد الموصى به من المواد العضوية حجم الوسائط
لوحة 6 آبار 200 ميكرولتر 300 3 مل
لوحة 12 بئر 150 ميكرولتر 225 2 مل
لوحة 24 بئر 100 ميكرولتر 150 1 مل
لوحة 48 بئر 40 ميكرولتر 60 300 ميكرولتر
لوحة 96 بئر 20 ميكرولتر 30 150 ميكرولتر

الجدول 1: الحجم الموصى به لمكونات ECM للقباب ، وكثافة المواد العضوية ، وحجم الوسائط اللازمة لكل بئر على لوحات الاستزراع المختلفة.

مشكلة السبب المحتمل حل
لقد انهارت قباب ECM. اهتزت اللوحة ، وكان حجم ECM كبيرا جدا بحيث لا يمكن الحفاظ على شكل القبة ، أو كانت القباب تلامس حافة البئر ، مما تسبب في الالتصاق والسقوط. تجنب تحريك اللوحة بقوة كبيرة قبل تثبيت القباب ، أو تقليل حجم ECM المستخدم لإعادة تعليق المواد العضوية ، أو توخي الحذر الشديد لامتصاص القباب في وسط اللوحة.
هناك أنسجة لا تشبه المواد العضوية. ربما تم جمع الأنسجة العضلية أو الأعصاب في عملية حصاد وسادة الدهون الثديية. فقط قطع ما هو واضح وسادة الدهون الثديية. تجنب إزالة الأنسجة الملتصقة بإحكام بالجلد.
هناك العديد من المواد العضوية الميتة. تم حصاد أنسجة الورم النخرية. تجنب جمع الأنسجة من الأورام الميتة أو الكيسية أو شديدة النعومة أو أغمق في اللون. يجب أن تكون أنسجة الورم صلبة.
هناك خلايا مفردة أكثر من الكائنات العضوية. تم فرم الأنسجة ناعما جدا ، أو تم تشغيل هضم الكولاجيناز لفترة طويلة جدا. تجنب الإفراط في فرم الأنسجة أو تقليل وقت حضانة الكولاجيناز.
هناك فقاعات في ECM. كانت إعادة التعليق عن طريق السحب قوية للغاية ، وكان الطرد أثناء سحب القباب سريعا جدا. أعد تعليق المواد العضوية ببطء في ECM وقم بسحبها ببطء في القباب. إذا استمرت المشكلة ، فتجنب الذهاب إلى المحطة الثانية أثناء سحب الماصة.
لا يوجد غزو للمواد العضوية داخل الكولاجين. لم يتم بلمرة الكولاجين بشكل صحيح أو الإفراط في البلمرة. لا تقم بإعادة تعليق العضو العضوي في الكولاجين حتى يتبلمر بشكل صحيح. تحقق كل 30 دقيقة. إذا لم تكن البلمرة مرئية ، فأعد التعليق عند علامة 2 ساعة واللوحة على الفور.
لا توجد ألياف كولاجين مرئية أثناء مراقبة البلمرة. إعدادات المجهر لم تكن مواتية. اضبط تباين الطور للحصول على أقصى قدر من الظلام ، ثم ارفع سطوع المجهر بالكامل. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤدي زيادة التكبير إلى تحسين المشاهدة.
تم حل قباب ECM. كان وقت التثبيت طويلا جدا ، أو لم تتم إزالة PFA تماما من العينات المضمنة في ECM. حافظ على وقت تثبيت قباب ECM أقل من 5 دقائق وتابع بخمس غسلات على شاكر دوار لمدة 5 دقائق لكل منها.

الجدول 2: جدول المشاكل المحتملة والأسباب والحلول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم وصف طرق مختلفة في الأدبيات لتوليد عضويات الورم. يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتوليد عضويات الورم مباشرة من الورم دون المرور. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن إنتاج عضويات الورم في غضون ساعات من بدء الإجراء وتوليد ما يقرب من 100٪ من المواد العضوية القابلة للحياة مقارنة ب 70٪ المبلغ عنها في الأدبيات31. وبالمقارنة ، تتطلب الطرق الأخرى المرور التسلسلي للخلايا إلى عضويات على مدى عدة أسابيع. وبالتالي ، فإن التطبيقات النهائية ، مثل تحديد وتصور تفاعلات الخلايا المناعية مع العينات العضوية والمناعية المتطابقة من نفس المضيف دون تأثير الثقافة طويلة الأجل ، تصبح أكثر جدوى. علاوة على ذلك ، كما هو موضح في الشكل 2C ، فإن تضمين عضويات الورم في مصفوفات مختلفة خارج الخلية يمكن أن يسمح بتحديد الأنماط الظاهرية الرئيسية في جميع أنحاء السلسلة النقيلية ، مثل غزو الورم الرئيسي. تشمل التطبيقات النهائية الأخرى فحوصات النمط الظاهري للتشكلالمتفرع 32 ، والغزو ، والنشر ، وتشكيل المستعمرة33 لتقييم سلوكيات الخلايا الظهارية المختلفة. يمكن أيضا التقاط التفاعلات المناعية وظيفيا وبصريا باستخدام هذه المقايسات العضوية. علاوة على ذلك ، يمكن إذابة المواد الهلامية لعزل الخلايا المدمجة للتحليل النهائي للمحتوى الجيني والبروتيني باستخدام المقايسات البيوكيميائية القياسية والقائمة على التدفق. أخيرا ، نظرا لأنه يمكن توليد كميات كبيرة من المواد العضوية بسرعة من أنسجة الورم ، يمكن توسيع نطاق هذه المقايسات لتطبيقات فحص الأدوية ودمجها في سير عمل التجارب السريرية.

هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي تعتبر حاسمة لهذا البروتوكول. أولا ، يعتمد مقدار الوقت اللازم لهضم الكولاجيناز على تكوين الأنسجة وكمية الأنسجة التي يتم هضمها. على سبيل المثال ، عند العمل مع قطع أصغر من الأنسجة ، مثل العينات الجراحية لأورام الثدي البشرية (في المتوسط 100-250 ملغ) ، يلزم وقت أقصر للهضم. ومع ذلك ، فإن أورام الثدي التي يتم حصادها من الفأر أكبر بكثير في الحجم (500-800 ملغ) وقد تتطلب 30-60 دقيقة من الهضم الأنزيمي. ثانيا ، لضمان أقصى عائد من المواد العضوية الظهارية ، من المهم أيضا طلاء جميع أطراف الماصة والماصات المصلية ب BSA لتجنب الخسارة الناتجة عن التصاق الخلايا بالبلاستيك. ثالثا ، يعد وقت الطرد المركزي التفاضلي القصير أمرا بالغ الأهمية للتخلص من مكونات الأنسجة غير الظهارية. يسمح هذا النهج للعضويات الظهارية الأثقل بالحبيبات بينما تبقى الأجزاء اللحمية والمناعة الأخف في المادة الطافية. لإنشاء مقايسات الغزو عن طريق تضمين المواد العضوية في الكولاجين ، من الأهمية بمكان السماح ببلمرة الكولاجين بشكل صحيح قبل تضمين المواد العضوية. يجب التحقق من هذه الخطوة بصريا عن طريق تأكيد تكوين ألياف الكولاجين تحت المجهر الضوئي. أخيرا ، للحصول على أفضل نتائج التصوير ، احرص على تجنب إنتاج الفقاعات عند تعليق المواد العضوية في ECM والطلاء. سوف تحجب الفقاعات المواد العضوية داخل الجل وتشوه الصور. ويورد الجدول 2 المشاكل المحتملة التي تمت مواجهتها والحلول للتغلب على هذه التحديات.

تسمح بعض الخطوات في البروتوكول بإجراء تعديلات لتخصيص حجم المواد العضوية التي تم إنشاؤها أو تقليل الوقت اللازم لتنفيذ البروتوكول. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي زيادة مدة وقت الهضم الميكانيكي إلى وقت هضم كولاجيناز أقصر ، وعضويات أصغر ، والمزيد من الخلايا الفردية. يمكن تقصير الطرد المركزي بعد هضم الكولاجيناز إلى 5 دقائق إذا كنت تعمل مع كمية كبيرة من أنسجة الورم. يمكن تحضير الوسائط المستخدمة لزراعة وزراعة المواد العضوية قبل يوم واحد لتوفير الوقت أثناء خطوات توليد المواد العضوية. وبالمثل ، يمكن تخزين أنسجة الورم لمدة تصل إلى 24 ساعة في الوسائط المناسبة قبل التحضير العضوي. إذا كان الوقت محدودا للغاية ، يتضمن هذا البروتوكول إيقاف الخطوات مؤقتا عن طريق تجميد أنسجة الورم في يوم الجمع. بعد ذلك ، يمكن استخدام هذه الأنسجة المجمدة لتوليد عضويات قابلة للحياة في وقت لاحق. ما يقرب من 90 ٪ من المواد العضوية المشتقة من الأنسجة المجمدة كانت قابلة للحياة ، وتم تأكيدها بصريا تحت المجهر الضوئي وبمحلول أزرق تريبان.

هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. في حين أن هذا النهج يولد عضويات قابلة للحياة بسرعة ، فإن كمية المواد العضوية المتولدة محدودة بكمية أنسجة الورم. يصبح هذا القيد واضحا بشكل خاص عند العمل مع العينات السريرية التي تكون فيها كمية أنسجة الورم أقل أو ، في بعض الأحيان ، تقتصر على عدد قليل من الخلايا. في تلك الحالات القصوى حيث يمكن استعادة عدد قليل فقط من الخلايا كمواد أولية ، قد يكون المرور خيارا أفضل. قيد آخر هو النهج الاختزالي لهذه الطريقة. إزالة المقصورات اللحمية مثل الخلايا الليفية أو الخلايا البطانية تثري توليد العضوية الظهارية. ومع ذلك ، فإن مجموعات الخلايا هذه ضرورية لوظيفة الورم. لذلك ، فإن إزالتها تحد من تفسير بيولوجيا الورم المستمدة فقط من النماذج العضوية الظهارية. في الختام ، يوفر هذا البروتوكول نهجا للتوليد السريع للعضويات الظهارية للاستخدام الفوري في التصوير النهائي ، والوظيفية (بما في ذلك التفاعلات المناعية) ، وتطبيقات فحص الأدوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة بتمويل مقدم من METAvivor ، و Peter Carlson Trust ، ومؤسسة أبحاث تيريزا ، ومركز NCI/UTSW Simmons للسرطان P30 CA142543. نحن نعترف بمساعدة المورد المشترك لإدارة الأنسجة بجامعة تكساس الجنوبية الغربية ، وهو مورد مشترك في مركز سيمونز الشامل للسرطان ، والذي يدعمه جزئيا المعهد الوطني للسرطان بموجب رقم الجائزة P30 CA142543. شكر خاص لجميع أعضاء مختبر تشان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM HEPES Buffer Gibco  15630080
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco  15240-096
100x Glutamax Life Technologies  35050-061 Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)  Life Technologies  51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Sigma  P4333
10x DMEM Sigma  D2429
50 mL/0.2 µm filter flask Fisher  #564-0020
Amphotericin B Life Technologies  15290-018
bFGF Sigma F0291
BSA Solution (32%) Sigma  #A9576
Cholera Toxin  Sigma  C8052
CO2-Independent Medium  Gibco 18045-088
Collagenase A  Sigma  C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) Sigma D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma D6546 Common basal medium
D-MEM/F12  Life Technologies  #10565-018 Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)  Sigma #D8662 PBS
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F0926
Gentamicin  Life Technologies  #15750-060
Human epidermal growth factor (EGF) Sigma  E9644
Hydrocortisone  Sigma  H0396
Insulin  Sigma  #I9278
Matrigel  Corning  #354230 Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N) Sigma  S2770
Rat Tail Collagen I Corning  354236
RPMI-1640 media Fisher  SH3002701
Trypsin  Life Technologies  27250-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 189 ،
توليد وتصوير الفئران والكائنات العضوية الظهارية البشرية من الأنسجة الثديية الطبيعية والأورام دون المرور
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornelius, S. L., Colonnetta, M. M., … More

Cornelius, S. L., Colonnetta, M. M., Lake, K. E., Smith, C. A., Zhang, Y. A., Roussos-Torres, E. T., Reddy, S. M., Chen, E. H., Chan, I. S. Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging. J. Vis. Exp. (189), e64626, doi:10.3791/64626 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter