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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

सामान्य और ट्यूमर स्तन ऊतक से माउस और मानव उपकला ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना और इमेजिंग करना

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64626
Automatic Translation
1,2, 2,3,4,5, 1,2, 1,2, 1,2, 6, 1,2, 2,3,4,5, 1,2,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 6Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

यह प्रोटोकॉल अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से प्राथमिक सामान्य और ट्यूमर स्तन ऊतक से उपकला ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण पर चर्चा करता है। इसके अलावा, तीन आयामी संवर्धन के साथ-साथ एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए निर्देश शामिल हैं।

Abstract

ऑर्गेनोइड्स अपने आत्म-आयोजन गुणों और प्राथमिक ऊतक या स्टेम कोशिकाओं से प्रसार के बाद कार्य और वास्तुकला के प्रतिधारण के कारण अंग ऊतक मॉडलिंग के लिए एक विश्वसनीय विधि है। ऑर्गेनॉइड पीढ़ी की यह विधि कई मार्गों के माध्यम से एकल-कोशिका भेदभाव को दूर करती है और इसके बजाय यांत्रिक और एंजाइमेटिक रूप से अलग ऊतकों से स्तन उपकला ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करती है। यह प्रोटोकॉल कोलेजन और बेसमेंट बाह्य मैट्रिक्स में ऑर्गेनॉइड एम्बेडिंग के लिए तकनीकों के अलावा माउस और मानव स्तन ऊतक दोनों से छोटे और बड़े उपकला ऑर्गेनोइड्स के तेजी से उत्पादन के लिए एक सुव्यवस्थित तकनीक प्रदान करता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान और घनत्व की कल्पना करने के उद्देश्य से इन-जेल निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के निर्देश प्रदान किए जाते हैं। ये पद्धतियां असंख्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन और कोलेजन आक्रमण परख के माध्यम से विवो मेटास्टेसिस मॉडलिंग। ये विश्लेषण सेल-सेल व्यवहार को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर बातचीत की अधिक पूर्ण समझ बनाने के लिए काम करते हैं।

Introduction

विट्रो में उपकला कोशिकाओं को मॉडल करने की क्षमता आधुनिक जैव चिकित्सा अनुसंधान की नींव रही है क्योंकि यह सेलुलर विशेषताओं को पकड़ती है जो विवो में सुलभ नहीं हैं। उदाहरण के लिए, दो-आयामी विमान में बढ़ती उपकला कोशिका रेखाएं प्रसार1 के दौरान उपकला कोशिका में होने वाले आणविक परिवर्तनों का आकलन प्रदान कर सकती हैं। इसके अलावा, सिग्नलिंग और जीन अभिव्यक्ति के बीच गतिशील विनियमन को मापना विवो सिस्टम2 में सीमित है। कैंसर अनुसंधान में, कैंसर उपकला सेल लाइन मॉडलिंग ने रोग की प्रगति और संभावित दवा लक्ष्यों के आणविक ड्राइवरों की पहचान को सक्षमकिया है। हालांकि, दो-आयामी विमान पर बढ़ते कैंसर उपकला कोशिका लाइनों की सीमाएं हैं, क्योंकि अधिकांश आनुवंशिक रूप से अमर और संशोधित होते हैं, अक्सर प्रकृति में क्लोनल होते हैं, गैर-शारीरिक स्थितियों में बढ़ने की उनकी क्षमता के लिए चुने जाते हैं, तीन-आयामी (3 डी) ट्यूमर ऊतक वास्तुकला के उनके मूल्यांकन में सीमित होते हैं, और यथार्थवादी ऊतक वातावरणके भीतर माइक्रोएन्वायरमेंट इंटरैक्शन को पर्याप्त रूप से मॉडल नहीं करते हैं। ये बाधाएं विशेष रूप से मॉडलिंग मेटास्टेसिस में स्पष्ट हैं, जिसमें विवो में कई अलग-अलग जैविक चरण शामिल हैं, जिनमें दूर के अंग स्थल5 पर आक्रमण, प्रसार, परिसंचरण और उपनिवेशीकरण शामिल हैं।

कैंसर उपकला ऑर्गेनोइड्स को ट्यूमर 6,7,8 के 3 डी वातावरण और व्यवहार को बेहतर ढंग से पुन: व्यवस्थित करने के लिए विकसित किया गया है। ऑर्गेनोइड्स को पहली बार एकल एलआरजी 5 + आंतों के क्रिप्ट कोशिकाओं से विकसित किया गया था और क्रिप्ट-विलस इकाइयों की 3 डी संरचना का प्रतिनिधित्व करने के लिए विभेदित किया गया था जो विट्रो 9 में छोटी आंत की पदानुक्रमित संरचना को बनाए रखते थे। इस दृष्टिकोण ने होमोस्टेटिक और तनाव स्थितियों के तहत आत्म-व्यवस्थित ऊतक वास्तुकला के वास्तविक समय के विज़ुअलाइज़ेशन और लक्षण वर्णन की अनुमति दी। एक प्राकृतिक विस्तार के रूप में, कैंसर उपकला ऑर्गेनोइड्स को कोलोरेक्टल 10, अग्नाशय11, स्तन 12, यकृत13, फेफड़े14, मस्तिष्क15 और गैस्ट्रिक कैंसर16 सहित कई अलग-अलग कैंसर प्रकारों को मॉडल करने के लिए विकसितकिया गया था। कैंसर एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स का उपयोग कैंसर के विकास17,18 और मेटास्टैटिक स्पैटियोटेम्पोरल व्यवहार19,20 को चिह्नित करने और ट्यूमर विषमता 21 से पूछताछ करने और केमोथेरेपी22 का परीक्षण करनेके लिए किया गया है। कैंसर एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स को भी अलग किया गया है और चल रहे नैदानिक परीक्षणों के दौरान एंटीकैंसर एजेंटों और विकिरण चिकित्सा के लिए रोगी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए एकत्र किया गया है। इसके अलावा, कैंसर उपकला ऑर्गेनोइड्स को शामिल करने वाली प्रणालियों को अन्य गैर-कैंसर कोशिकाओं, जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ जोड़ा जा सकता है, ताकि वास्तविक समय में बातचीत की कल्पना करने के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का अधिक व्यापक मॉडल बनाया जा सके, यह उजागर किया जा सके कि कैंसर उपकला कोशिकाएं प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं जैसे साइटोटोक्सिक प्रभावक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मौलिक प्रकृति को कैसे बदलती हैं, और संभावित इम्यूनोथेरेपी और एंटीबॉडी-ड्रग निर्भर साइटोटोक्सिक गतिविधिका परीक्षण करती हैं। 27,28. यह लेख कोलेजन और बेसमेंट एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में पासिंग और एम्बेडिंग के बिना उपकला ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने की एक विधि को प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, पृथक ऑर्गेनोइड्स की डाउनस्ट्रीम इमेजिंग के लिए तकनीकें भी साझा की जाती हैं।

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Protocol

इस पांडुलिपि में उपयोग किए गए सभी माउस ऊतक को टेक्सास साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार नैतिक रूप से एकत्र किया गया है। इसी तरह, सभी रोगियों ने एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) की निगरानी में ऊतक दान से पहले सहमति दी, और नमूनों की पहचान नहीं की गई।

नोट: यह प्रोटोकॉल प्राथमिक ऊतक से ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी का वर्णन करता है।

1. सामग्री की रात भर तैयारी

  1. बेसमेंट एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (बीईसीएम) में एम्बेड करने के लिए, बीईसीएम एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़कर पिघलाएं।

2. कोलेजनेज और गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) कोटिंग समाधान तैयार करना

  1. पीबीएस कोटिंग समाधान (बीएसए समाधान): 50 एमएल / 0.2 μm फिल्टर फ्लास्क का उपयोग करके 50 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) और 4.10 एमएल 30% बीएसए समाधान तैयार करें। इस बीएसए समाधान को फ़िल्टर किया जा सकता है और फिर से उपयोग किया जा सकता है।
  2. माउस स्तन ऊतक के लिए कोलेजनेज समाधान तैयार करें: बेसल सेल माध्यम के 27 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 1.5 एमएल, 50 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के 30 μL, 10 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन के 15 μL, 0.1 ग्राम / एमएल कोलेजनेज ए के 600 μL, और 50 mL / ऊतक द्रव्यमान के आधार पर प्रति माउस 10 एमएल और 30 एमएल कोलेजनेज समाधान के बीच आवंटित करें।
  3. मानव स्तन ऊतक के लिए कोलेजनेज समाधान तैयार करें: आरपीएमआई -1640 के बाँझ फिल्टर 18 एमएल, 100 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (पेन / स्ट्रेप) का 200 μL, 10 mM 4-(2-हाइड्रॉक्सीइथिल) -1-पिपराजिनिथेनसल्फोनिक एसिड (HEPES) बफर, 1 एमएल एफबीएस, और 0.1 ग्राम / ऊतक द्रव्यमान के आधार पर प्रति ऊतक नमूने 10 एमएल और 20 एमएल के बीच आवंटित करें।

3. मीडिया तैयार करना

  1. ऑर्गेनॉइड मीडिया तैयार करें: 50 एमएल / 0.2 μm फिल्टर फ्लास्क का उपयोग करके 1% पेन / स्ट्रेप, और 1% इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (आईटीएस) के साथ बाँझ फ़िल्टर बेसल सेल माध्यम। ऑर्गेनॉइड ग्रोथ फैक्टर मीडिया बनाने के लिए, 2.5 एनएम की अंतिम एकाग्रता में बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ) जोड़ें।
  2. स्तन उपकला मीडिया तैयार करें: स्तन उपकला मीडिया के 100 एमएल बनाने के लिए, बाँझ फ़िल्टर उच्च ग्लूकोज सामान्य बेसल माध्यम जिसमें 1 एमएल 100 एक्स ग्लूटामाइन पूरक, 1 एमएल पेन / स्ट्रेप, 10 एमएल एचईपीईएस बफर (7.3 पीएच), 250 μ L 30% बीएसए स्टॉक, 1 मिलीग्राम / एमएल हैजा टॉक्सिन स्टॉक का 1 μL, 50 μg / mL हाइड्रोकार्टिसोन स्टॉक का 1 एमएल, 10 मिलीग्राम / एमएल मानव इंसुलिन समाधान का 50 μL, 50 μg / mL एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF) स्टॉक का 10 μL, और 1% FBS 150 एमएल / 0.2 μm फ़िल्टर फ्लास्क का उपयोग करके। मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 2 सप्ताह तक उपयोग करें।
  3. एम्फोटेरिसिन वॉश तैयार करें: 2% पेन / स्ट्रेप और 2% एम्फोटेरिसिन बी के साथ बाँझ फ़िल्टर पीबीएस।

4. ऊतक को इकट्ठा करना और पचाना

  1. माउस स्तन ऊतक
    1. 2-5 मिनट के लिए सीओ 2 कक्ष में रखकर माउस को यूथेनाइज़ करें, और फिर ग्रीवा अव्यवस्था के साथ पालन करें। उदर पक्ष के ऊपर की ओर होने के साथ, माउस अंगों को स्प्ले करें और माउस को पंजे द्वारा एक शोषक पैड से ढके बोर्ड पर पिन करने के लिए चार 19 जी सुइयों का उपयोग करें। फर को चिकना करने और त्वचा को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। धुंध पैड या ऊतक के साथ मल को पोंछें।
    2. एनोजेनिटल क्षेत्र के ठीक ऊपर से शुरू होकर, सर्जिकल कैंची का उपयोग करके मध्य रेखा से ऊपर की ओर काटें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि पेरिटोनियम के माध्यम से छेद न हो। ठोड़ी तक पहुंचने पर, क्लैविकल्स और नीचे के पिछले पैरों दोनों को पार्श्व कट बनाएं, और स्तन वसा पैड को उजागर करने के लिए माउस की त्वचा को बोर्ड पर पिन करें।
    3. हिंदलिम्ब्स के पास स्थित इंगुइनल लिम्फ नोड की पहचान करके जंगली प्रकार के चूहों पर इंगुइनल स्तन वसा पैड का पता लगाएं। जंगली प्रकार के चूहों पर वक्ष स्तन वसा पैड को सामने के अंगों के नीचे मोटे, संवहनी ऊतक के रूप में खोजें।
    4. स्तन वसा पैड को ऊंचा करने के लिए बल का उपयोग करें। अंतर्निहित मांसपेशियों को इकट्ठा करने से बचें। तेज-कुंद कैंची के कुंद छोर का उपयोग करके, त्वचा से दूर स्तन वसा पैड के नीचे एक जेब बनाएं। स्तन वसा पैड को एक पूर्ण टुकड़े में काट लें।
    5. एक बार स्तन वसा पैड हटा दिए जाने के बाद, उन्हें बाँझ ऊतक संस्कृति डिश में रखने से पहले पीबीएस में कुल्ला करें। जल्दी से एक ऊतक संस्कृति हुड में स्थानांतरित करें।
      नोट: स्तन ट्यूमर के लिए, ट्यूमर को त्वचा से धीरे से दूर करने के लिए पीबीएस के साथ गीले कपास के फाहे का उपयोग करें। अंधेरे या नरम क्षेत्रों से बचने के लिए सुनिश्चित रहें, क्योंकि अंधेरे मलिनकिरण नेक्रोसिस को इंगित करता है, जो स्वस्थ ऑर्गेनोइड ्स उत्पन्न नहीं करेगा।
    6. स्तन ट्यूमर को # 10 या # 11 स्केलपेल के साथ जोड़कर ऊतक को ढीला करें जब तक कि यह पेस्ट जैसी स्थिरता तक न पहुंच जाए। स्केलपेल का उपयोग करके 10-30 एमएल कोलेजनेज समाधान युक्त शंक्वाकार ट्यूब में कीमा ऊतक को स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी ऊतक एकत्र किए जाते हैं, ऊतक संवर्धन प्लेट पर और शंक्वाकार ट्यूब में वापस कोलेजनेज समाधान के 1 एमएल पिपेट।
      नोट: बड़े ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन करने के लिए, यांत्रिक पाचन को कम से कम किया जाना चाहिए, जिससे ऊतक के कुछ छोटे दिखाई देने वाले टुकड़े बरकरार रहें। वैकल्पिक रूप से, ऊतक को व्यवहार्यता में न्यूनतम नुकसान के साथ बाद में ऑर्गेनॉइड तैयारी के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, पीबीएस या बेसल सेल मीडिया + 1% एफबीएस के घोल में ऊतक धोएं, और फिर सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए मोटे तौर पर कीमा करें (ऊतक को एक या दो ठोस टुकड़ों में रखें)। ऊतक को क्रायो-शीशी में ले जाएं, फ्रीजिंग मीडिया (90% एफबीएस + 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ)) के साथ शीर्ष पर। तरल नाइट्रोजन में भंडारण के लिए जाने से पहले शीशियों को रात भर एक नियंत्रित-दर फ्रीजिंग कंटेनर में फ्रीज करें।
    7. शंक्वाकार ट्यूब को 180 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस बेंचटॉप हिलाने वाले इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि ऊतक तारदार न हो जाए और कोलेजनेज समाधान बादल न हो जाए। उदाहरण के लिए, एक ट्यूमर से एक बड़े ऊतक द्रव्यमान (लगभग 500-800 मिलीग्राम) में 30-60 मिनट लगते हैं। जंगली प्रकार के स्तन वसा पैड से एक छोटा ऊतक द्रव्यमान (लगभग 100-300 मिलीग्राम) लगभग 20-30 मिनट लगता है। यदि अनिश्चित है, तो 5 मिनट के अंतराल पर जांचें।
    8. इनक्यूबेशन के बाद, शंक्वाकार ट्यूब को कमरे के तापमान (आरटी) पर 550 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    9. शंक्वाकार ट्यूब से सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक तैयार करें।
      नोट: प्लास्टिक के आसंजन के कारण ऑर्गेनोइड्स के नुकसान से बचने के लिए आगे बढ़ते हुए, बीएसए समाधान के साथ सभी पिपेट टिप्स, सीरोलॉजिकल पिपेट और शंक्वाकार ट्यूबों को प्री-कोट करें।
    10. ट्यूब में 8 एमएल बेसल सेल मीडिया और 80 μL DNase घोल [2 U/μL] जोड़ें। 1-3 मिनट के लिए धीरे से पलटें।
    11. ट्यूब में 12 एमएल बेसल सेल मीडिया जोड़ें और ध्यान से पाइपिंग द्वारा मिलाएं या मिश्रण करने के लिए ट्यूब को 15 बार धीरे से घुमाएं।
    12. आरटी पर 550 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    13. सुपरनैटेंट को एस्पिरेटेड करें, और फिर 12 एमएल बेसल सेल मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें।
    14. सबसे भारी ऊतक के टुकड़े नीचे तक बसने दें। एक सीरोलॉजिकल पाइप के साथ सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस निलंबन में उपकला ऑर्गेनोइड्स और स्ट्रोमल / प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं।
  2. मानव स्तन ऊतक
    1. ऑर्गेनोइड्स के लिए मानव स्तन ऊतक के नमूनों को संसाधित करें या उन्हें संग्रह के 24 घंटे के भीतर संग्रहीत करें। 1% 100x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ सीओ2-स्वतंत्र मीडिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
    2. ऊतक को एक ऊतक संवर्धन प्लेट में स्थानांतरित करें। प्लेट को झुकाएं और अतिरिक्त भंडारण मीडिया को एस्पिरेट करें, और फिर एम्फोटेरिसिन बी वॉश के 5 एमएल के साथ ऊतक को कुल्ला करें। एम्फोटेरिसिन बी वॉश को तुरंत हटा दें।
    3. ऊतक के नमूने को # 10 या # 11 स्केलपेल के साथ कीमा करें ताकि ऊतक को ढीला किया जा सके जब तक कि यह पेस्ट जैसी स्थिरता तक न पहुंच जाए। स्केलपेल का उपयोग करके 10-30 एमएल कोलेजनेज समाधान युक्त शंक्वाकार ट्यूब में कीमा ऊतक को स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी ऊतक एकत्र किए गए हैं, ऊतक संवर्धन प्लेट पर कोलेजनेज समाधान के 1 एमएल पिपेट करें और शंक्वाकार ट्यूब पर लौटें।
      नोट: बड़े ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन करने के लिए, यांत्रिक पाचन को कम से कम किया जाना चाहिए, जिससे ऊतक के कुछ छोटे दिखाई देने वाले टुकड़े बरकरार रहें। इस प्रोटोकॉल के लिए प्रारंभिक ऊतक द्रव्यमान 100-250 मिलीग्राम के बीच था। वैकल्पिक रूप से, ऊतक को ऊपर दिए गए अनुसार 90% एफबीएस + 10% डीएमएसओ में चरण 4.2.2 के बाद व्यवहार्यता में न्यूनतम नुकसान के साथ बाद में ऑर्गेनॉइड तैयारी के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. शंक्वाकार ट्यूब को 180 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस बेंचटॉप हिलाने वाले इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि ऊतक छोटा न हो जाए और कोलेजनेज बादल न हो जाए। 5 मिनट के अंतराल पर ऊतक की जांच करें। मानव नमूनों के कोलेजनेज पृथक्करण में लगभग 5-20 मिनट लगते हैं।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, शंक्वाकार ट्यूब को आरटी पर 550 x g पर 10 मिनट के लिए घुमाएं।
    6. शंक्वाकार ट्यूब से सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक तैयार करें।
      नोट: आगे बढ़ते हुए, प्लास्टिक के आसंजन के कारण ऑर्गेनोइड्स के नुकसान से बचने के लिए बीएसए समाधान के साथ सभी पिपेट युक्तियों, सीरोलॉजिकल पिपेट और शंक्वाकार ट्यूबों को प्री-कोट करें।
    7. शंक्वाकार ट्यूब में 4 एमएल बेसल सेल मीडिया और 40 μL DNase घोल [2 U / μL] जोड़ें। 3 मिनट के लिए धीरे से पलटें।
    8. ट्यूब में 6 एमएल बेसल सेल मीडिया जोड़ें और ध्यान से पाइपिंग द्वारा मिलाएं या धीरे से शंक्वाकार ट्यूब को मिश्रण करने के लिए 15 बार घुमाएं।
    9. आरटी पर 550 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    10. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और फिर 10 एमएल बेसल सेल मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें।
    11. सबसे भारी ऊतक के टुकड़े नीचे तक बसने दें। सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस निलंबन में उपकला ऑर्गेनोइड्स और स्ट्रोमल / प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं।

5. विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन

  1. आरटी में 3-4 सेकंड के लिए 550 x g तक पल्स करें, सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें, और 10 एमएल बेसल सेल मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें। इस चरण को तीन बार दोहराएं (कुल चार स्पिन)।
  2. प्रत्येक सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुनिश्चित करें कि गोली तेजी से अपारदर्शी हो जाती है। यह शेष गोली उपकला ऑर्गेनोइड्स होगी।

6. छोटे ऑर्गेनोइड्स एकत्र करना

  1. सुपरनैटेंट को एक ताजा बीएसए-लेपित ट्यूब में इकट्ठा करें, और फिर आरटी में 3 सेकंड के लिए 550 x g तक पल्स करें ताकि छोटे ऑर्गेनोइड्स को पेलेट किया जा सके।

7. बीईसीएम में ऑर्गेनोइड्स एम्बेड करना

  1. बीईसीएम प्रति कुएं की मात्रा के सापेक्ष ऑर्गेनोइड घनत्व के अनुसार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ऑर्गेनोइड्स का उचित निलंबन (तालिका 1)। उदाहरण के लिए, 96-वेल प्लेट के एक कुएं में बीईसीएम के 20 μL के लिए 50-100 ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करें।
    नोट: ऑर्गेनोइड घनत्व को निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके गिना जा सकता है: (ऑर्गेनोइड्स की औसत संख्या)/50 μL) x कमजोर पड़ने वाला कारक।
  2. बर्फ पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें। पिघले हुए बीईसीएम को एक टिशू कल्चर हुड में बर्फ पर रखें। हुड तैयार करते समय, सभी पिपेट युक्तियों को बर्फ पर ठंडा करने के लिए रखें।
  3. RT पर 300 x g पर 10 मिनट के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूबों से सतह पर तैरने वाले को हटा दें। ऑर्गेनॉइड छर्रों के साथ ट्यूबों को बर्फ में ले जाएं और प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बीईसीएम की उचित मात्रा जोड़ें (तालिका 1)।
    नोट: चूंकि बीईसीएम चिपचिपा है, इसलिए पाइप टिप में नुकसान के लिए बीईसीएम के अतिरिक्त वॉल्यूम (गुंबद की मात्रा से लगभग 10% -20% अतिरिक्त) जोड़ें।
  4. बीईसीएम में ऑर्गेनोइड्स को फिर से निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें, इस बात का ध्यान रखें कि बुलबुले का उत्पादन न करें।
  5. धीरे-धीरे और सावधानी से बीईसीएम-निलंबित ऑर्गेनोइड्स को चढ़ाना सतह पर पाइप करें। पाइपिंग करते समय, गुंबद बनाने के लिए धीरे-धीरे पिपेट को ऊपर लाएं। आर्द्रता बनाए रखने के लिए सभी खाली कुओं को पीबीएस से भरें।
  6. बीईसीएम को ठोस बनाने की अनुमति देने के लिए प्लेट को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, और फिर मीडिया की उचित मात्रा के साथ कवर करें (तालिका 1)।

8. कोलेजन में ऑर्गेनोइड्स एम्बेड करना

  1. बर्फ पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें। अनुक्रमिक क्रम में, 10x DMEM के 375 μL, 1 N सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) के 100 μL, और 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में चूहे पूंछ कोलेजन I समाधान के 3 mL संयोजन द्वारा कोलेजन समाधान तैयार करें। पिपेट मिश्रण, बुलबुले न बनाने का ध्यान रखते हुए। समाधान को आवश्यकतानुसार NaOH या 10x DMEM की छोटी मात्रा (1-3 μL की वृद्धि) के साथ 7.2-7.4 के pH पर लिखें।
  2. कुओं के तल को पूरी तरह से कवर करने के लिए आवश्यक कोलेजन की न्यूनतम मात्रा के साथ कुओं के निचले हिस्से को कोट करें। एक दृष्टिकोण कोलेजन की एक छोटी मात्रा रखना है और प्लेट को कोट करने के लिए साइड से साइड में रॉक करना है। कोलेजन अंडरले को 30 मिनट -2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करने दें।
  3. प्रति अच्छी तरह से कोलेजन की मात्रा के सापेक्ष ऑर्गेनोइड घनत्व के अनुसार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ऑर्गेनोइड्स के उचित निलंबन को एलिकोट करें (तालिका 1)। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  4. कोलेजन समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और हर 10 मिनट में माइक्रोस्कोप के तहत फाइबर गठन की जांच करके पोलीमराइजेशन की निगरानी करें। कोलेजन 30 मिनट -2 घंटे के बीच उचित पोलीमराइजेशन तक पहुंच जाएगा।
    नोट: उचित पोलीमराइजेशन पूरे मैट्रिक्स में फाइबर शाखाओं की उपस्थिति से निर्धारित किया जा सकता है। दृश्य के क्षेत्र में कुछ तंतुओं को देखे जाने के तुरंत बाद चरण 8.5 पर आगे बढ़ें।
  5. RT पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूबों से सुपरनैटेंट को छोड़ दें। ऑर्गेनॉइड छर्रों को बर्फ में ले जाएं और प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोलेजन की उचित मात्रा जोड़ें (तालिका 1)।
    नोट: चूंकि कोलेजन चिपचिपा है, इसलिए पिपेट टिप में नुकसान के लिए कोलेजन की अतिरिक्त मात्रा (गुंबद की मात्रा का लगभग 10% -20% अतिरिक्त) जोड़ें।
  6. कोलेजन में ऑर्गेनोइड्स को फिर से निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें, इस बात का ध्यान रखें कि बुलबुले का उत्पादन न करें।
  7. धीरे-धीरे और सावधानी से कोलेजन-निलंबित ऑर्गेनोइड्स को प्लेटिंग सतह पर रखें। पाइपिंग करते समय, गुंबद बनाने के लिए धीरे-धीरे पिपेट को ऊपर लाएं। आर्द्रता बनाए रखने के लिए सभी खाली कुओं को पीबीएस से भरें।
  8. कोलेजन को जमने की अनुमति देने के लिए प्लेट को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, और फिर मीडिया की उचित मात्रा के साथ कवर करें (तालिका 1)।
  9. नोट: ऑर्गेनोइड 7 दिनों तक 3 डी मैट्रिक्स में व्यवहार्यता बनाए रखते हैं। यदि विश्लेषण के लिए इमेजिंग का उपयोग किया जा रहा है, तो चरण 9 और 10 पर आगे बढ़ें।

9. एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स को ठीक करना

  1. ईसीएम गुंबदों के साथ संपर्क किए बिना कुओं से सभी मीडिया को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  2. 5 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)/पीबीएस समाधान के साथ ठीक करें।
  3. धीरे-धीरे चलने वाले शेकर पर रखने के बाद कुओं में पीबीएस लगाकर दो से तीन बार धोएं। धोने के बाद, गुंबदों पर ताजा पीबीएस लागू करें और प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

10. एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन

  1. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के लिए समाधान तैयार करना
    1. परमेबिलाइजेशन बफर: 10% ट्राइटन एक्स -100 के साथ एक पीबीएस समाधान तैयार करें।
    2. ब्लॉकिंग बफर: 10% एफबीएस और 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ एक पीबीएस समाधान तैयार करें।
    3. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का बफर: 2% एफबीएस और 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ एक पीबीएस समाधान तैयार करें।
  2. परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग
    1. ईसीएम गुंबदों को कवर करने के लिए पिपेट पर्याप्त परमेबिलाइजेशन बफर। धीरे-धीरे चलने वाले शेकर पर आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. पिपेट के साथ परमेबिलाइजेशन बफर को हटा दें और 3 घंटे के लिए ब्लॉकिंग बफर की समान मात्रा लागू करें।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. एक पिपेट के साथ ब्लॉकिंग बफर को हटा दें और निर्माता-निर्दिष्ट सांद्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त एंटीबॉडी तनुकरण बफर लागू करें। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए धीरे-धीरे चलने वाले शेकर पर इनक्यूबेट करें।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और धीरे-धीरे चलने वाले शेकर पर आरटी में पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए नमूने को तीन बार धोएं।
  4. द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और परमाणु दाग
    1. शेष पीबीएस धोने के लिए एस्पिरेटेड करें और निर्माता-निर्दिष्ट सांद्रता पर द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर को लागू करें। इसके अतिरिक्त, 1: 250 अनुपात में बफर में DAPI या Hoechst (नाभिक लेबल करने के लिए) या फेलोइडिन (एक्टिन लेबल करने के लिए) जोड़ें। धीरे-धीरे चलने वाले शेकर पर आरटी में 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और एक शेकर पर आरटी पर पीबीएस में 10 मिनट के लिए तीन बार नमूने धोएं। इमेजिंग तक नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें।

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Representative Results

चित्रा 1 में चित्रित चित्र मानव और माउस ऊतकों से जंगली प्रकार और ट्यूमर स्तन उपकला ऑर्गेनोइड्स का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से उपकला ऑर्गेनोइड्स को अलग करने की विधि का एक नज़र में चित्रण चित्र 1 ए में कार्टून वर्कफ़्लो में प्रदान किया गया है, जिसमें दिखाया गया है कि विभिन्न प्रजातियों के प्राथमिक ऊतकों को उपकला ऊतक उत्पन्न करते समय लगभग समान तरीकों से संसाधित किया जा सकता है जैसा कि ब्राइटफील्ड छवियों में दिखाया गया है (चित्रा 1 बी) ). इसके अलावा, इन अंतर-प्रजातियों के ऊतक संरचना समानताएं चित्रा 2 ए-डी में प्रदर्शित तहखाने बाह्य मैट्रिक्स या कोलेजन में एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियों में देखी जा सकती हैं। ऑर्गेनॉइड संरचना को या तो झिल्ली टमाटर (एमटोमाटो) -लेबलिंग या एक्टिन के फैलोइडिन धुंधला होने के माध्यम से देखा जा सकता है। ये आंकड़े इस विधि का उपयोग करके अपेक्षित ऑर्गेनोइड संरचना और आकार को भी प्रदर्शित करते हैं। कोलेजन मैट्रिक्स में एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आक्रमण परख के लिए किया जा सकता है और ऑर्गेनॉइड से बाहर निकलने वाले टेंड्रिल्स के विस्तार को ट्रैक करके विश्लेषण किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 2 सी में देखा गया है। अंत में, पैराफिन-एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स के हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने से पता चलता है कि ऑर्गेनोइड स्तन कैंसर के समान हिस्टोलॉजी को बनाए रखते हैं (चित्रा 2 ई)।

Figure 1
चित्र 1: उदाहरण ऑर्गेनोइड के साथ उपकला ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए वर्कफ़्लो। (A) माउस या मानव ऊतक से ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए वर्कफ़्लो की स्कीमा। (बी) अलगाव के बाद मीडिया में माउस डब्ल्यूटी स्तन ग्रंथियों, माउस स्तन ट्यूमर और मानव स्तन ट्यूमर से पृथक उपकला ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। प्रत्येक छवि को बढ़ी हुई विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चमक और कंट्रास्ट के लिए व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया गया था। छवियों को 10x आवर्धन पर एक उल्टे एपि-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर ब्राइटफील्ड में लिया गया था। स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है। स्तन ट्यूमर एमएमटीवी-पीआईएमटी चूहों से अलग किए गए थे; सामान्य स्तन ऊतक को एफवीबी चूहों से अलग किया गया था। चूहे29 वर्ष की आयु के 8-14 सप्ताह तक थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बाह्य मैट्रिक्स में इमेजिंग ऑर्गेनोइड्स। प्रत्येक छवि को इस संग्रह के लिए उन्नत विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चमक और कंट्रास्ट के लिए व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया गया था। इमेजिंग से पहले, नमूने 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किए गए थे। कोशिका झिल्ली की कल्पना करने के लिए जंगली प्रकार के नमूनों को फेलोइडिन 568 से दाग दिया गया था और सभी नमूनों को नाभिक की कल्पना करने के लिए होचस्ट के साथ दाग दिया गया था, जो ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान और घनत्व दिखाता है। छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 10x आवर्धन पर लिया गया था और 3.003 के स्कैनिंग ज़ूम के साथ आगे बढ़ाया गया था। DAPI का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर तरंग दैर्ध्य 5 की शक्ति के साथ 405 एनएम थी और फेलोइडिन का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर तरंग दैर्ध्य 0.5 की शक्ति के साथ चैनल 3 के लिए 561.0 एनएम थी। कॉन्फोकल पिनहोल आकार सभी छवियों के लिए 19.16 पर बनाए रखा गया था। (ए) दिन 0 पर बीईसीएम में एम्बेडेड माउस स्तन डब्ल्यूटी ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (ए') 1: 250 होचस्ट लेबलिंग नाभिक और (ए') 1: 250 फेलोइडिन लेबलिंग ए स्केल बार की एक्टिन इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां 20 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। सामान्य स्तन ऊतक को एफवीबी चूहों से अलग किया गया था। चूहे 8-12 सप्ताह की उम्र के थे। (बी) दिन 0 पर बीईसीएम में एम्बेडेड माउस स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (बी') 1: 250 होचस्ट लेबलिंग नाभिक और (बी') एमटोमेटो-लेबल इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवि बी स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करती है। स्तन ट्यूमर एमएमटीवी-पीआईएमटी चूहों से अलग किया गया था। चूहे 12-14 सप्ताह की उम्र के थे। (सी) दिन 3 पर कोलेजन I में एम्बेडेड माउस स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि। छवि "आक्रामक" संपत्ति का प्रदर्शन करने वाले एक ऑर्गनॉइड का प्रतिनिधित्व करती है। (सी') 1: 250 होचस्ट लेबलिंग नाभिक और (सी') एमटोमेटो-लेबल इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवि सी स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करती है। स्तन ट्यूमर एमएमटीवी-पीआईएमटी चूहों से अलग किया गया था। चूहे 12-14 सप्ताह की उम्र के थे। (डी) दिन 0 पर बीईसीएम में एम्बेडेड मानव स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (डी') होचस्ट लेबलिंग नाभिक और (डी') 1:250 एक्टिन-टारगेटिंग फेलोइडिन-लेबल इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवि डी स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (E) BECM में एम्बेडेड एक ऑर्गेनॉइड की खंडित छवि और H & E के साथ सना हुआ 20x आवर्धन पर लिया गया। एच एंड ई धुंधला टेक्सास विश्वविद्यालय के दक्षिण-पश्चिमी ऊतक प्रबंधन साझा संसाधन30 द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संस्कृति प्लेट ईसीएम गुंबद वॉल्यूम ऑर्गेनोइड्स की अनुशंसित संख्या मीडिया वॉल्यूम
6-वेल प्लेट 200 μL 300 3 mL
12-वेल प्लेट 150 μL 225 2 mL
24-वेल प्लेट 100 μL 150 1 mL
48-वेल प्लेट 40 μL 60 300 μL
96-वेल प्लेट 20 μL 30 150 μL

तालिका 1: गुंबदों के लिए ईसीएम घटकों की अनुशंसित मात्रा, ऑर्गेनोइड्स का घनत्व, और अलग-अलग संस्कृति प्लेटों पर प्रति अच्छी तरह से आवश्यक मीडिया की मात्रा।

समस्या संभावित कारण घोल
ईसीएम गुंबद ढह गए हैं। प्लेट हिल गई थी, गुंबद के आकार को बनाए रखने के लिए ईसीएम की मात्रा बहुत बड़ी थी, या गुंबद कुएं के किनारे को छू रहे थे, जिससे वे चिपक गए और गिर गए। गुंबद सेट होने से पहले प्लेट को बहुत जोर से हिलाने से बचें, ऑर्गेनोइड्स के पुन: निलंबन के लिए उपयोग किए जाने वाले ईसीएम की मात्रा को कम करें, या प्लेट के केंद्र में गुंबदों को पिपेट करने के लिए बहुत सावधान रहें।
ऊतक है जो ऑर्गेनोइड्स की तरह नहीं दिखता है। स्तन वसा पैड की कटाई की प्रक्रिया में मांसपेशियों के ऊतक या तंत्रिका एकत्र किए जा सकते हैं। केवल वही काट लें जो स्पष्ट रूप से एक स्तन वसा पैड है। त्वचा पर कसकर पालन किए गए ऊतक को हटाने से बचें।
कई मृत ऑर्गेनोइड हैं। नेक्रोटिक ट्यूमर ऊतक काटा गया था। ट्यूमर से ऊतक एकत्र करने से बचें जो नेक्रोटिक, सिस्टिक, अत्यधिक नरम या गहरे रंग के हैं। ट्यूमर ऊतक दृढ़ होना चाहिए।
ऑर्गेनोइड्स की तुलना में अधिक एकल कोशिकाएं होती हैं। ऊतक को बहुत बारीक काट दिया गया था, या कोलेजनेज पाचन बहुत लंबे समय तक चलाया गया था। ऊतक को अधिक करने से बचें या कोलेजनेज को समय इनक्यूबेशन कम करें।
ईसीएम में बुलबुले हैं। पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबन बहुत जोरदार था, और पाइपिंग गुंबदों के बाहर निकलने की गति बहुत तेज थी। धीरे-धीरे ईसीएम में ऑर्गेनोइड्स को पुन: निलंबित करें और धीरे-धीरे उन्हें गुंबदों में डालें। यदि समस्या बनी रहती है, तो पाइपिंग करते समय दूसरे स्टॉप पर जाने से बचें।
कोलेजन के भीतर ऑर्गेनोइड्स का कोई आक्रमण नहीं होता है। कोलेजन को ठीक से पॉलीमराइज्ड या ओवर-पॉलीमराइज्ड नहीं किया गया था। कोलेजन में ऑर्गेनोइड को ठीक से पॉलीमराइज्ड होने तक फिर से निलंबित न करें। हर 30 मिनट में जांच करें। यदि कोई पोलीमराइजेशन दिखाई नहीं देता है, तो तुरंत 2 घंटे के निशान और प्लेट पर पुन: निलंबित करें।
पोलीमराइजेशन के लिए देखते समय कोई कोलेजन फाइबर दिखाई नहीं देते हैं। माइक्रोस्कोप सेटिंग्स अनुकूल नहीं थीं। अधिकतम अंधेरे के लिए चरण कंट्रास्ट को समायोजित करें, फिर माइक्रोस्कोप की चमक को सभी तरह से ऊपर लाएं। इसके अतिरिक्त, आवर्धन बढ़ाने से देखने में वृद्धि हो सकती है।
ईसीएम गुंबद भंग हो गए हैं। निर्धारण समय बहुत लंबा था, या पीएफए को ईसीएम-एम्बेडेड नमूनों से पूरी तरह से नहीं हटाया गया था। ईसीएम गुंबदों का समय 5 मिनट से कम रखें और प्रत्येक 5 मिनट के लिए घूर्णन शेकर पर पांच धोने के साथ अनुवर्ती कार्रवाई करें।

तालिका 2: संभावित समस्याओं, कारणों और समाधानों की तालिका।

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Discussion

ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए साहित्य में विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल पासिंग के बिना ट्यूमर से सीधे ट्यूमर ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डालता है। इस विधि का उपयोग करके, ट्यूमर ऑर्गेनोइड प्रक्रिया शुरू करने के कुछ घंटों के भीतर प्रोड्यूसेबल होते हैं और साहित्य31 में रिपोर्ट किए गए 70% की तुलना में लगभग 100% व्यवहार्य ऑर्गेनोइड उत्पन्न करते हैं। इसकी तुलना में, अन्य तरीकों को कई हफ्तों में ऑर्गेनोइड्स में कोशिकाओं के सीरियल पासिंग की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग, जैसे कि दीर्घकालिक संस्कृति के प्रभाव के बिना एक ही मेजबान से मिलान किए गए ऑर्गेनोइड और प्रतिरक्षा नमूनों के साथ प्रतिरक्षा कोशिका इंटरैक्शन का निर्धारण और कल्पना करना, अधिक संभव हो जाता है। इसके अलावा, जैसा कि चित्रा 2 सी में हाइलाइट किया गया है, विभिन्न बाह्य मैट्रिक्स में ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को एम्बेड करने से मेटास्टैटिक कैस्केड में प्रमुख फेनोटाइप्स की पहचान की अनुमति मिल सकती है, जैसे कि प्राथमिक ट्यूमर से बाहर आक्रमण। अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में विभिन्न उपकला कोशिका व्यवहारों का आकलन करने के लिए ब्रांचिंग मोर्फोजेनेसिस32, आक्रमण, प्रसार और कॉलोनी गठन33 के फेनोटाइपिक परख शामिल हैं। प्रतिरक्षा इंटरैक्शन को कार्यात्मक रूप से और नेत्रहीन रूप से इन ऑर्गेनोइड-आधारित परखों के साथ भी कैप्चर किया जा सकता है। इसके अलावा, मानक जैव रासायनिक और प्रवाह-आधारित परख का उपयोग करके आनुवंशिक और प्रोटीन सामग्री के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एम्बेडेड कोशिकाओं को अलग करने के लिए जैल को भंग किया जा सकता है। अंत में, क्योंकि ट्यूमर ऊतक से बड़ी मात्रा में ऑर्गेनोइड्स जल्दी से उत्पन्न हो सकते हैं, इन परखों को दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों और नैदानिक परीक्षण वर्कफ़्लो में एकीकरण के लिए बढ़ाया जा सकता है।

ऐसे कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, कोलेजनेज पाचन के लिए आवश्यक समय की मात्रा ऊतक संरचना और पचने वाले ऊतक की मात्रा पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, ऊतक के छोटे टुकड़ों के साथ काम करते समय, जैसे कि मानव स्तन ट्यूमर सर्जिकल नमूने (औसतन 100-250 मिलीग्राम), पाचन के कम समय की आवश्यकता होती है। हालांकि, माउस से काटे गए स्तन ट्यूमर आकार (500-800 मिलीग्राम) में बहुत बड़े होते हैं और 30-60 मिनट एंजाइमेटिक पाचन की आवश्यकता हो सकती है। दूसरे, उपकला ऑर्गेनोइड्स की अधिकतम उपज सुनिश्चित करने के लिए, प्लास्टिक में सेल आसंजन से नुकसान से बचने के लिए बीएसए के साथ सभी पिपेट युक्तियों और सीरोलॉजिकल पिपेट को कोट करना भी महत्वपूर्ण है। तीसरा, गैर-उपकला ऊतक घटकों को खत्म करने के लिए एक संक्षिप्त अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन समय महत्वपूर्ण है। यह दृष्टिकोण भारी उपकला ऑर्गेनोइड्स को गोली चलाने की अनुमति देता है जबकि हल्के स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा डिब्बे सुपरनैटेंट में रहते हैं। कोलेजन में ऑर्गेनोइड्स को एम्बेड करके आक्रमण परख बनाने के लिए, ऑर्गेनोइड्स को एम्बेड करने से पहले कोलेजन के उचित पोलीमराइजेशन की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। इस चरण को प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोलेजन फाइबर गठन की पुष्टि करके नेत्रहीन रूप से जांचा जाना चाहिए। अंत में, सर्वोत्तम इमेजिंग परिणामों के लिए, ईसीएम और प्लेटिंग में ऑर्गेनोइड्स को पुन: निलंबित करते समय बुलबुले पैदा करने से बचने का ध्यान रखें। बुलबुले जेल के भीतर ऑर्गेनोइड्स को अस्पष्ट करेंगे और छवियों को विकृत करेंगे। तालिका 2 में उन संभावित समस्याओं को सूचीबद्ध किया गया है जिनका सामना किया गया है और इन चुनौतियों को दूर करने के लिए समाधान।

प्रोटोकॉल में कुछ कदम उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के आकार को अनुकूलित करने या प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए संशोधनों की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, यांत्रिक पाचन समय की अवधि बढ़ने से कम कोलेजनेज पाचन समय, छोटे ऑर्गेनोइड्स और अधिक व्यक्तिगत कोशिकाएं हो सकती हैं। बड़ी मात्रा में ट्यूमर ऊतक के साथ काम करते समय कोलेजनेज पाचन के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन को 5 मिनट तक छोटा किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के चरणों के दौरान समय बचाने के लिए ऑर्गेनोइड को संवर्धन और उगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया को एक दिन पहले तैयार किया जा सकता है। इसी तरह, ट्यूमर ऊतक को ऑर्गेनोइड तैयारी से पहले उपयुक्त मीडिया में 24 घंटे तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि समय बेहद सीमित है, तो इस प्रोटोकॉल में संग्रह के दिन ट्यूमर ऊतक को फ्रीज करके चरणों को रोकना शामिल है। फिर, इन जमे हुए ऊतकों का उपयोग बाद की तारीख में व्यवहार्य ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। जमे हुए ऊतक से प्राप्त लगभग 90% ऑर्गेनोइड व्यवहार्य थे, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत और ट्रिपैन नीले समाधान के साथ दृष्टि से पुष्टि की गई थी।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएँ हैं. जबकि यह दृष्टिकोण जल्दी से व्यवहार्य ऑर्गेनोइड उत्पन्न करता है, उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की मात्रा ट्यूमर ऊतक की मात्रा से सीमित होती है। यह सीमा नैदानिक नमूनों के साथ काम करते समय विशेष रूप से स्पष्ट हो जाती है जिसमें ट्यूमर ऊतक की मात्रा कम होती है या, कभी-कभी, कुछ कोशिकाओं तक भी सीमित होती है। उन चरम मामलों में जहां केवल कुछ कोशिकाओं को प्रारंभिक सामग्री के रूप में पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, पासिंग एक बेहतर विकल्प हो सकता है। एक और सीमा इस पद्धति का न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण है। फाइब्रोब्लास्ट या एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे स्ट्रोमल डिब्बों को हटाने से उपकला ऑर्गेनॉइड पीढ़ी समृद्ध होती है। हालांकि, ये सेल आबादी ट्यूमर के कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, उनके निष्कासन से ट्यूमर जीव विज्ञान की व्याख्या सीमित हो जाती है जो पूरी तरह से उपकला ऑर्गेनॉइड मॉडल से प्राप्त होती है। अंत में, यह प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम इमेजिंग, कार्यात्मक (प्रतिरक्षा इंटरैक्शन सहित), और दवा-स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में तत्काल उपयोग के लिए उपकला ऑर्गेनोइड्स की त्वरित पीढ़ी के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को मेटविवोर, पीटर कार्लसन ट्रस्ट, थेरेसा रिसर्च फाउंडेशन और एनसीआई / यूटीएसडब्ल्यू सिमंस कैंसर सेंटर पी 30 सीए 142543 द्वारा प्रदान किए गए धन द्वारा समर्थित किया गया था। हम टेक्सास विश्वविद्यालय के दक्षिण-पश्चिमी ऊतक प्रबंधन साझा संसाधन की सहायता को स्वीकार करते हैं, सिमंस कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर में एक साझा संसाधन, जिसे पुरस्कार संख्या पी 30 सीए 142543 के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया है। चान लैब के सभी सदस्यों के लिए विशेष धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM HEPES Buffer Gibco  15630080
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco  15240-096
100x Glutamax Life Technologies  35050-061 Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)  Life Technologies  51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Sigma  P4333
10x DMEM Sigma  D2429
50 mL/0.2 µm filter flask Fisher  #564-0020
Amphotericin B Life Technologies  15290-018
bFGF Sigma F0291
BSA Solution (32%) Sigma  #A9576
Cholera Toxin  Sigma  C8052
CO2-Independent Medium  Gibco 18045-088
Collagenase A  Sigma  C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) Sigma D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma D6546 Common basal medium
D-MEM/F12  Life Technologies  #10565-018 Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)  Sigma #D8662 PBS
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F0926
Gentamicin  Life Technologies  #15750-060
Human epidermal growth factor (EGF) Sigma  E9644
Hydrocortisone  Sigma  H0396
Insulin  Sigma  #I9278
Matrigel  Corning  #354230 Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N) Sigma  S2770
Rat Tail Collagen I Corning  354236
RPMI-1640 media Fisher  SH3002701
Trypsin  Life Technologies  27250-018

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 189
सामान्य और ट्यूमर स्तन ऊतक से माउस और मानव उपकला ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना और इमेजिंग करना
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Cornelius, S. L., Colonnetta, M. M., … More

Cornelius, S. L., Colonnetta, M. M., Lake, K. E., Smith, C. A., Zhang, Y. A., Roussos-Torres, E. T., Reddy, S. M., Chen, E. H., Chan, I. S. Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging. J. Vis. Exp. (189), e64626, doi:10.3791/64626 (2022).

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