Summary
Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.
Abstract
Os organoides são um método confiável para modelar o tecido do órgão devido às suas propriedades auto-organizadas e retenção de função e arquitetura após a propagação do tecido primário ou células-tronco. Este método de geração de organoides renuncia à diferenciação unicelular através de múltiplas passagens e, em vez disso, usa centrifugação diferencial para isolar organoides epiteliais mamários de tecidos dissociados mecanicamente e enzimaticamente. Este protocolo fornece uma técnica simplificada para a produção rápida de organoides epiteliais pequenos e grandes a partir de tecido mamário humano e camundongo, além de técnicas para incorporação de organoides no colágeno e na matriz extracelular do porão. Além disso, instruções para fixação em gel e coloração imunofluorescente são fornecidas com a finalidade de visualizar a morfologia e a densidade organoides. Essas metodologias são adequadas para uma miríade de análises a jusante, como a co-cultura com células imunes e a modelagem de metástases ex vivo por meio de ensaio de invasão de colágeno. Essas análises servem para elucidar melhor o comportamento célula-célula e criar uma compreensão mais completa das interações dentro do microambiente tumoral.
Introduction
A capacidade de modelar células epiteliais in vitro tem sido a base da pesquisa biomédica moderna, porque captura características celulares que não são acessíveis in vivo. Por exemplo, o crescimento de linhagens celulares epiteliais em um plano bidimensional pode fornecer uma avaliação das mudanças moleculares que ocorrem em uma célula epitelial durante a proliferação1. Além disso, a mensuração da regulação dinâmica entre sinalização e expressão gênica é limitada em sistemas in vivo 2. Na pesquisa do câncer, a modelagem da linhagem celular epitelial do câncer permitiu a identificação de fatores moleculares da progressão da doença e potenciais alvos de drogas3. No entanto, o crescimento de linhagens celulares epiteliais cancerígenas em um plano bidimensional tem limitações, pois a maioria é geneticamente imortalizada e modificada, muitas vezes de natureza clonal, selecionada por sua capacidade de crescer em condições não fisiológicas, limitada em sua avaliação da arquitetura do tecido tumoral tridimensional (3D) e não modela adequadamente as interações microambientais dentro de um ambiente tecidual realista4. Essas restrições são particularmente evidentes na modelagem de metástases, que in vivo inclui vários estágios biológicos distintos, incluindo invasão, disseminação, circulação e colonização no local distante do órgão5.
Organoides epiteliais cancerígenos têm sido desenvolvidos para melhor recapitular o ambiente 3D e o comportamento dos tumores 6,7,8. Os organoides foram desenvolvidos pela primeira vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ únicas e diferenciados para representar a estrutura 3D de unidades cripta-vilosas que mantiveram a estrutura hierárquica do intestino delgado in vitro9. Essa abordagem permitiu a visualização e caracterização em tempo real da arquitetura de tecidos auto-organizados sob condições homeostáticas e de estresse. Como uma extensão natural, os organoides epiteliais do câncer foram desenvolvidos para modelar muitos tipos diferentes de câncer, incluindo câncer colorretal 10, pancreático 11, mama 12, fígado 13, pulmão 14, cérebro 15 e câncer gástrico 16. Organoides epiteliais oncológicos têm sido explorados para caracterizar a evolução do câncer17,18 e comportamentos espaço-temporais metastáticos19,20 e interrogar a heterogeneidade tumoral21, e testar quimioterapias 22. Organoides epiteliais do câncer também foram isolados e coletados durante ensaios clínicos em andamento para predizer a resposta do paciente a agentes anticancerígenos e radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Além disso, os sistemas que incorporam organoides epiteliais cancerígenos podem ser combinados com outras células não cancerígenas, como células imunes, para formar um modelo mais abrangente do microambiente tumoral para visualizar interações em tempo real, descobrir como as células epiteliais cancerígenas alteram a natureza fundamental das células imunes efetoras citotóxicas, como as células natural killer, e testar potenciais imunoterapias e atividade citotóxica dependente de anticorpos26, 27,28. Este artigo demonstra um método de geração de organoides epiteliais sem passar e incorporar colágeno e matriz extracelular basal (MEC). Além disso, técnicas para imagens a jusante de organoides isolados também são compartilhadas.
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Protocol
Todo o tecido de camundongo utilizado neste manuscrito foi coletado eticamente de acordo com os regulamentos e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. Da mesma forma, todos os pacientes consentiram antes da doação de tecidos sob a supervisão de um Comitê de Revisão Institucional (IRB), e as amostras foram desidentificadas.
NOTA: Este protocolo descreve a geração de organoides a partir do tecido primário.
1. Preparação noturna de materiais
- Para a incorporação na matriz extracelular de cave (BECM), descongelar a alíquota BECM deixando-a a 4 °C.
2. Preparação da solução de revestimento de colagenase e albumina sérica bovina (BSA)
- Preparar solução de revestimento BSA/PBS a 2,64% (Solução BSA): Filtro estéril 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 4,10 mL de solução BSA a 30% usando um frasco filtrante de 50 mL/0,2 μm. Esta solução BSA pode ser filtrada e usada novamente.
- Preparar solução de colagenase para tecido mamário de rato: Filtro estéril 27 ml de meio basocelular, 1,5 ml de soro fetal bovino (FBS), 30 μL de 50 mg/ml de gentamicina, 15 μL de 10 mg/ml de insulina, 600 μL de 0,1 g/ml de colagenase A e 600 μL de tripsina 0,1 g/ml utilizando um balão de filtro de 50 ml/0,2 μm. Alocar entre 10 mL e 30 mL de solução de colagenase por camundongo, dependendo da massa tecidual.
- Preparar solução de colagenase para tecido mamário humano: Filtro estéril 18 mL de RPMI-1640, 200 μL de 100x solução de penicilina-estreptomicina (pen/estreptococo), 200 μL de 10 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico ácido (HEPES) Tampão 1 mL de FBS e 400 μL de 0,1 g/mL de colagenase A usando um frasco de filtro de 50 mL/0,2 μm. Aloque entre 10 mL e 20 mL por amostra de tecido, dependendo da massa tecidual.
3. Preparação de mídia
- Preparar meios organoides: Meio basocelular filtrado estéril com caneta/estreptococo a 1% e Insulina-Transferrina-Selênio (ITS) a 1% usando um frasco filtrante de 50 mL/0,2 μm. Para fazer o meio do fator de crescimento organoide, adicione o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a uma concentração final de 2,5 nM.
- Preparar meios epiteliais mamários: Fazer 100 mL de meio epitelial mamário, filtro estéril de meio basal comum de alta glicose com 1 mL de suplemento de glutamina 100x, 1 mL de caneta/estreptococo, 1 mL de tampão HEPES de 10 mM (7,3 pH), 250 μL de estoque de 30% de BSA, 1 μL de estoque de toxina de cólera de 1 mg/mL, 1 mL de estoque de hidrocortisona de 50 μg/mL em PBS, 50 μL de 10 mg/mL de solução de insulina humana, 10 μL de 50 μg/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) e 1% de FBS usando um frasco de filtro de 150 mL/0,2 μm. Conservar o suporte a 4 °C e utilizar até 2 semanas.
- Preparar lavagem anfotericina: Filtro estéril PBS com 2% de pen/estreptococo e 2% de anfotericina B. Armazenar a 4 °C.
4. Coleta e digestão de tecidos
- Tecido mamário de rato
- Eutanasie o rato colocando em uma câmara de CO 2 por2-5 minutos e, em seguida, siga com luxação cervical. Com o lado ventral voltado para cima, jogue os membros do rato e use quatro agulhas de 19 G para prender o rato pelas patas a uma tábua coberta com uma almofada absorvente. Pulverize com etanol a 70% para suavizar a pele e higienizar a pele. Limpe as fezes com uma gaze ou lenço de papel.
- Começando logo acima da região anogenital, corte para cima a partir da linha média usando tesoura cirúrgica, tomando cuidado para não perfurar o peritônio. Ao chegar ao queixo, faça cortes laterais nas clavículas e nas patas traseiras e prenda a pele do rato esticada à prancha para expor as almofadas de gordura mamária.
- Localize as almofadas de gordura mamária inguinal em camundongos do tipo selvagem, identificando o linfonodo inguinal localizado perto dos membros posteriores. Localize as almofadas de gordura mamária torácica em camundongos do tipo selvagem como o tecido vascularizado mais espesso sob os membros dianteiros.
- Use fórceps para elevar a almofada de gordura mamária. Evite coletar músculo subjacente. Usando a extremidade contundente da tesoura afiada, crie um bolso sob a almofada de gordura mamária, longe da pele. Corte a almofada de gordura mamária em uma peça completa.
- Uma vez que as almofadas de gordura mamária tenham sido removidas, enxágue em PBS antes de colocá-las em um prato de cultura de tecidos estéreis. Transfira rapidamente para um exaustor de cultura de tecidos.
NOTA: Para tumores mamários, use um cotonete molhado com PBS para rolar suavemente o tumor para longe da pele. Certifique-se de evitar áreas escurecidas ou macias, pois a descoloração escura indica necrose, o que não produzirá organoides saudáveis. - Pice os tumores mamários com um bisturi # 10 ou # 11 para soltar o tecido até que atinja uma consistência semelhante a uma pasta. Transfira o tecido picado para um tubo cônico contendo 10-30 mL de solução de colagenase usando um bisturi. Para garantir que todo o tecido seja coletado, pipete 1 mL de solução de colagenase para a placa de cultura de tecidos e de volta para o tubo cônico.
NOTA: Para produzir organoides maiores, a digestão mecânica deve ser minimizada, deixando alguns pequenos pedaços visíveis de tecido intactos. Alternativamente, o tecido pode ser armazenado congelado para posterior preparação organoide com perda mínima de viabilidade. Para fazer isso, lave o tecido em uma solução de PBS ou meio basocelular + 1% FBS e, em seguida, pice grosseiramente para aumentar a área de superfície (mantendo o tecido em um ou dois pedaços sólidos). Mova o tecido para um frasco para criofrascos, no topo com meios de congelamento (90% FBS + 10% dimetilsulfóxido (DMSO)). Congele os frascos para injetáveis num recipiente de congelação de taxa controlada durante a noite antes de passar para o armazenamento em azoto líquido. - Colocar o tubo cónico numa incubadora de agitação de bancada a 37 °C a 180 RPM até que o tecido se torne fibroso e a solução de colagenase fique turva. Por exemplo, uma grande massa de tecido (cerca de 500-800 mg) de um tumor leva 30-60 min. Uma massa de tecido menor (cerca de 100-300 mg) de almofadas de gordura mamária do tipo selvagem leva cerca de 20-30 min. Se não tiver certeza, verifique em intervalos de 5 minutos.
- Após incubação, centrifugar o tubo cônico por 10 min a 550 x g à temperatura ambiente (RT).
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo cônico.
NOTA: Avançando, pré-cubra todas as pontas da pipeta, pipetas sorológicas e tubos cônicos com solução BSA para evitar a perda de organoides devido à adesão ao plástico. - Adicionar 8 mL de meio basocelular e 80 μL de solução de DNase [2 U/μL] ao tubo. Inverta suavemente por 1-3 min.
- Adicione 12 mL de meio basocelular ao tubo e misture cuidadosamente pipetando ou gire suavemente o tubo 15 vezes para misturar.
- Centrífuga por 10 min a 550 x g em RT.
- Aspirar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o pellet em 12 mL de meio basocelular.
- Deixe os fragmentos de tecido mais pesados se depositarem no fundo. Recolher o sobrenadante com uma pipeta serológica e transferir para um tubo cónico de 15 ml. Esta suspensão contém organoides epiteliais e células estromais/imunitárias.
- Tecido mamário humano
- Processar as amostras de tecido mamário humano para organoides ou armazená-las dentro de 24 horas após a coleta. Armazenar as amostras a 4 °C em meio independente de CO2 com 1% de antibiótico-antimicótico a 100x.
- Transfira o tecido para uma placa de cultura de tecidos. Incline a placa e aspirar o meio de armazenamento em excesso e, em seguida, enxaguar o tecido com 5 mL da lavagem com anfotericina B. Retire imediatamente a lavagem com anfotericina B.
- Pique a amostra de tecido com um bisturi #10 ou #11 para soltar o tecido até que ele atinja uma consistência semelhante a uma pasta. Transfira o tecido picado para um tubo cônico contendo 10-30 mL de solução de colagenase usando um bisturi. Para garantir que todo o tecido seja coletado, pipete 1 mL de solução de colagenase para a placa de cultura de tecidos e retorne ao tubo cônico.
NOTA: Para produzir organoides maiores, a digestão mecânica deve ser minimizada, deixando alguns pequenos pedaços visíveis de tecido intactos. A massa tecidual inicial para este protocolo variou entre 100-250 mg. Alternativamente, o tecido pode ser armazenado congelado para posterior preparação organoide com perda mínima de viabilidade após a etapa 4.2.2 em 90% FBS + 10% DMSO, conforme acima. - Coloque o tubo cônico em uma incubadora de agitação de bancada de 37 °C a 180 RPM até que o tecido se torne menor e a colagenase fique turva. Verifique o tecido em intervalos de 5 minutos. A dissociação da colagenase de amostras humanas leva cerca de 5-20 min.
- Após a incubação, girar o tubo cônico por 10 min a 550 x g no RT.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo cônico.
NOTA: Avançando, pré-revestir todas as pontas da pipeta, pipetas sorológicas e tubos cônicos com solução de BSA para evitar a perda de organoides devido à adesão ao plástico. - Adicionar 4 mL de meio basocelular e 40 μL de solução de DNase [2 U/μL] ao tubo cônico. Inverta suavemente por 3 min.
- Adicionar 6 ml de meio basocelular ao tubo e misturar cuidadosamente por pipetagem ou girar suavemente o tubo cónico 15 vezes para misturar.
- Centrífuga por 10 min a 550 x g em RT.
- Aspirar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o pellet em 10 mL de meio basocelular.
- Deixe os fragmentos de tecido mais pesados se depositarem no fundo. Recolher o sobrenadante e transferi-lo para um tubo cónico de 15 ml. Esta suspensão contém organoides epiteliais e células estromais/imunitárias.
5. Centrifugação diferencial
- Pulse a 550 x g por 3-4 s no RT, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 mL de meio basocelular. Repita este passo mais três vezes (um total de quatro voltas).
- Após cada centrifugação, certifique-se de que o pellet se torne cada vez mais opaco. Este pellet restante será organoides epiteliais.
6. Coleta de pequenos organoides
- Pulse para 80-100 x g por 3 s em RT. Colete o sobrenadante em um tubo fresco revestido de BSA e, em seguida, pulse para 550 x g por 3 s em RT para pellet os pequenos organoides.
7. Incorporação de organoides no BECM
- Alicotar a suspensão adequada de organoides em tubos microcentrífugos de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de BECM por poço (Tabela 1). Por exemplo, use 50-100 organoides para 20 μL de BECM em um poço de uma placa de 96 poços.
NOTA: A densidade organoide pode ser contada utilizando a seguinte fórmula: ((Número médio de organoides)/50 μL) x factor de diluição. - Execute todas as etapas no gelo. Coloque o BECM descongelado no gelo em um capuz de cultura de tecidos. Ao preparar o capô, coloque todas as pontas da pipeta no gelo para esfriar.
- Centrifugar os tubos de microcentrífuga por 10 min a 300 x g em RT. Descarte o sobrenadante dos tubos. Mover os tubos com pastilhas organoides para o gelo e adicionar o volume adequado de BECM a cada tubo de microcentrífuga (Tabela 1).
NOTA: Como o BECM é viscoso, adicione volumes adicionais (aproximadamente 10% a 20% extras do volume da cúpula) do BECM para contabilizar a perda na ponta da pipeta. - Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no BECM, tomando cuidado para não produzir bolhas.
- Pipete lenta e cuidadosamente os organoides suspensos por BECM para a superfície de revestimento. Durante a pipetagnação, traga lentamente a pipeta para criar uma cúpula. Encha todos os poços vazios com PBS para manter a umidade.
- Colocar a placa numa incubadora de 37 °C durante 1 h para permitir que o BECM se solidifique e, em seguida, cobrir com o volume de meio adequado (Tabela 1).
8. Incorporação de organoides no colágeno
- Execute todas as etapas no gelo. Preparar a solução de colagénio combinando, por ordem sequencial, 375 μL de 10x DMEM, 100 μL de 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) e 3 ml de solução de colagénio I de cauda de rato num tubo cónico de 15 ml. Misture a pipeta, tomando cuidado para não fazer bolhas. Titular a solução a um pH de 7,2-7,4 com pequenas quantidades (incrementos de 1-3 μL) de NaOH ou 10x DMEM, conforme necessário.
- Revestir o fundo dos poços com a quantidade mínima de colágeno necessária para cobrir totalmente o fundo do poço. Uma abordagem é colocar uma pequena quantidade de colágeno e balançar a placa de um lado para o outro. Deixe que os revestimentos de colagénio se fixem a 37 °C durante 30 min-2 h.
- Aliquotar a suspensão apropriada de organoides em tubos microcentrífugos de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de colágeno por poço (Tabela 1). Colocar numa incubadora de 37 °C.
- Armazenar a solução de colágeno a 4 °C e monitorar a polimerização, verificando a formação de fibras sob um microscópio a cada 10 minutos. O colágeno atingirá a polimerização adequada entre 30 min-2 h.
NOTA: A polimerização adequada pode ser determinada pela presença de fibras ramificadas em toda a matriz. Prossiga para a etapa 8.5 imediatamente uma vez que algumas fibras sejam observadas no campo de visão. - Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 300 x g durante 10 minutos a RT. Eliminar o sobrenadante dos tubos. Mover os grânulos organoides para o gelo e adicionar o volume apropriado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga (Tabela 1).
NOTA: Como o colágeno é viscoso, adicione volumes adicionais (aproximadamente 10% a 20% extras do volume da cúpula) de colágeno para explicar a perda na ponta da pipeta. - Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no colágeno, tomando cuidado para não produzir bolhas.
- Pipete lenta e cuidadosamente os organoides suspensos de colágeno na superfície de revestimento. Durante a pipetagnação, traga lentamente a pipeta para criar uma cúpula. Encha todos os poços vazios com PBS para manter a umidade.
- Colocar a placa numa incubadora de 37 °C durante 1 h para permitir a solidificação do colagénio e, em seguida, cobrir com o volume adequado de meio (Tabela 1).
- NOTA: Os organoides mantêm a viabilidade em matriz 3D por até 7 dias. Se a imagem estiver sendo usada para análise, prossiga para as etapas 9 e 10.
9. Fixação de organoides incorporados
- Use uma pipeta para remover todas as mídias dos poços sem fazer contato com as cúpulas de ECM.
- Fixar com solução de paraformaldeído (PFA)/PBS a 4% por 5 min.
- Lave duas a três vezes aplicando PBS em poços depois de colocá-los em um agitador de movimento lento. Após as lavagens, aplicar PBS fresco nas cúpulas e conservar a placa a 4 °C.
10. Coloração imunofluorescente de organoides embutidos
- Preparação de soluções para coloração por imunofluorescência
- Tampão de permeabilização: Prepare uma solução de PBS com Triton X-100 a 10%.
- Buffer de bloqueio: Prepare uma solução PBS com 10% FBS e 0,2% Triton X-100.
- Tampão de diluição de anticorpos: Prepare uma solução de PBS com FBS a 2% e Triton X-100 a 0,2%.
- Permeabilização e bloqueio
- Pipeta tampão de permeabilização suficiente para cobrir as cúpulas de ECM. Incubar por 1 h no RT em um agitador de movimento lento.
- Remova o tampão de permeabilização com uma pipeta e aplique o mesmo volume de tampão de bloqueio por 3 h.
- Incubação de anticorpos primários
- Remova o tampão de bloqueio com uma pipeta e aplique o tampão de diluição de anticorpos que contém o anticorpo primário nas concentrações especificadas pelo fabricante. Incubar a amostra a 4 °C durante 12-16 h num agitador de movimento lento.
- Remova a solução primária de anticorpos e lave as amostras três vezes durante 10 minutos com PBS at RT num agitador de movimento lento.
- Incubação secundária de anticorpos e coloração nuclear
- Aspirar a lavagem PBS restante e aplicar o tampão de diluição de anticorpos contendo anticorpos secundários em concentrações especificadas pelo fabricante. Além disso, adicione DAPI ou Hoechst (para rotular núcleos) ou faloidina (para rotular actina) ao tampão na proporção de 1:250. Incubar por 2-4 h em RT em um agitador de movimento lento.
- Remova a solução de anticorpos secundários e lave as amostras três vezes durante 10 minutos em PBS at RT num agitador. Conservar as amostras em PBS a 4 °C até à obtenção de imaginos.
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Representative Results
As imagens apresentadas na Figura 1 fornecem um exemplo de organoides epiteliais mamários do tipo selvagem e tumoral de tecidos humanos e de camundongos. Uma ilustração rápida do método de isolamento de organoides epiteliais por centrifugação diferencial é fornecida no fluxo de trabalho de desenho animado na Figura 1A, mostrando que os tecidos primários de diferentes espécies podem ser processados de maneiras quase idênticas, produzindo tecido epitelial, como mostrado nas imagens de campo brilhante (Figura 1B ). Além disso, essas semelhanças de composição tecidual entre espécies podem ser observadas nas imagens imunofluorescentes de organoides incorporados na matriz extracelular do porão ou no colágeno exibidas na Figura 2A-D. A estrutura organoide pode ser visualizada através da marcação de membrana de tomate (mTomato) ou da coloração de faloidina da actina. Essas figuras também demonstram a composição e o tamanho esperados dos organoides usando esse método. Organoides embutidos na matriz de colágeno podem ser usados para um ensaio de invasão e analisados rastreando a expansão das gavinhas ramificando-se do próprio organoide, como visto na Figura 2C. Por fim, a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de organoides embutidos em parafina mostra que os organoides mantêm a mesma histologia do câncer de mama (Figura 2E).
Figura 1: Fluxo de trabalho para a geração de organoides epiteliais com organoides de exemplo. (A) Esquema de fluxo de trabalho para geração de organoides a partir de tecido humano ou de camundongo sem passar. (B) Imagens representativas de organoides epiteliais isolados de glândulas mamárias WT de camundongos, tumores mamários de camundongos e tumores de mama humana em meio após isolamento. Cada imagem foi ajustada individualmente para brilho e contraste para visualização aprimorada. As imagens foram obtidas em campo claro em microscópio epifluorescente invertido com ampliação de 10x. A barra de escala representa 20 μm. Tumores mamários foram isolados de camundongos MMTV-PyMT; tecido mamário normal foi isolado de camundongos com VBF. Os ratos variaram de 8 a 14 semanas de idade29. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Organoides de imagem na matriz extracelular. Cada imagem foi ajustada individualmente para brilho e contraste para visualização aprimorada para esta coleção. Antes da imagem, as amostras foram fixadas com paraformaldeído a 4%. Amostras do tipo selvagem foram coradas com faloidina 568 para visualização da membrana celular e todas as amostras foram coradas com Hoechst para visualização de núcleos, mostrando morfologia e densidade organoides. As imagens foram obtidas com ampliação de 10x em microscópio confocal e ampliadas com zoom de varredura de 3,003. O comprimento de onda do laser utilizado para detectar DAPI foi de 405 nm com potência de 5 e o comprimento de onda do laser utilizado para detectar faloidina foi de 561,0 nm para o canal 3 com potência de 0,5. O tamanho do orifício confocal foi mantido em 19,16 para todas as imagens. (A) Imagem representativa do campo brilhante do organoide WT mamário de camundongo incorporado no BECM no Dia 0. (A') 1:250 Hoechst marcando núcleos e (A'') 1:250 pavaloidina marcando imagens imunofluorescentes de actina de A. A barra de escala representa 20 μm. O tecido mamário normal foi isolado de camundongos com VBF. Os ratos variaram de 8 a 12 semanas de idade. (B) Imagem representativa de campo brilhante de organoide tumoral mamário de camundongo incorporado no BECM no Dia 0. (B') 1:250 Hoechst marcando núcleos e (B'') imagem imunofluorescente marcada com tomate de B. A barra de escala representa 20 μm. Tumores mamários foram isolados de camundongos MMTV-PyMT. Os ratos variaram de 12 a 14 semanas de idade. (C) Imagem representativa de campo brilhante do organoide tumoral mamário de camundongo incorporado no colágeno I no Dia 3. A imagem representa um organoide demonstrando propriedade "invasiva". (C') 1:250 Hoechst marcando núcleos e (C') imagem imunofluorescente marcada com tomate de C. A barra de escala representa 20 μm. Tumores mamários foram isolados de camundongos MMTV-PyMT. Os ratos variaram de 12 a 14 semanas de idade. (D) Imagem representativa de campo brilhante de organoide tumoral de mama humano incorporado no BECM no Dia 0. (D') Núcleos de marcação Hoechst e (D'') 1:250 Imagem imunofluorescente marcada com faloidina direcionada à actina de D. A barra de escala representa 20 μm. (E) Imagem seccionada de um organoide incorporado no BECM e corado com H&E obtida com uma ampliação de 20x. A barra de escala representa 20 μm. A coloração H&E foi realizada pela University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource30. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Placa de cultura | Volume da cúpula ECM | Número recomendado de organoides | Volume de mídia |
| Placa de 6 poços | 200 μL | 300 | 3 mL |
| Placa de 12 poços | 150 μL | 225 | 2 mL |
| Placa de 24 poços | 100 μL | 150 | 1 mL |
| Placa de 48 poços | 40 μL | 60 | 300 μL |
| Placa de 96 poços | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tabela 1: Volume recomendado de componentes de ECM para cúpulas, densidade de organoides e volume de meios necessários por poço em diferentes placas de cultura.
| Problema | Causa potencial | Solução | |||
| As cúpulas de ECM entraram em colapso. | A placa foi sacudida, o volume de ECM era muito grande para a forma da cúpula ser sustentada, ou as cúpulas estavam tocando a borda do poço, fazendo com que elas grudassem e caíssem. | Evite mover a placa com muito vigor antes que as cúpulas se ajustem, reduza o volume de ECM usado para a ressuspensão de organoides ou tenha muito cuidado para pipetar as cúpulas no centro da placa. | |||
| Há tecido que não se parece com organoides. | O tecido muscular ou o nervo podem ter sido coletados no processo de colheita da almofada de gordura mamária. | Apenas corte o que é claramente uma almofada de gordura mamária. Evite remover o tecido que está aderido firmemente à pele. | |||
| Existem muitos organoides mortos. | O tecido tumoral necrótico foi colhido. | Evite coletar o tecido de tumores que são necróticos, císticos, excessivamente macios ou de cor mais escura. O tecido tumoral deve ser firme. | |||
| Existem mais células únicas do que organoides. | O tecido foi picado muito finamente, ou a digestão da colagenase foi executada por muito tempo. | Evite picar demais o tecido ou reduzir o tempo de incubação da colagenase. | |||
| Há bolhas na ECM. | A ressuspensão por pipetagem era muito vigorosa e a ejeção durante a pipetagem das cúpulas era muito rápida. | Ressuspeite lentamente os organoides na ECM e pipete-os lentamente em cúpulas. Se o problema persistir, evite ir para a segunda parada durante a pipetagem. | |||
| Não há invasão de organoides dentro do colágeno. | O colágeno não foi adequadamente polimerizado ou superpolimerizado. | Não ressuspeite o organoide no colágeno até que seja devidamente polimerizado. Verifique a cada 30 min. Se nenhuma polimerização for visível, ressuspeite na marca de 2 h e na placa imediatamente. | |||
| Não há fibras de colágeno visíveis enquanto se observa a polimerização. | As configurações do microscópio não foram favoráveis. | Ajuste o contraste de fase para a escuridão máxima e, em seguida, traga o brilho do microscópio para cima. Além disso, aumentar a ampliação pode melhorar a visualização. | |||
| As cúpulas de ECM se dissolveram. | O tempo de fixação foi muito longo, ou o PFA não foi completamente removido das amostras embutidas em ECM. | Mantenha o tempo de fixação das cúpulas de ECM abaixo de 5 minutos e siga com cinco lavagens em um agitador rotativo por 5 minutos cada. | |||
Tabela 2: Tabela de problemas, causas e soluções potenciais.
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Discussion
Diferentes métodos têm sido descritos na literatura para gerar organoides tumorais. Este protocolo destaca um método para gerar organoides tumorais diretamente do tumor sem passar despercebido. Utilizando esse método, os organoides tumorais são produtíveis poucas horas após o início do procedimento e geram organoides próximos a 100% viáveis em comparação com 70% relatados na literatura31. Em comparação, outros métodos requerem a passagem em série de células em organoides ao longo de várias semanas. Assim, as aplicações a jusante, como determinar e visualizar interações de células imunes com amostras organoides e imunes combinadas do mesmo hospedeiro sem o impacto da cultura a longo prazo, tornam-se mais viáveis. Além disso, como destacado na Figura 2C, a incorporação de organoides tumorais em diferentes matrizes extracelulares pode permitir a identificação de fenótipos-chave em toda a cascata metastática, como a invasão do tumor primário. Outras aplicações a jusante incluem ensaios fenotípicos de morfogênese ramificada32, invasão, disseminação e formação de colônias33 para avaliar vários comportamentos de células epiteliais. As interações imunológicas também podem ser capturadas funcional e visualmente com esses ensaios baseados em organoides. Além disso, os géis podem ser dissolvidos para isolar células incorporadas para análise a jusante do conteúdo genético e proteico usando ensaios bioquímicos e baseados em fluxo padrão. Finalmente, como grandes quantidades de organoides podem ser rapidamente geradas a partir do tecido tumoral, esses ensaios podem ser dimensionados para aplicações de triagem de medicamentos e integração em fluxos de trabalho de ensaios clínicos.
Existem várias etapas importantes que são críticas para esse protocolo. Primeiro, a quantidade de tempo necessária para a digestão da colagenase depende da composição do tecido e da quantidade de tecido que está sendo digerido. Por exemplo, ao trabalhar com pedaços menores de tecido, como amostras cirúrgicas de tumor de mama humano (em média 100-250 mg), é necessário um tempo mais curto de digestão. No entanto, os tumores mamários colhidos de um rato são muito maiores em tamanho (500-800 mg) e podem exigir 30-60 minutos de digestão enzimática. Em segundo lugar, para garantir um rendimento máximo de organoides epiteliais, também é importante revestir todas as pontas da pipeta e pipetas sorológicas com BSA para evitar a perda da adesão celular ao plástico. Em terceiro lugar, um breve tempo de centrifugação diferencial é crucial para eliminar os componentes teciduais não epiteliais. Essa abordagem permite que organoides epiteliais mais pesados sejam pellets, enquanto compartimentos estromais estromais e imunológicos mais leves permanecem no sobrenadante. Para criar ensaios de invasão através da incorporação de organoides no colágeno, é fundamental permitir a polimerização adequada do colágeno antes de incorporar organoides. Esta etapa deve ser verificada visualmente, confirmando a formação de fibras de colágeno sob um microscópio de luz. Finalmente, para melhores resultados de imagem, tome cuidado para evitar a produção de bolhas ao ressuspender organoides em ECM e chapeamento. As bolhas obscurecem os organoides dentro do gel e distorcem as imagens. A Tabela 2 lista os possíveis problemas encontrados e as soluções para superá-los.
Certas etapas do protocolo permitem modificações para personalizar o tamanho dos organoides gerados ou reduzir o tempo necessário para executar o protocolo. Por exemplo, aumentar a duração do tempo de digestão mecânica pode resultar em um tempo de digestão da colagenase mais curto, organoides menores e mais células individuais. A centrifugação após a digestão da colagenase pode ser encurtada para 5 minutos se trabalhar com uma grande quantidade de tecido tumoral. Os meios utilizados para a cultura e o cultivo de organoides podem ser preparados um dia antes para economizar tempo durante as etapas de geração de organoides. Da mesma forma, o tecido tumoral pode ser armazenado por até 24 horas em meios apropriados antes da preparação organoide. Se o tempo for extremamente limitado, este protocolo inclui a pausa das etapas por congelamento do tecido tumoral no dia da coleta. Então, esses tecidos congelados podem ser usados para gerar organoides viáveis em uma data posterior. Aproximadamente 90% dos organoides derivados do tecido congelado eram viáveis, confirmados visualmente sob microscópio de luz e com solução azul de tripano.
Existem algumas limitações para este protocolo. Embora essa abordagem gere organoides viáveis rapidamente, a quantidade de organoides gerados é limitada pela quantidade de tecido tumoral. Essa limitação torna-se especialmente evidente quando se trabalha com amostras clínicas em que a quantidade de tecido tumoral é menor ou, às vezes, até restrita a algumas células. Nos casos extremos em que apenas algumas células podem ser recuperadas como material de partida, a passagem pode ser uma opção melhor. Outra limitação é a abordagem reducionista desse método. A remoção de compartimentos estromais, como fibroblastos ou células endoteliais, enriquece a geração de organoides epiteliais. No entanto, essas populações celulares são críticas para a função do tumor. Portanto, sua remoção limita a interpretação da biologia tumoral que é derivada exclusivamente de modelos organoides epiteliais. Em conclusão, este protocolo fornece uma abordagem para a rápida geração de organoides epiteliais para uso imediato em imagens a jusante, funcionais (incluindo interações imunológicas) e aplicações de triagem de medicamentos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo financiamento fornecido pelo METAvivor, o Peter Carlson Trust, a Theresa's Research Foundation e o NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Reconhecemos a assistência do Recurso Compartilhado de Gerenciamento de Tecidos do Sudoeste da Universidade do Texas, um recurso compartilhado no Simmons Comprehensive Cancer Center, que é apoiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer sob o número de prêmio P30 CA142543. Agradecimentos especiais a todos os membros do Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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