Summary
该协议讨论了通过差异离心从原发性正常和肿瘤乳腺组织产生上皮类器官的方法。此外，还包括用于三维培养以及嵌入类器官的免疫荧光成像的说明。
Abstract
类器官是模拟器官组织的可靠方法，因为它们具有自组织特性，并且在从原代组织或干细胞繁殖后保留了功能和结构。这种类器官生成方法放弃了通过多次传代的单细胞分化，而是使用差异离心从机械和酶解离组织中分离乳腺上皮类器官。除了在胶原蛋白和基底细胞外基质中嵌入类器官的技术外，该协议提供了一种简化的技术，用于从小鼠和人类乳腺组织快速生产小型和大型上皮类器官。此外，还提供了凝胶内固定和免疫荧光染色的说明，以可视化类器官形态和密度。这些方法适用于无数的下游分析，例如与免疫细胞共培养和通过胶原侵袭测定进行离体转移建模。这些分析有助于更好地阐明细胞间行为，并更全面地了解肿瘤微环境中的相互作用。
Introduction
在体外模拟上皮细胞的能力一直是现代生物医学研究的基础，因为它捕获了体内无法获得的细胞特征。例如，在二维平面上生长上皮细胞系可以评估增殖过程中上皮细胞中发生的分子变化1。此外，测量信号传导和基因表达之间的动态调控在体内系统中受到限制2。在癌症研究中，癌症上皮细胞系建模能够识别疾病进展的分子驱动因素和潜在的药物靶点3。然而，在二维平面上生长癌症上皮细胞系具有局限性，因为大多数是遗传永生化和修饰的，通常是克隆性质的，选择因为它们在非生理条件下生长的能力，在评估三维（3D）肿瘤组织结构方面受到限制，并且不能充分模拟现实组织环境中的微环境相互作用4。这些限制在模拟转移时尤其明显，在体内包括几个不同的生物学阶段，包括远处器官部位的侵袭、播散、循环和定植5。
癌症上皮类器官已被开发出来，以更好地概括肿瘤的3D环境和行为6，7，8。类器官首先由单个LRG5 +肠隐窝细胞开发而成，并分化以代表在体外维持小肠分层结构的隐窝绒毛单位的3D结构9。这种方法允许在稳态和压力条件下实时可视化和表征自组织组织结构。作为一种自然延伸，癌症上皮类器官被开发用于模拟许多不同的癌症类型，包括结直肠癌10，胰腺11，乳腺癌12，肝脏13，肺癌14，脑癌15和胃癌16。癌症上皮类器官已被用于表征癌症进化17，18和转移时空行为19，20，询问肿瘤异质性21，并测试化学疗法22。在正在进行的临床试验中，癌症上皮类器官也被分离和收集，以预测患者对抗癌药物和离体放射治疗的反应8，23，24，25。此外，结合癌症上皮类器官的系统可以与其他非癌细胞（如免疫细胞）相结合，形成更全面的肿瘤微环境模型，以实时可视化相互作用，揭示癌症上皮细胞如何改变细胞毒性效应免疫细胞（如自然杀伤细胞）的基本性质，并测试潜在的免疫疗法和抗体药物依赖性细胞毒性活性26， 27，28.本文展示了一种无需传代和嵌入胶原蛋白和基底细胞外基质 （ECM） 即可生成上皮类器官的方法。此外，还分享了分离类器官的下游成像技术。
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Protocol
本手稿中使用的所有小鼠组织均根据德克萨斯大学西南医学中心的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 规定和指南进行道德收集。同样，所有患者在机构审查委员会（IRB）的监督下在组织捐赠之前都同意，并且样本被去识别化。
注意：本协议描述了从原代组织产生类器官。
1. 过夜准备材料
- 为了包埋在基底细胞外基质（BECM）中，将其保持在4°C来解冻BECM等分试样。
2. 制备胶原酶和牛血清白蛋白（BSA）包衣溶液
- 制备 2.64% BSA/PBS 涂层溶液（BSA 溶液）：使用 50 mL/0.2 μm 滤瓶无菌过滤 50 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 4.10 mL 30% BSA 溶液。该BSA解决方案可以过滤并再次使用。
- 制备小鼠乳腺组织的胶原酶溶液：使用50 mL / 0.2 μm过滤瓶无菌过滤器27 mL基础细胞培养基，1.5 mL胎牛血清（FBS），30 μL 50 mg / mL庆大霉素，15 μL 10 mg / mL胰岛素，600 μL 0.1 g / mL胶原酶A和600 μL 0.1 g / mL胰蛋白酶。根据组织质量，每只小鼠分配10 mL至30 mL胶原酶溶液。
- 为人乳腺组织制备胶原酶溶液：使用 50 mL/0.2 μm 滤瓶无菌过滤 18 mL RPMI-1640、200 μL 100x 青霉素-链霉素溶液（笔/链球菌）、200 μL 10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES） 缓冲液、1 mL FBS 和 400 μL 0.1 g/mL 胶原酶 A。根据组织质量，为每个组织样品分配 10 mL 至 20 mL。
3. 准备介质
- 制备类器官培养基：使用50 mL / 0.2 μm滤瓶用1%笔/链球菌和1%胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS）无菌过滤基底细胞培养基。为了制备类器官生长因子培养基，加入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）至终浓度为2.5nM。
- 制备乳腺上皮培养基：要制备 100 mL 乳腺上皮培养基，用 1 mL 100x 谷氨酰胺补充剂、1 mL 笔/链球菌、1 mL 10 mM HEPES 缓冲液 （7.3 pH）、250 μL 30% BSA 原液、1 μL 1 mg/mL 霍乱毒素原液、1 mL 50 μg/mL 氢化可的松原液在 PBS 中无菌过滤高葡萄糖普通基础培养基， 使用 150 mL/0.2 μm 滤瓶的 50 μL 10 mg/mL 人胰岛素溶液、10 μL 50 μg/mL 表皮生长因子 （EGF） 储备液和 1% FBS。将培养基储存在4°C并使用长达2周。
- 准备两性霉素洗涤液：无菌过滤器PBS与2%笔/链球菌和2%两性霉素B.储存在4°C。
4. 收集和消化组织
- 小鼠乳腺组织
- 通过将小鼠置于CO 2室中2-5 分钟来对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位。腹侧朝上，张开小鼠四肢，并使用四根 19 G 针将鼠标的爪子固定在覆盖有吸收垫的板上。喷洒70%乙醇以抚平皮毛并消毒皮肤。用纱布垫或纸巾擦去粪便。
- 从肛门生殖器区域上方开始，使用手术剪刀从中线向上切割，注意不要刺穿腹膜。到达下巴后，沿着锁骨和后腿进行横向切割，并将鼠标的皮肤绷紧在板上以露出乳腺脂肪垫。
- 通过识别位于后肢附近的腹股沟淋巴结，定位野生型小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫。将胸廓乳腺脂肪垫定位在野生型小鼠上，作为前肢下方较厚的血管化组织。
- 用镊子抬高乳腺脂肪垫。避免收集下面的肌肉。使用锋利钝剪刀的钝端，在乳腺脂肪垫下方创建一个口袋，远离皮肤。将乳腺脂肪垫切成一块。
- 去除乳腺脂肪垫后，在将其放入无菌组织培养皿之前，在PBS中冲洗。快速转移到组织培养罩中。
注意：对于乳腺肿瘤，请使用沾有PBS的棉签轻轻地将肿瘤从皮肤上。一定要避免深色或柔软的区域，因为深色变色表明坏死，这不会产生健康的类器官。 - 用#10或#11手术刀切碎乳腺肿瘤以松弛组织，直到达到糊状稠度。使用手术刀将切碎的组织转移到含有10-30mL胶原酶溶液的锥形管中。为确保收集所有组织，将 1 mL 胶原酶溶液移液到组织培养板上并返回锥形管中。
注意：要产生更大的类器官，应尽量减少机械消化，保持一些小的可见组织块完好无损。或者，组织可以冷冻储存以备以后的类器官制备，而活力损失最小。为此，在PBS或基底细胞培养基+ 1%FBS的溶液中洗涤组织，然后粗切以增加表面积（将组织保持在一块或两块固体中）。将组织移动到冷冻瓶中，顶部放有冷冻培养基（90%FBS + 10%二甲基亚砜（DMSO））。将小瓶在受控速率的冷冻容器中冷冻过夜，然后转移到液氮中储存。 - 将锥形管放入37°C台式摇动培养箱中，转速为180RPM，直到组织变得粘稠并且胶原酶溶液变得浑浊。例如，来自肿瘤的大组织团（约500-800毫克）需要30-60分钟。来自野生型乳腺脂肪垫的较小组织团块（约100-300毫克）大约需要20-30分钟。如果不确定，请每隔 5 分钟检查一次。
- 孵育后，在室温（RT）下以550× g 离心锥形管10分钟。
- 小心地从锥形管中吸出上清液。
注意：接下来，用BSA溶液预涂覆所有移液器吸头，血清移液管和锥形管，以避免由于粘附在塑料上而导致类器官的损失。 - 向管中加入 8 mL 基底细胞培养基和 80 μL 脱氧核糖核酸酶溶液 [2 U/μL]。轻轻倒置1-3分钟。
- 向管中加入 12 mL 基础细胞培养基，通过移液小心混合或轻轻旋转试管 15 次以混合。
- 在室温下以550× g 离心10分钟。
- 吸出上清液，然后将沉淀重悬于12mL基底细胞培养基中。
- 让最重的组织碎片沉降到底部。用血清移液管收集上清液并转移到 15 mL 锥形管中。该悬浮液含有上皮类器官和基质/免疫细胞。
- 人体乳房组织
- 处理类器官的人类乳房组织样品或在收集后24小时内储存它们。将样品储存在4°C的CO2非依赖性培养基中，具有1%100x抗生素 - 抗真菌剂。
- 将组织转移到组织培养板中。倾斜板并吸出多余的存储介质，然后用 5 mL 两性霉素 B 洗涤液冲洗组织。立即取出两性霉素 B 洗液。
- 用 #10 或 #11 手术刀切碎组织样本以松开组织，直到它达到糊状稠度。使用手术刀将切碎的组织转移到含有10-30mL胶原酶溶液的锥形管中。为确保收集所有组织，将 1 mL 胶原酶溶液移液到组织培养板上并返回锥形管中。
注意：要产生更大的类器官，应尽量减少机械消化，保持一些小的可见组织块完好无损。该方案的起始组织质量范围在100-250mg之间。或者，组织可以冷冻储存以备以后的类器官制备，在步骤4.2.2之后，如上所述，在90%FBS + 10%DMSO中存活率损失最小。 - 将锥形管放入37°C台式振荡培养箱中，转速为180RPM，直到组织变小并且胶原酶变浑浊。每隔5分钟检查组织。人体样品的胶原酶解离大约需要5-20分钟。
- 孵育后，在室温下以550× g 旋转锥形管10分钟。
- 小心地从锥形管中吸出上清液。
注意：接下来，用BSA溶液预涂所有移液器吸头，血清移液管和锥形管，以避免由于粘附到塑料上而导致类器官的损失。 - 向锥形管中加入 4 mL 基础细胞培养基和 40 μL 脱氧核糖核酸酶溶液 [2 U/μL]。轻轻倒置3分钟。
- 向管中加入 6 mL 基础细胞培养基，通过移液小心混合或轻轻旋转锥形管 15 次以混合。
- 在室温下以550× g 离心10分钟。
- 吸出上清液，然后将沉淀重悬于10mL基底细胞培养基中。
- 让最重的组织碎片沉降到底部。收集上清液并将其转移到 15 mL 锥形管中。该悬浮液含有上皮类器官和基质/免疫细胞。
5. 差速离心
- 在室温下脉冲至 550 x g 3-4 秒，吸出上清液，并将沉淀重悬于 10 mL 基底细胞培养基中。再重复此步骤三次（总共旋转四次）。
- 每次离心后，确保沉淀变得越来越不透明。剩余的沉淀将是上皮类器官。
6. 收集小类器官
- 将上清液收集到新鲜的BSA包被的管中，然后在室温下脉冲至550×g3秒以沉淀小类器官。
7. 在BECM中嵌入类器官
- 根据类器官密度相对于每孔BECM的量，将类器官适当悬浮液等分到微量离心管中（表1）。例如，在 96 孔板的一个孔中使用 50-100 个类器官用于 20 μL BECM。
注意：类器官密度可以使用以下公式计算：（（平均类器官数量）/ 50μL）x稀释因子。 - 在冰上执行所有步骤。将解冻的BECM放在组织培养罩中的冰上。准备引擎盖时，将所有移液器吸头放在冰上冷却。
- 在室温下以300× g 离心微量离心管10分钟。 从管中弃去上清液。将装有类器官颗粒的管移动到冰上，并向每个微量离心管中加入适当体积的BECM（表1）。
注意：由于BECM是粘性的，因此添加额外的BECM体积（大约10%-20%的额外圆顶体积）以解决移液器吸头中的损失。 - 轻轻上下移液以将类器官重悬于BECM中，注意不要产生气泡。
- 缓慢而小心地将BECM悬浮的类器官移液到电镀表面上。移液时，慢慢提起移液器以形成圆顶。用PBS填充所有空井以保持湿度。
- 将板放入37°C培养箱中1小时以使BECM凝固，然后用适当体积的培养基覆盖（表1）。
8. 将类器官嵌入胶原蛋白中
- 在冰上执行所有步骤。通过在 15 mL 锥形管中按顺序合并 375 μL 10x DMEM、100 μL 1 N 氢氧化钠 （NaOH） 和 3 mL 大鼠尾部胶原蛋白 I 溶液来制备胶原蛋白溶液。移液器混合，注意不要产生气泡。根据需要用少量（增量为 1-3 μL）NaOH 或 10x DMEM 将溶液滴定至 pH 值至 7.2-7.4。
- 在孔底部涂上完全覆盖孔底部所需的最少量的胶原蛋白。一种方法是放置少量胶原蛋白，然后将盘子从一侧摇到另一侧以涂覆。让胶原蛋白衬垫在37°C下凝固30分钟-2小时。
- 根据类器官密度相对于每孔胶原蛋白的量，将适当的类器官悬浮液等分到微量离心管中（表1）。置于37°C培养箱中。
- 将胶原溶液储存在4°C，并通过每10分钟在显微镜下检查纤维形成来监测聚合。胶原蛋白将在30分钟-2小时之间达到适当的聚合。
注意：适当的聚合可以通过纤维在整个基质中的分支的存在来确定。一旦在视野中观察到几根光纤，立即继续执行步骤8.5。 - 在室温下以300× g 离心微量离心管10分钟。 从管中弃去上清液。将类器官颗粒移至冰上，并向每个微量离心管中加入适当体积的胶原蛋白（表1）。
注意：由于胶原蛋白是粘稠的，因此添加额外的胶原蛋白体积（大约10%-20%的额外圆顶体积）以解释移液器吸头中的损失。 - 轻轻上下移液，将类器官重悬于胶原蛋白中，注意不要产生气泡。
- 缓慢而小心地将胶原蛋白悬浮的类器官移液到电镀表面上。移液时，慢慢提起移液器以形成圆顶。用PBS填充所有空井以保持湿度。
- 将板放入37°C培养箱中1小时以使胶原蛋白凝固，然后用适当体积的培养基覆盖（表1）。
- 注意：类器官在3D基质中保持活力长达7天。如果使用成像进行分析，请继续执行步骤 9 和 10。
9. 固定嵌入的类器官
- 使用移液器从孔中取出所有培养基，而不与ECM圆顶接触。
- 用 4% 多聚甲醛 （PFA）/PBS 溶液固定 5 分钟。
- 将PBS放在缓慢移动的摇床上后，将PBS涂在孔上，洗涤两到三次。洗涤后，将新鲜的PBS涂在圆顶上并将板储存在4°C。
10. 包埋类器官的免疫荧光染色
- 制备免疫荧光染色溶液
- 透化缓冲液：用10%Triton X-100制备PBS溶液。
- 封闭缓冲液：制备含有10%FBS和0.2%Triton X-100的PBS溶液。
- 抗体稀释缓冲液：制备含有2%FBS和0.2%Triton X-100的PBS溶液。
- 透化和堵塞
- 移液足够的透化缓冲液以覆盖ECM圆顶。在室温下在缓慢移动的摇床上孵育1小时。
- 用移液管除去透化缓冲液，并应用相同体积的封闭缓冲液3小时。
- 一抗孵育
- 用移液管取出封闭缓冲液，并以制造商指定的浓度涂上含有一抗的抗体稀释缓冲液。将样品在4°C下在缓慢移动的摇床上孵育12-16小时。
- 取出一抗溶液，在缓慢移动的摇床上用室温PBS洗涤样品3次10分钟。
- 二抗孵育和核染色
- 吸出剩余的PBS洗涤液，并以制造商指定的浓度应用含有二抗的抗体稀释缓冲液。此外，以1：250的比例将DAPI或Hoechst（标记细胞核）或鬼笔环肽（标记肌动蛋白）添加到缓冲液中。在室温下在缓慢移动的摇床上孵育2-4小时。
- 取出二抗溶液，在摇床上的室温下在PBS中洗涤样品3次10分钟。将样品储存在4°C的PBS中直至成像。
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Representative Results
图1中的图像提供了来自人类和小鼠组织的野生型和肿瘤性乳腺上皮类器官的示例。图1A中的卡通工作流程中提供了通过差速离心分离上皮类器官的方法的概览图示，表明来自不同物种的原代组织可以以几乎相同的方式进行处理，同时产生上皮组织，如明场图像所示（图1B）).此外，这些种间组织组成相似性可以在图2A-D所示的基底细胞外基质或胶原蛋白中嵌入类器官的免疫荧光图像中看到。类器官结构可以通过膜番茄（mTomato）标记或肌动蛋白的鬼笔环肽染色来可视化。这些图还显示了使用这种方法的预期类器官组成和大小。嵌入胶原蛋白基质中的类器官可用于侵袭测定，并通过跟踪从类器官本身分支出来的卷须的扩张进行分析，如图2C所示。最后，石蜡包埋类器官的苏木精和伊红（H&E）染色表明类器官保持与乳腺癌相同的组织学（图2E）。
图 1：使用示例类器官生成上皮 类器官的工作流程。 （A） 无需传代即可从小鼠或人体组织生成类器官的工作流程模式。（B）分离后培养基中小鼠WT乳腺，小鼠乳腺肿瘤和人乳腺肿瘤中分离的上皮类器官的代表性图像。每个图像都单独调整亮度和对比度，以增强可视化效果。图像在倒置落射荧光显微镜上以10倍放大倍率在明场中拍摄。比例尺代表 20 μm。从MMTV-PyMT小鼠中分离乳腺肿瘤;从FVB小鼠中分离出正常的乳腺组织。小鼠年龄在29岁8-14周之间。 请点击此处查看此图的大图。
图2：细胞外基质中的类器官成像。 每个图像都针对亮度和对比度进行了单独调整，以增强该系列的可视化效果。在成像之前，用4%多聚甲醛固定样品。野生型样品用鬼笔环肽568染色以可视化细胞膜，所有样品均用Hoechst染色以可视化细胞核，显示类器官形态和密度。在共聚焦显微镜上以10倍放大倍率拍摄图像，并以3.003的扫描变焦进一步放大。用于检测DAPI的激光波长为405 nm，功率为5，用于检测鬼笔环肽的激光波长为通道3的561.0 nm，功率为0.5。所有图像的共聚焦针孔尺寸均保持在19.16。（A）第0天嵌入BECM中的小鼠乳腺WT类器官的代表性明场图像。（A'） 1：250 Hoechst 标记核和 （A''） 1：250 鬼笔环肽标记肌动蛋白免疫荧光图像的 A. 比例尺代表 20 μm。从FVB小鼠中分离出正常的乳腺组织。小鼠年龄范围为8-12周龄。（B）第0天嵌入BECM中的小鼠乳腺肿瘤类器官的代表性明场图像。（B'） 1：250 Hoechst标记细胞核和（B''）番茄标记的B免疫荧光图像.比例尺代表20μm。从MMTV-PyMT小鼠中分离乳腺肿瘤。小鼠年龄范围为12-14周龄。（C）第3天嵌入胶原蛋白I的小鼠乳腺肿瘤类器官的代表性明场图像。该图像代表一个展示“侵入性”特性的类器官。（C'） 1：250 Hoechst标记细胞核和（C'）番茄标记的C.比例尺代表20μm。从MMTV-PyMT小鼠中分离乳腺肿瘤。小鼠年龄范围为12-14周龄。（D）第0天嵌入BECM中的人乳腺肿瘤类器官的代表性明场图像。（D'）Hoechst标记核和（D''）1：250肌动蛋白靶向鬼笔环肽标记的D免疫荧光图像。 比例尺代表20μm。 （E）嵌入BECM中的类器官的切片图像，并在20倍放大镜下用H&E染色。比例尺代表 20 μm。 H&E 染色由德克萨斯大学西南组织管理共享资源30 进行。 请点击此处查看此图的大图。
| 培养板 | ECM 圆顶卷 | 推荐的类器官数量 | 媒体音量 |
| 6孔板 | 200 微升 | 300 | 3毫升 |
| 12孔板 | 150 微升 | 225 | 2毫升 |
| 24孔板 | 100 微升 | 150 | 1毫升 |
| 48孔板 | 40 微升 | 60 | 300 微升 |
| 96孔板 | 20 微升 | 30 | 150 微升 |
表 1：圆顶的 ECM 组分推荐体积、类器官密度以及不同培养板上每孔所需的培养基体积。
| 问题 | 潜在原因 | 溶液 | |||
| ECM 圆顶已倒塌。 | 板被摇晃，ECM体积太大，圆顶形状无法维持，或者圆顶接触井的边缘，导致它们粘住并掉落。 | 避免在圆顶凝固之前用力移动板，减少用于类器官重悬的ECM体积，或非常小心地将圆顶移液到板的中心。 | |||
| 有些组织看起来不像类器官。 | 肌肉组织或神经可能在收获乳腺脂肪垫的过程中被收集。 | 只切掉明明是乳腺脂肪垫的东西。避免去除紧紧粘在皮肤上的组织。 | |||
| 有许多死亡的类器官。 | 收获坏死的肿瘤组织。 | 避免从坏死、囊性、过软或颜色较深的肿瘤中收集组织。肿瘤组织应坚硬。 | |||
| 单细胞比类器官多。 | 组织切碎太细，或胶原酶消化运行时间过长。 | 避免过度切碎组织或减少胶原酶孵育时间。 | |||
| ECM 中有气泡。 | 移液重悬太猛，移液圆顶时喷射太快。 | 慢慢地将类器官重悬于ECM中，并缓慢地将它们移液到圆顶中。如果问题仍然存在，请避免在移液时转到第二站。 | |||
| 胶原蛋白内没有类器官的侵入。 | 胶原蛋白没有适当聚合或过度聚合。 | 在适当聚合之前，不要将类器官重悬于胶原蛋白中。每30分钟检查一次。如果没有可见的聚合，则在2小时标记处重悬并立即板。 | |||
| 在观察聚合时看不到胶原纤维。 | 显微镜设置不利。 | 调整相衬以获得最大的黑暗度，然后将显微镜的亮度一直调高。此外，增加放大倍率可能会增强观看效果。 | |||
| ECM 圆顶已解散。 | 固定时间太长，或者PFA未从ECM包埋的样品中彻底去除。 | 将ECM圆顶的固定时间保持在5分钟以下，并在旋转振荡器上进行五次洗涤，每次洗涤5分钟。 | |||
表 2：潜在问题、原因和解决方案表。
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Discussion
文献中已经描述了生成肿瘤类器官的不同方法。该协议强调了一种直接从肿瘤生成肿瘤类器官而无需传代的方法。使用这种方法，肿瘤类器官可在启动手术后数小时内生产，并产生接近100%的活类器官，而文献中报道的这一比例为70%31%。相比之下，其他方法需要在几周内将细胞连续传代到类器官中。因此，下游应用，例如确定和可视化免疫细胞与来自同一宿主的匹配类器官和免疫样品的相互作用，而不受长期培养的影响，变得更加可行。此外，如图 2C所示，将肿瘤类器官嵌入不同的细胞外基质中可以允许识别整个转移级联过程中的关键表型，例如浸润原发肿瘤。其他下游应用包括分支形态发生32、侵袭、播散和集落形成33 的表型测定，以评估各种上皮细胞行为。免疫相互作用也可以通过这些基于类器官的测定在功能和视觉上捕获。此外，可以溶解凝胶以分离嵌入的细胞，以便使用标准生化和基于流动的测定对遗传和蛋白质含量进行下游分析。最后，由于可以从肿瘤组织中快速生成大量类器官，因此这些测定可以扩展用于药物筛选应用并集成到临床试验工作流程中。
有几个关键步骤对此协议至关重要。首先，胶原酶消化所需的时间取决于组织组成和被消化的组织量。例如，当处理较小的组织块时，例如人乳腺肿瘤手术样本（平均100-250mg），需要更短的消化时间。然而，从小鼠收获的乳腺肿瘤的大小要大得多（500-800mg），可能需要30-60分钟的酶消化。其次，为了确保上皮类器官的最大产量，在所有移液器吸头和血清移液器上涂覆BSA也很重要，以避免细胞粘附到塑料上的损失。第三，短暂的差异离心时间对于消除非上皮组织成分至关重要。这种方法允许较重的上皮类器官沉淀，而较轻的基质和免疫区室保留在上清液中。为了通过在胶原蛋白中包埋类器官来创建侵入测定，在嵌入类器官之前允许胶原蛋白的适当聚合至关重要。此步骤应通过在光学显微镜下确认胶原纤维的形成来目视检查。最后，为了获得最佳成像结果，在ECM和电镀中重悬类器官时，请注意避免产生气泡。气泡会遮挡凝胶内的类器官并扭曲图像。 表 2 列出了遇到的潜在问题以及克服这些挑战的解决方案。
方案中的某些步骤允许修改以定制生成的类器官的大小或减少执行方案所需的时间。例如，增加机械消化时间的持续时间可以缩短胶原酶消化时间，更小的类器官和更多的单个细胞。如果处理大量肿瘤组织，胶原酶消化后的离心可以缩短到5分钟。用于培养和生长类器官的培养基可以在类器官生成步骤前一天制备，以节省时间。同样，在类器官制备之前，肿瘤组织可以在适当的培养基中储存长达24小时。如果时间非常有限，该协议包括在收集当天通过冷冻肿瘤组织来暂停步骤。然后，这些冷冻组织可用于在以后产生活的类器官。大约90%来自冷冻组织的类器官是可行的，在光学显微镜下用台盼蓝溶液目视确认。
此协议存在一些限制。虽然这种方法可以快速生成活的类器官，但生成的类器官数量受到肿瘤组织数量的限制。当处理肿瘤组织数量较少或有时甚至仅限于少数细胞的临床样本时，这种限制变得特别明显。在那些只能回收少数细胞作为起始材料的极端情况下，传代可能是更好的选择。另一个限制是这种方法的还原论方法。去除基质区室（如成纤维细胞或内皮细胞）可丰富上皮类器官的生成。然而，这些细胞群对肿瘤的功能至关重要。因此，它们的去除限制了对仅源自上皮类器官模型的肿瘤生物学的解释。总之，该协议提供了一种快速生成上皮类器官的方法，可立即用于下游成像，功能（包括免疫相互作用）和药物筛选应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了METAvivor，Peter Carlson Trust，Theresa研究基金会和NCI / UTSW西蒙斯癌症中心P30 CA142543的资金支持。我们感谢德克萨斯大学西南组织管理共享资源的帮助，这是西蒙斯综合癌症中心的共享资源，部分由国家癌症研究所支持，奖励号为P30 CA142543。特别感谢陈氏实验室的所有成员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
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