Summary
Ce protocole traite d’une approche pour générer des organoïdes épithéliaux à partir de tissu mammaire primaire normal et tumoral par centrifugation différentielle. En outre, des instructions sont incluses pour la culture tridimensionnelle ainsi que l’imagerie immunofluorescente des organoïdes intégrés.
Abstract
Les organoïdes sont une méthode fiable pour modéliser les tissus organiques en raison de leurs propriétés auto-organisatrices et de la conservation de la fonction et de l’architecture après la propagation à partir de tissus primaires ou de cellules souches. Cette méthode de génération d’organoïdes renonce à la différenciation unicellulaire par plusieurs passages et utilise plutôt la centrifugation différentielle pour isoler les organoïdes épithéliaux mammaires des tissus dissociés mécaniquement et enzymatiquement. Ce protocole fournit une technique simplifiée pour produire rapidement de petits et grands organoïdes épithéliaux à partir de tissus mammaires de souris et humains, en plus de techniques d’incorporation organoïde dans le collagène et la matrice extracellulaire basale. De plus, des instructions pour la fixation dans le gel et la coloration immunofluorescente sont fournies dans le but de visualiser la morphologie et la densité organoïdes. Ces méthodologies conviennent à une myriade d’analyses en aval, telles que la co-culture avec des cellules immunitaires et la modélisation ex vivo des métastases via un test d’invasion de collagène. Ces analyses servent à mieux élucider le comportement cellule-cellule et à créer une compréhension plus complète des interactions au sein du microenvironnement tumoral.
Introduction
La capacité de modéliser les cellules épithéliales in vitro a été le fondement de la recherche biomédicale moderne, car elle capture des caractéristiques cellulaires qui ne sont pas accessibles in vivo. Par exemple, la croissance de lignées cellulaires épithéliales dans un plan bidimensionnel peut fournir une évaluation des changements moléculaires qui se produisent dans une cellule épithéliale pendant la prolifération1. De plus, la mesure de la régulation dynamique entre la signalisation et l’expression génique est limitée dans les systèmes in vivo 2. Dans la recherche sur le cancer, la modélisation des lignées cellulaires épithéliales cancéreuses a permis d’identifier les facteurs moléculaires de progression de la maladie et les cibles médicamenteuses potentielles3. Cependant, la croissance de lignées cellulaires épithéliales cancéreuses sur un plan bidimensionnel a des limites, car la plupart sont génétiquement immortalisées et modifiées, souvent de nature clonale, sélectionnées pour leur capacité à se développer dans des conditions non physiologiques, limitées dans leur évaluation de l’architecture tridimensionnelle (3D) des tissus tumoraux, et ne modélisent pas adéquatement les interactions du microenvironnement dans un environnement tissulaire réaliste4. Ces contraintes sont particulièrement évidentes dans la modélisation des métastases, qui comprend in vivo plusieurs étapes biologiques distinctes, y compris l’invasion, la dissémination, la circulation et la colonisation sur le site d’organes éloigné5.
Des organoïdes épithéliaux cancéreux ont été développés pour mieux récapituler l’environnement 3D et le comportement des tumeurs 6,7,8. Les organoïdes ont d’abord été développés à partir de cellules cryptiques intestinales LRG5+ uniques et différenciés pour représenter la structure 3D des unités cryptes-villosités qui maintenaient la structure hiérarchique de l’intestin grêle in vitro9. Cette approche a permis de visualiser et de caractériser en temps réel l’architecture tissulaire auto-organisatrice dans des conditions homéostatiques et de stress. En tant qu’extension naturelle, les organoïdes épithéliaux du cancer ont été développés pour modéliser de nombreux types de cancer différents, y compris colorectal 10, pancréatique11, sein 12, foie13, poumon 14, cerveau 15 et gastrique 16. Les organoïdes épithéliaux du cancer ont été exploités pour caractériser l’évolution du cancer17,18 et les comportements spatio-temporels métastatiques19,20 et interroger l’hétérogénéité tumorale21, et tester les chimiothérapies 22. Des organoïdes épithéliaux cancéreux ont également été isolés et collectés au cours d’essais cliniques en cours pour prédire la réponse des patients aux agents anticancéreux et à la radiothérapie ex vivo 8,23,24,25. En outre, les systèmes incorporant des organoïdes épithéliaux cancéreux peuvent être combinés avec d’autres cellules non cancéreuses, telles que les cellules immunitaires, pour former un modèle plus complet du microenvironnement tumoral afin de visualiser les interactions en temps réel, de découvrir comment les cellules épithéliales cancéreuses modifient la nature fondamentale des cellules immunitaires effectrices cytotoxiques telles que les cellules tueuses naturelles, et de tester les immunothérapies potentielles et l’activité cytotoxique dépendante des anticorps26, 27,28. Cet article démontre une méthode de génération d’organoïdes épithéliaux sans passer et incorporer dans le collagène et la matrice extracellulaire basale (ECM). En outre, des techniques d’imagerie en aval d’organoïdes isolés sont également partagées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les tissus de souris utilisés dans ce manuscrit ont été prélevés de manière éthique conformément aux règlements et directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas. De même, tous les patients ont consenti avant le don de tissus sous la supervision d’un comité d’examen institutionnel (CISR), et les échantillons ont été dépersonnalisés.
REMARQUE: Ce protocole décrit la génération d’organoïdes à partir de tissus primaires.
1. Préparation de nuit des matériaux
- Pour l’incorporation dans la matrice extracellulaire basale (BECM), décongeler l’aliquote BECM en la laissant à 4 °C.
2. Préparation de la collagénase et de la solution d’enrobage de sérum albumine bovine (BSA)
- Préparer une solution d’enrobage BSA/PBS à 2,64 % (solution BSA) : Filtre stérile 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 4,10 mL de solution BSA à 30 % à l’aide d’une fiole filtrante à 50 mL/0,2 μm. Cette solution BSA peut être filtrée et réutilisée.
- Préparer la solution de collagénase pour le tissu mammaire de souris : Filtre stérile 27 mL de milieu cellulaire basal, 1,5 mL de sérum bovin fœtal (FBS), 30 μL de gentamicine à 50 mg/mL, 15 μL d’insuline à 10 mg/mL, 600 μL de collagénase A à 0,1 g/mL et 600 μL de trypsine à 0,1 g/mL à l’aide d’une fiole filtrante de 50 mL/0,2 μm. Allouer entre 10 mL et 30 mL de solution de collagénase par souris, selon la masse tissulaire.
- Préparer la solution de collagénase pour le tissu mammaire humain : Filtre stérile 18 mL de RPMI-1640, 200 μL de solution 100x de pénicilline-streptomycine (stylo/streptocoque), 200 μL de tampon de 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanéthanésulfonique (HEPES), 1 mL de FBS et 400 μL de collagénase A à 0,1 g/mL à l’aide d’une fiole filtrante de 50 mL/0,2 μm. Allouer entre 10 mL et 20 mL par échantillon de tissu, selon la masse tissulaire.
3. Préparation des médias
- Préparer les milieux organoïdes : milieu filtrant stérile à cellules basales avec 1 % stylo/streptocoque et 1 % insuline-transférrine-sélénium (STI) à l’aide d’une fiole filtrante de 50 mL/0,2 μm. Pour fabriquer des milieux de facteur de croissance organoïdes, ajouter le facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) à une concentration finale de 2,5 nM.
- Préparer les milieux épithéliaux mammaires : Pour fabriquer 100 mL de milieu épithélial mammaire, filtre stérile à haute teneur en glucose milieu basal commun avec 1 mL de supplément de glutamine 100x, 1 mL de stylo/streptocoque, 1 mL de tampon HEPES 10 mM (pH 7,3), 250 μL de stock de BSA à 30 %, 1 μL de 1 mg/mL de toxine cholérique, 1 mL de stock d’hydrocortisone à 50 μg/mL dans du PBS, 50 μL de solution d’insuline humaine à 10 mg/mL, 10 μL de facteur de croissance épidermique (EGF) à 50 μg/mL et 1 % de FBS à l’aide d’une fiole filtrante de 150 mL/0,2 μm. Conserver le support à 4 °C et l’utiliser jusqu’à 2 semaines.
- Préparer le lavage de l’amphotéricine : Filtre stérile PBS avec 2 % stylo/streptocoque et 2 % amphotéricine B. Conserver à 4 °C.
4. Collecte et digestion des tissus
- Tissu mammaire de souris
- Euthanasier la souris en la plaçant dans une chambre de CO 2 pendant2-5 min, puis suivre avec la luxation cervicale. Avec la face ventrale tournée vers le haut, écartez les membres de la souris et utilisez quatre aiguilles de 19 G pour épingler la souris par les pattes à une planche recouverte d’un tampon absorbant. Vaporiser avec de l’éthanol à 70% pour lisser la fourrure et désinfecter la peau. Essuyez les matières fécales avec un tampon de gaze ou un mouchoir.
- En commençant juste au-dessus de la région anogénitale, coupez vers le haut à partir de la ligne médiane à l’aide de ciseaux chirurgicaux, en prenant soin de ne pas percer le péritoine. En atteignant le menton, faites des coupes latérales le long des clavicules et des pattes postérieures, et épinglez la peau de la souris tendue à la planche pour exposer les coussinets graisseux mammaires.
- Localisez les coussinets graisseux mammaires inguinaux sur des souris de type sauvage en identifiant le ganglion lymphatique inguinal situé près des membres postérieurs. Localisez les coussinets graisseux mammaires thoraciques sur les souris de type sauvage comme le tissu vascularisé plus épais sous les membres antérieurs.
- Utilisez une pince pour élever le coussinet adipeux mammaire. Évitez de collecter le muscle sous-jacent. À l’aide de l’extrémité émoussée des ciseaux tranchants, créez une poche sous le coussinet adipeux mammaire, loin de la peau. Coupez le coussinet graisseux mammaire en un seul morceau complet.
- Une fois que les coussinets graisseux mammaires ont été retirés, rincer dans PBS avant de les placer dans un plat de culture tissulaire stérile. Transférer rapidement dans une hotte de culture tissulaire.
REMARQUE: Pour les tumeurs mammaires, utilisez un coton-tige mouillé avec PBS pour rouler doucement la tumeur loin de la peau. Assurez-vous d’éviter les zones sombres ou molles, car une décoloration foncée indique une nécrose, ce qui ne donnera pas d’organoïdes sains. - Hacher les tumeurs mammaires avec un scalpel #10 ou #11 pour détacher les tissus jusqu’à ce qu’ils atteignent une consistance pâteuse. Transférer le tissu haché dans un tube conique contenant 10 à 30 mL de solution de collagénase à l’aide d’un scalpel. Pour vous assurer que tous les tissus sont recueillis, pipeter 1 mL de solution de collagénase sur la plaque de culture tissulaire et revenir dans le tube conique.
REMARQUE: Pour produire des organoïdes plus gros, la digestion mécanique doit être minimisée, laissant quelques petits morceaux visibles de tissu intacts. Alternativement, les tissus peuvent être conservés congelés pour une préparation organoïde ultérieure avec une perte minimale de viabilité. Pour ce faire, lavez le tissu dans une solution de PBS ou de milieu de cellules basales + 1% FBS, puis hachez grossièrement pour augmenter la surface (en gardant le tissu en un ou deux morceaux solides). Déplacer le tissu dans un flacon cryogénique, recouvert d’un milieu de congélation (90% FBS + 10% diméthylsulfoxyde (DMSO)). Congeler les flacons dans un contenant de congélation à débit contrôlé pendant la nuit avant de les entreposer dans de l’azote liquide. - Placer le tube conique dans un incubateur de banc de paillasse à 37 °C à 180 tr/min jusqu’à ce que le tissu devienne filandreux et que la solution de collagénase devienne trouble. Par exemple, une grande masse tissulaire (environ 500-800 mg) d’une tumeur prend 30-60 min. Une masse tissulaire plus petite (environ 100-300 mg) à partir de coussinets graisseux mammaires de type sauvage prend environ 20-30 min. En cas d’incertitude, vérifiez à intervalles de 5 minutes.
- Après incubation, centrifuger le tube conique pendant 10 min à 550 x g à température ambiante (RT).
- Aspirez soigneusement le surnageant du tube conique.
REMARQUE: Pour aller de l’avant, pré-enduisez toutes les extrémités des pipettes, des pipettes sérologiques et des tubes coniques avec une solution BSA pour éviter la perte d’organoïdes due à l’adhérence au plastique. - Ajouter 8 mL de milieu cellulaire basal et 80 μL de solution de DNase [2 U/μL] dans le tube. Retourner doucement pendant 1-3 min.
- Ajouter 12 mL de milieu cellulaire basal dans le tube et mélanger soigneusement par pipetage ou tourner doucement le tube 15 fois pour mélanger.
- Centrifuger pendant 10 min à 550 x g à TA.
- Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension la pastille dans 12 mL de milieu cellulaire basal.
- Laissez les fragments de tissu les plus lourds se déposer au fond. Recueillir le surnageant avec une pipette sérologique et le transférer dans un tube conique de 15 mL. Cette suspension contient des organoïdes épithéliaux et des cellules stromales/immunitaires.
- Tissu mammaire humain
- Traiter les échantillons de tissus mammaires humains pour les organoïdes ou les stocker dans les 24 heures suivant le prélèvement. Conserver les échantillons à 4 °C dans un milieu indépendant du CO2 avec 1% 100x antibiotique-antimycotique.
- Transférer le tissu dans une plaque de culture tissulaire. Inclinez la plaque et aspirez l’excès de milieu de stockage, puis rincez le mouchoir avec 5 mL de lavage à l’amphotéricine B. Retirez immédiatement le lavage à l’amphotéricine B.
- Hachez l’échantillon de tissu avec un scalpel #10 ou #11 pour détacher le tissu jusqu’à ce qu’il atteigne une consistance pâteuse. Transférer le tissu haché dans un tube conique contenant 10 à 30 mL de solution de collagénase à l’aide d’un scalpel. Pour vous assurer que tous les tissus sont recueillis, pipeter 1 mL de solution de collagénase sur la plaque de culture tissulaire et retourner dans le tube conique.
REMARQUE: Pour produire des organoïdes plus gros, la digestion mécanique doit être minimisée, laissant quelques petits morceaux visibles de tissu intacts. La masse tissulaire initiale pour ce protocole variait entre 100 et 250 mg. Alternativement, les tissus peuvent être conservés congelés pour une préparation organoïde ultérieure avec une perte minimale de viabilité après l’étape 4.2.2 dans 90% FBS + 10% DMSO comme ci-dessus. - Placez le tube conique dans un incubateur de banc de paillasse à 37 °C à 180 tr/min jusqu’à ce que le tissu devienne plus petit et que la collagénase devienne trouble. Vérifiez le tissu à intervalles de 5 minutes. La dissociation de la collagénase des échantillons humains prend environ 5-20 min.
- Après l’incubation, faire tourner le tube conique pendant 10 min à 550 x g à TA.
- Aspirez soigneusement le surnageant du tube conique.
REMARQUE: Pour aller de l’avant, pré-enduire toutes les pointes de pipettes, les pipettes sérologiques et les tubes coniques avec une solution BSA pour éviter la perte d’organoïdes due à l’adhérence au plastique. - Ajouter 4 mL de milieu cellulaire basal et 40 μL de solution de DNase [2 U/μL] dans le tube conique. Retourner doucement pendant 3 min.
- Ajouter 6 mL de milieu cellulaire basal dans le tube et mélanger soigneusement par pipetage ou tourner doucement le tube conique 15 fois pour mélanger.
- Centrifuger pendant 10 min à 550 x g à TA.
- Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieu cellulaire basal.
- Laissez les fragments de tissu les plus lourds se déposer au fond. Prélever le surnageant et le transférer dans un tube conique de 15 mL. Cette suspension contient des organoïdes épithéliaux et des cellules stromales/immunitaires.
5. Centrifugation différentielle
- Pulser à 550 x g pendant 3-4 s à TA, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu cellulaire basal. Répétez cette étape trois fois de plus (un total de quatre tours).
- Après chaque centrifugation, assurez-vous que la pastille devient de plus en plus opaque. Cette pastille restante sera constituée d’organoïdes épithéliaux.
6. Collecte de petits organoïdes
- Pulser à 80-100 x g pendant 3 s à TA. Recueillir le surnageant dans un tube frais revêtu de BSA, puis pulser à 550 x g pendant 3 s à TA pour enrober les petits organoïdes.
7. Intégration d’organoïdes dans BECM
- Suspension appropriée aliquote des organoïdes dans des tubes microcentrifugés en fonction de la densité organoïde par rapport à la quantité de BECM par puits (tableau 1). Par exemple, utilisez 50 à 100 organoïdes pour 20 μL de BECM dans un puits d’une plaque de 96 puits.
NOTE: La densité organoïde peut être comptée à l’aide de la formule suivante: ((Nombre moyen d’organoïdes)/50 μL) x facteur de dilution. - Effectuez toutes les étapes sur la glace. Placez le BECM décongelé sur de la glace dans une hotte de culture tissulaire. Pendant la préparation de la hotte, placez toutes les pointes de pipette sur de la glace pour refroidir.
- Centrifuger les tubes de microcentrifugation pendant 10 min à 300 x g à TA. Jeter le surnageant des tubes. Déplacer les tubes contenant des pastilles organoïdes dans de la glace et ajouter le volume approprié de BECM à chaque tube de microcentrifugation (tableau 1).
REMARQUE: Puisque BECM est visqueux, ajoutez des volumes supplémentaires (environ 10% -20% supplémentaires du volume du dôme) de BECM pour tenir compte de la perte dans la pointe de la pipette. - Pipeter doucement de haut en bas pour remettre en suspension les organoïdes dans BECM, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
- Pipeter lentement et soigneusement les organoïdes suspendus BECM sur la surface de placage. Pendant le pipetage, soulevez lentement la pipette pour créer un dôme. Remplissez tous les puits vides avec du PBS pour maintenir l’humidité.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h pour permettre à BECM de se solidifier, puis couvrir avec le volume approprié de média (tableau 1).
8. Intégration d’organoïdes dans le collagène
- Effectuez toutes les étapes sur la glace. Préparer la solution de collagène en combinant, dans l’ordre séquentiel, 375 μL de DMEM 10x, 100 μL d’hydroxyde de sodium 1 N (NaOH) et 3 mL de solution de collagène I de queue de rat dans un tube conique de 15 mL. Mélanger à pipette en prenant soin de ne pas faire de bulles. Titrer la solution à un pH de 7,2-7,4 avec de petites quantités (incréments de 1-3 μL) de NaOH ou 10x DMEM au besoin.
- Enduisez le fond des puits avec la quantité minimale de collagène nécessaire pour couvrir complètement le fond du puits. Une approche consiste à placer une petite quantité de collagène et à balancer la plaque d’un côté à l’autre pour l’enduire. Laisser les sous-couches de collagène se fixer à 37 °C pendant 30 min-2 h.
- Aliquote la suspension appropriée des organoïdes dans des tubes de microcentrifugation en fonction de la densité organoïde par rapport à la quantité de collagène par puits (tableau 1). Placer dans un incubateur à 37 °C.
- Conservez la solution de collagène à 4 °C et surveillez la polymérisation en vérifiant la formation de fibres au microscope toutes les 10 minutes. Le collagène atteindra une polymérisation appropriée entre 30 min-2 h.
REMARQUE: La polymérisation correcte peut être déterminée par la présence de fibres ramifiées dans toute la matrice. Passez à l’étape 8.5 immédiatement une fois que quelques fibres sont observées dans le champ de vision. - Centrifuger les tubes de microcentrifugation à 300 x g pendant 10 min à TA. Jeter le surnageant des tubes. Déplacer les pastilles organoïdes vers de la glace et ajouter le volume approprié de collagène à chaque tube de microcentrifugation (tableau 1).
REMARQUE: Puisque le collagène est visqueux, ajoutez des volumes supplémentaires (environ 10% -20% supplémentaires du volume du dôme) de collagène pour tenir compte de la perte dans l’embout de la pipette. - Pipeter doucement de haut en bas pour remettre en suspension les organoïdes dans le collagène, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
- Pipeter lentement et soigneusement les organoïdes en suspension de collagène sur la surface de placage. Pendant le pipetage, soulevez lentement la pipette pour créer un dôme. Remplissez tous les puits vides avec du PBS pour maintenir l’humidité.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h pour permettre au collagène de se solidifier, puis recouvrir du volume de média approprié (tableau 1).
- NOTE : Les organoïdes maintiennent leur viabilité dans la matrice 3D jusqu’à 7 jours. Si l’imagerie est utilisée pour l’analyse, passez aux étapes 9 et 10.
9. Fixation des organoïdes embarqués
- Utilisez une pipette pour retirer tous les fluides des puits sans entrer en contact avec les dômes ECM.
- Fixer avec une solution de paraformaldéhyde (PFA)/PBS à 4 % pendant 5 min.
- Lavez deux à trois fois en appliquant du PBS sur les puits après les avoir placés sur un agitateur à déplacement lent. Après le lavage, appliquer du PBS frais sur les dômes et conserver la plaque à 4 °C.
10. Coloration immunofluorescente des organoïdes incorporés
- Préparation de solutions pour la coloration immunofluorescente
- Tampon de perméabilisation: Préparez une solution PBS avec 10% de Triton X-100.
- Tampon de blocage : Préparez une solution PBS avec 10 % FBS et 0,2 % de Triton X-100.
- Tampon de dilution des anticorps : Préparer une solution de PBS avec 2 % de FBS et 0,2 % de Triton X-100.
- Perméabilisation et blocage
- Pipette suffisamment de tampon de perméabilisation pour couvrir les dômes ECM. Incuber pendant 1 h à TA sur un agitateur à déplacement lent.
- Retirer le tampon de perméabilisation à l’aide d’une pipette et appliquer le même volume de tampon de blocage pendant 3 h.
- Incubation d’anticorps primaires
- Retirer le tampon de blocage à l’aide d’une pipette et appliquer le tampon de dilution des anticorps contenant l’anticorps primaire aux concentrations spécifiées par le fabricant. Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 12-16 h sur un agitateur à déplacement lent.
- Retirer la solution d’anticorps primaires et laver les échantillons trois fois pendant 10 minutes avec PBS at RT sur un agitateur à déplacement lent.
- Incubation d’anticorps secondaires et coloration nucléaire
- Aspirer le PBS restant laver et appliquer le tampon de dilution d’anticorps contenant l’anticorps secondaire aux concentrations spécifiées par le fabricant. De plus, ajoutez DAPI ou Hoechst (pour marquer les noyaux) ou la phalloïdine (pour marquer l’actine) au tampon à un rapport de 1:250. Incuber pendant 2-4 h à TA sur un agitateur à déplacement lent.
- Retirer la solution d’anticorps secondaires et laver les échantillons trois fois pendant 10 minutes dans du PBS à TA sur un agitateur. Conservez les échantillons dans du PBS à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les images présentées à la figure 1 fournissent un exemple d’organoïdes épithéliaux mammaires de type sauvage et tumoral provenant de tissus humains et murins. Une illustration en un coup d’œil de la méthode d’isolement des organoïdes épithéliaux par centrifugation différentielle est fournie dans le flux de travail de la bande dessinée de la figure 1A, montrant que les tissus primaires de différentes espèces peuvent être traités de manière presque identique tout en produisant du tissu épithélial, comme le montrent les images en fond clair (Figure 1B ). De plus, ces similitudes de composition tissulaire inter-espèces peuvent être observées dans les images immunofluorescentes d’organoïdes intégrés dans la matrice extracellulaire du socle ou le collagène illustrées à la figure 2A-D. La structure organoïde peut être visualisée par marquage membranaire de la tomate (mTomato) ou par coloration de la phalloïdine de l’actine. Ces figures montrent également la composition et la taille des organoïdes attendues en utilisant cette méthode. Les organoïdes incorporés dans la matrice de collagène peuvent être utilisés pour un test d’invasion et analysés en suivant l’expansion des vrilles se ramifiant à partir de l’organoïde lui-même, comme le montre la figure 2C. Enfin, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) des organoïdes incorporés à la paraffine montre que les organoïdes maintiennent la même histologie du cancer du sein (Figure 2E).
Figure 1 : Flux de travail pour la génération d’organoïdes épithéliaux avec exemple d’organoïdes. (A) Schéma du flux de travail pour la génération d’organoïdes à partir de tissus de souris ou humains sans passage. (B) Images représentatives d’organoïdes épithéliaux isolés provenant de glandes mammaires de souris, de tumeurs mammaires de souris et de tumeurs mammaires humaines dans des milieux après isolement. Chaque image a été ajustée individuellement pour la luminosité et le contraste afin d’améliorer la visualisation. Les images ont été prises en fond clair sur un microscope épifluorescent inversé à un grossissement de 10x. La barre d’échelle représente 20 μm. Les tumeurs mammaires ont été isolées chez des souris MMTV-PyMT; le tissu mammaire normal a été isolé chez des souris FVB. Les souris étaient âgées de 8 à 14 semaines de29 ans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie des organoïdes dans la matrice extracellulaire. Chaque image a été ajustée individuellement pour la luminosité et le contraste afin d’améliorer la visualisation de cette collection. Avant l’imagerie, les échantillons ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde. Des échantillons de type sauvage ont été colorés avec de la phalloïdine 568 pour visualiser la membrane cellulaire et tous les échantillons ont été colorés avec Hoechst pour visualiser les noyaux, montrant la morphologie et la densité organoïdes. Les images ont été prises à un grossissement de 10x sur un microscope confocal et agrandies avec un zoom de balayage de 3,003. La longueur d’onde laser utilisée pour détecter DAPI était de 405 nm avec une puissance de 5 et la longueur d’onde laser utilisée pour détecter la phalloïdine était de 561,0 nm pour le canal 3 avec une puissance de 0,5. La taille confocale des sténopés a été maintenue à 19,16 pour toutes les images. (A) Image représentative en fond clair de l’organoïde WT mammaire de souris intégré dans la BECM au jour 0. (A') 1:250 noyaux de marquage Hoechst et (A'') 1:250 phalloïdine marquant actine immunofluorescent images de A. La barre d’échelle représente 20 μm. Le tissu mammaire normal a été isolé chez des souris FVB. Les souris étaient âgées de 8 à 12 semaines. (B) Image représentative en fond clair de l’organoïde tumoral mammaire de souris intégré dans BECM au jour 0. (B') 1:250 noyaux de marquage Hoechst et (B'') image immunofluorescente marquée par mTomate de B. La barre d’échelle représente 20 μm. Les tumeurs mammaires ont été isolées chez des souris MMTV-PyMT. Les souris étaient âgées de 12 à 14 semaines. (C) Image représentative en fond clair d’organoïde tumoral mammaire de souris incorporé dans le collagène I au jour 3. L’image représente un organoïde démontrant une propriété « invasive ». (C') 1:250 noyaux de marquage Hoechst et (C') image immunofluorescente marquée par mTomate de C. La barre d’échelle représente 20 μm. Les tumeurs mammaires ont été isolées chez des souris MMTV-PyMT. Les souris étaient âgées de 12 à 14 semaines. (D) Image représentative en fond clair de l’organoïde de la tumeur mammaire humaine intégrée dans la BECM au jour 0. (D') Noyaux de marquage Hoechst et (D'') 1:250 Image immunofluorescente marquée à la phalloïdine ciblant l’actine de D. La barre d’échelle représente 20 μm. (E) Image en coupe d’un organoïde incorporé dans BECM et coloré avec H & E prise à un grossissement de 20x. La barre d’échelle représente 20 μm. La coloration H & E a été réalisée par la ressource partagée30 de la gestion des tissus du sud-ouest de l’Université du Texas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Plaque de culture | Volume du dôme ECM | Nombre recommandé d’organoïdes | Volume des médias |
| Plaque 6 puits | 200 μL | 300 | 3 mL |
| Plaque à 12 puits | 150 μL | 225 | 2 mL |
| Plaque de 24 puits | 100 μL | 150 | 1 mL |
| Plaque de 48 puits | 40 μL | 60 | 300 μL |
| Plaque de 96 puits | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tableau 1 : Volume recommandé de composants ECM pour les dômes, densité des organoïdes et volume de milieux nécessaires par puits sur différentes plaques de culture.
| Problème | Cause potentielle | Solution | |||
| Les dômes ECM se sont effondrés. | La plaque était secouée, le volume de l’ECM était trop important pour que la forme du dôme soit maintenue, ou les dômes touchaient le bord du puits, les faisant coller et tomber. | Évitez de déplacer la plaque trop vigoureusement avant que les dômes n’aient pris, réduisez le volume d’ECM utilisé pour la remise en suspension des organoïdes ou faites très attention à pipeter les dômes au centre de la plaque. | |||
| Il y a des tissus qui ne ressemblent pas à des organoïdes. | Le tissu musculaire ou le nerf peut avoir été recueilli dans le processus de récolte du coussinet adipeux mammaire. | Ne coupez que ce qui est clairement un coussinet graisseux mammaire. Évitez d’enlever le tissu qui adhère étroitement à la peau. | |||
| Il y a beaucoup d’organoïdes morts. | Le tissu tumoral nécrotique a été récolté. | Évitez de recueillir les tissus des tumeurs qui sont nécrotiques, kystiques, excessivement molles ou de couleur plus foncée. Le tissu tumoral doit être ferme. | |||
| Il y a plus de cellules individuelles que d’organoïdes. | Les tissus ont été hachés trop finement ou la digestion de la collagénase a été effectuée trop longtemps. | Évitez de trop hacher le tissu ou de réduire le temps d’incubation de la collagénase. | |||
| Il y a des bulles dans l’ECM. | La remise en suspension par pipetage était trop vigoureuse et l’éjection pendant le pipetage des dômes était trop rapide. | Remettez lentement en suspension les organoïdes dans l’ECM et pipetez-les lentement dans des dômes. Si le problème persiste, évitez d’aller au deuxième arrêt pendant le pipetage. | |||
| Il n’y a pas d’invasion d’organoïdes dans le collagène. | Le collagène n’était pas correctement polymérisé ou sur-polymérisé. | Ne pas remettre en suspension l’organoïde dans le collagène jusqu’à ce qu’il soit correctement polymérisé. Vérifiez toutes les 30 minutes. Si aucune polymérisation n’est visible, remettre en suspension à la marque 2 h et plaquer immédiatement. | |||
| Il n’y a pas de fibres de collagène visibles lors de la surveillance de la polymérisation. | Les réglages du microscope n’étaient pas favorables. | Ajustez le contraste de phase pour une obscurité maximale, puis augmentez complètement la luminosité du microscope. De plus, l’augmentation du grossissement peut améliorer la visualisation. | |||
| Les dômes ECM se sont dissous. | Le temps de fixation était trop long ou le PFA n’était pas complètement retiré des échantillons intégrés à l’ECM. | Maintenez le temps de fixation des dômes ECM en dessous de 5 min et poursuivez avec cinq lavages sur un agitateur rotatif pendant 5 minutes chacun. | |||
Tableau 2 : Tableau des problèmes potentiels, des causes et des solutions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Différentes méthodes ont été décrites dans la littérature pour générer des organoïdes tumoraux. Ce protocole met en évidence une méthode permettant de générer des organoïdes tumoraux directement à partir de la tumeur sans passer. En utilisant cette méthode, les organoïdes tumoraux sont productibles dans les heures suivant le début de la procédure et génèrent près de 100% d’organoïdes viables contre 70% rapportés dans la littérature31. En comparaison, d’autres méthodes nécessitent le passage en série de cellules dans des organoïdes sur plusieurs semaines. Ainsi, les applications en aval, telles que la détermination et la visualisation des interactions des cellules immunitaires avec des échantillons organoïdes et immunitaires appariés du même hôte sans l’impact de la culture à long terme, deviennent plus réalisables. De plus, comme le souligne la figure 2C, l’intégration d’organoïdes tumoraux dans différentes matrices extracellulaires peut permettre l’identification de phénotypes clés tout au long de la cascade métastatique, tels que l’invasion hors de la tumeur primaire. D’autres applications en aval comprennent des tests phénotypiques de morphogenèseramifiée 32, d’invasion, de dissémination et de formation de colonies33 pour évaluer divers comportements des cellules épithéliales. Les interactions immunitaires peuvent également être capturées fonctionnellement et visuellement avec ces tests organoïdes. En outre, les gels peuvent être dissous pour isoler les cellules incorporées pour l’analyse en aval du contenu génétique et protéique à l’aide de tests biochimiques standard et basés sur le flux. Enfin, comme de grandes quantités d’organoïdes peuvent être rapidement générées à partir de tissus tumoraux, ces tests peuvent être mis à l’échelle pour des applications de criblage de médicaments et une intégration dans les flux de travail des essais cliniques.
Plusieurs étapes clés sont essentielles à ce protocole. Premièrement, le temps nécessaire à la digestion de la collagénase dépend de la composition tissulaire et de la quantité de tissu digéré. Par exemple, lorsque vous travaillez avec de plus petits morceaux de tissu, tels que des échantillons chirurgicaux de tumeurs mammaires humaines (en moyenne 100-250 mg), un temps de digestion plus court est nécessaire. Cependant, les tumeurs mammaires récoltées sur une souris sont beaucoup plus grandes (500-800 mg) et peuvent nécessiter 30-60 min de digestion enzymatique. Deuxièmement, pour assurer un rendement maximal en organoïdes épithéliaux, il est également important d’enduire tous les embouts de pipettes et les épipets sérologiques de BSA pour éviter toute perte d’adhésion cellulaire au plastique. Troisièmement, un bref temps de centrifugation différentielle est crucial pour éliminer les composants tissulaires non épithéliaux. Cette approche permet aux organoïdes épithéliaux plus lourds de granuler tandis que les compartiments stromaux et immunitaires plus légers restent dans le surnageant. Pour créer des tests d’invasion en incorporant des organoïdes dans le collagène, il est essentiel de permettre une polymérisation correcte du collagène avant d’incorporer les organoïdes. Cette étape doit être vérifiée visuellement en confirmant la formation de fibres de collagène au microscope optique. Enfin, pour de meilleurs résultats d’imagerie, veillez à éviter de produire des bulles lors de la remise en suspension des organoïdes dans l’ECM et le placage. Les bulles obscurciront les organoïdes dans le gel et déformeront les images. Le tableau 2 énumère les problèmes potentiels qui ont été rencontrés et les solutions pour surmonter ces défis.
Certaines étapes du protocole permettent de modifier la taille des organoïdes générés ou de réduire le temps nécessaire à l’exécution du protocole. Par exemple, l’augmentation de la durée du temps de digestion mécanique peut entraîner un temps de digestion de collagénase plus court, des organoïdes plus petits et plus de cellules individuelles. La centrifugation après la digestion de la collagénase peut être raccourcie à 5 min si vous travaillez avec une grande quantité de tissu tumoral. Les milieux utilisés pour la culture et la culture des organoïdes peuvent être préparés un jour avant pour gagner du temps pendant les étapes de génération des organoïdes. De même, le tissu tumoral peut être stocké jusqu’à 24 heures dans des milieux appropriés avant la préparation organoïde. Si le temps est extrêmement limité, ce protocole comprend des étapes de pause en congelant le tissu tumoral le jour de la collecte. Ensuite, ces tissus congelés peuvent être utilisés pour générer des organoïdes viables à une date ultérieure. Environ 90% des organoïdes dérivés du tissu congelé étaient viables, confirmés visuellement au microscope optique et avec une solution de bleu trypan.
Il y a certaines limites à ce protocole. Bien que cette approche génère rapidement des organoïdes viables, la quantité d’organoïdes générés est limitée par la quantité de tissu tumoral. Cette limitation devient particulièrement évidente lorsque l’on travaille avec des échantillons cliniques dans lesquels la quantité de tissu tumoral est inférieure ou, parfois, même limitée à quelques cellules. Dans les cas extrêmes où seules quelques cellules peuvent être récupérées comme matière première, le passage peut être une meilleure option. Une autre limite est l’approche réductionniste de cette méthode. L’élimination des compartiments stromaux tels que les fibroblastes ou les cellules endothéliales enrichit la génération d’organoïdes épithéliaux. Cependant, ces populations cellulaires sont essentielles à la fonction de la tumeur. Par conséquent, leur élimination limite l’interprétation de la biologie tumorale dérivée uniquement de modèles organoïdes épithéliaux. En conclusion, ce protocole fournit une approche pour la génération rapide d’organoïdes épithéliaux pour une utilisation immédiate dans l’imagerie en aval, fonctionnelle (y compris les interactions immunitaires) et les applications de criblage de médicaments.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par METAvivor, le Peter Carlson Trust, la Theresa’s Research Foundation et le NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Nous remercions l’aide de la Southwestern Tissue Management Shared Resource de l’Université du Texas, une ressource partagée du Simmons Comprehensive Cancer Center, qui est soutenue en partie par le National Cancer Institute sous le numéro d’attribution P30 CA142543. Un merci spécial à tous les membres du Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
