Summary
Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.
Abstract
Los organoides son un método confiable para modelar el tejido orgánico debido a sus propiedades de autoorganización y retención de la función y la arquitectura después de la propagación a partir de tejido primario o células madre. Este método de generación de organoides renuncia a la diferenciación unicelular a través de múltiples pasajes y en su lugar utiliza la centrifugación diferencial para aislar organoides epiteliales mamarios de tejidos disociados mecánica y enzimáticamente. Este protocolo proporciona una técnica simplificada para producir rápidamente organoides epiteliales pequeños y grandes a partir de tejido mamario humano y de ratón, además de técnicas para la incrustación de organoides en colágeno y matriz extracelular basal. Además, se proporcionan instrucciones para la fijación en gel y la tinción inmunofluorescente con el fin de visualizar la morfología y densidad de los organoides. Estas metodologías son adecuadas para innumerables análisis posteriores, como el cocultivo con células inmunes y el modelado de metástasis ex vivo a través del ensayo de invasión de colágeno. Estos análisis sirven para dilucidar mejor el comportamiento célula-célula y crear una comprensión más completa de las interacciones dentro del microambiente tumoral.
Introduction
La capacidad de modelar células epiteliales in vitro ha sido la base de la investigación biomédica moderna porque captura características celulares que no son accesibles in vivo. Por ejemplo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales en un plano bidimensional puede proporcionar una evaluación de los cambios moleculares que ocurren en una célula epitelial durante la proliferación1. Además, la medición de la regulación dinámica entre la señalización y la expresión génica está limitada en los sistemas in vivo 2. En la investigación del cáncer, el modelado de la línea celular epitelial del cáncer ha permitido la identificación de los impulsores moleculares de la progresión de la enfermedad y los posibles objetivos farmacológicos3. Sin embargo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales de cáncer en un plano bidimensional tiene limitaciones, ya que la mayoría son genéticamente inmortalizadas y modificadas, a menudo de naturaleza clonal, seleccionadas por su capacidad para crecer en condiciones no fisiológicas, limitadas en su evaluación de la arquitectura tridimensional (3D) del tejido tumoral, y no modelan adecuadamente las interacciones del microambiente dentro de un entorno tisular realista4. Estas limitaciones son particularmente evidentes en el modelado de metástasis, que in vivo incluye varias etapas biológicas distintas, incluyendo invasión, diseminación, circulación y colonización en el sitio del órgano distante5.
Los organoides epiteliales del cáncer han sido desarrollados para recapitular mejor el ambiente 3D y el comportamiento de los tumores 6,7,8. Los organoides se desarrollaron por primera vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ individuales y se diferenciaron para representar la estructura 3D de las unidades de cripta-vellosidades que mantenían la estructura jerárquica del intestino delgado in vitro9. Este enfoque permitió la visualización y caracterización en tiempo real de la arquitectura tisular autoorganizada en condiciones homeostáticas y de estrés. Como extensión natural, los organoides epiteliales del cáncer se desarrollaron para modelar muchos tipos diferentes de cáncer, incluidos los cánceres colorrectal 10, pancreático11, mama 12, hígado 13, pulmón 14, cerebro 15 y gástrico 16. Los organoides epiteliales del cáncer han sido explotados para caracterizar la evolución del cáncer17,18 y los comportamientos espaciotemporales metastásicos19,20 e interrogar la heterogeneidad tumoral21, y probar quimioterapias 22. Los organoides epiteliales del cáncer también se han aislado y recolectado durante ensayos clínicos en curso para predecir la respuesta del paciente a los agentes anticancerosos y la radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Además, los sistemas que incorporan organoides epiteliales cancerosos pueden combinarse con otras células no cancerosas, como las células inmunes, para formar un modelo más completo del microambiente tumoral para visualizar las interacciones en tiempo real, descubrir cómo las células epiteliales cancerosas cambian la naturaleza fundamental de las células inmunes efectoras citotóxicas, como las células asesinas naturales, y probar posibles inmunoterapias y actividad citotóxica dependiente de anticuerpos26, 27,28. Este artículo demuestra un método para generar organoides epiteliales sin pasar e incrustarse en colágeno y matriz extracelular basal (ECM). Además, también se comparten técnicas para obtener imágenes posteriores de organoides aislados.
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Protocol
Todo el tejido de ratón utilizado en este manuscrito ha sido recolectado éticamente de acuerdo con las regulaciones y pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Del mismo modo, todos los pacientes dieron su consentimiento antes de la donación de tejidos bajo la supervisión de una Junta de Revisión Institucional (IRB), y las muestras fueron desidentificadas.
NOTA: Este protocolo describe la generación de organoides a partir de tejido primario.
1. Preparación nocturna de los materiales
- Para incrustar en la matriz extracelular basal (BECM), descongelar la alícuota BECM dejándola a 4 °C.
2. Preparación de la solución de recubrimiento de colagenasa y albúmina sérica bovina (BSA)
- Preparar una solución de recubrimiento BSA/PBS al 2,64% (solución BSA): filtro estéril 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 4,10 ml de solución BSA al 30% utilizando un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Esta solución BSA se puede filtrar y utilizar de nuevo.
- Preparar solución de colagenasa para tejido mamario de ratón: filtro estéril 27 ml de medio de células basales, 1,5 ml de suero fetal bovino (FBS), 30 μL de 50 mg/ml de gentamicina, 15 μL de 10 mg/ml de insulina, 600 μL de 0,1 g/ml de colagenasa A y 600 μL de tripsina de 0,1 g/ml utilizando un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Asigne entre 10 ml y 30 ml de solución de colagenasa por ratón, dependiendo de la masa del tejido.
- Preparar solución de colagenasa para el tejido mamario humano: Filtro estéril 18 ml de RPMI-1640, 200 μL de solución de penicilina-estreptomicina 100x (pluma/estreptococo), 200 μL de 10 mM de tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 1 ml de FBS y 400 μL de 0,1 g/ml de colagenasa A con un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Asigne entre 10 ml y 20 ml por muestra de tejido, dependiendo de la masa tisular.
3. Preparación de los medios
- Preparar medios organoides: Medio de células basales de filtro estéril con 1% de pluma/estreptococo y 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS) utilizando un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Para producir medios de factor de crecimiento organoide, agregue el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a una concentración final de 2.5 nM.
- Preparar medios epiteliales mamarios: Para hacer 100 ml de medios epiteliales mamarios, filtro estéril de medio basal común de alta glucosa con 1 ml de suplemento de glutamina 100x, 1 ml de pluma/estreptococo, 1 ml de tampón HEPES de 10 mM (7.3 pH), 250 μL de stock de BSA al 30%, 1 μL de cepas de cólera de 1 mg/ml, 1 ml de stock de hidrocortisona de 50 μg/ml en PBS, 50 μL de solución de insulina humana de 10 mg/ml, 10 μL de cepa de factor de crecimiento epidérmico (EGF) de 50 μg/ml y FBS al 1% con un matraz filtrante de 150 ml/0,2 μm. Conservar el medio a 4 °C y utilizar durante un máximo de 2 semanas.
- Preparar el lavado de anfotericina: Filtro estéril PBS con 2% de pluma/estreptococo y 2% de anfotericina B. Conservar a 4 °C.
4. Recolectar y digerir tejidos
- Tejido mamario de ratón
- Eutanasia al ratón colocándolo en una cámara deCO2 durante 2-5 minutos, y luego seguir con la dislocación cervical. Con el lado ventral hacia arriba, extienda las extremidades del ratón y use cuatro agujas de 19 G para sujetar el ratón por las patas a una tabla cubierta con una almohadilla absorbente. Rocíe con etanol al 70% para suavizar el pelaje y desinfectar la piel. Limpie las heces con una gasa o un pañuelo de papel.
- Comenzando justo por encima de la región anogenital, corte hacia arriba desde la línea media con tijeras quirúrgicas, teniendo cuidado de no perforar el peritoneo. Al llegar a la barbilla, haga cortes laterales por ambas clavículas y por las patas traseras, y fije la piel del ratón tensa a la tabla para exponer las almohadillas de grasa mamaria.
- Localice las almohadillas de grasa mamaria inguinal en ratones de tipo salvaje identificando el ganglio linfático inguinal ubicado cerca de las extremidades posteriores. Localice las almohadillas de grasa mamaria torácica en ratones de tipo salvaje como el tejido vascularizado más grueso debajo de las extremidades delanteras.
- Use fórceps para elevar la almohadilla de grasa mamaria. Evite acumular músculo subyacente. Usando el extremo romo de las tijeras afiladas, cree un bolsillo debajo de la almohadilla de grasa mamaria, lejos de la piel. Corte la almohadilla de grasa mamaria en una pieza completa.
- Una vez que se hayan retirado las almohadillas de grasa mamaria, enjuague en PBS antes de colocarlas en una placa de cultivo de tejido estéril. Transfiera rápidamente a una campana de cultivo de tejidos.
NOTA: Para los tumores mamarios, use un hisopo de algodón humedecido con PBS para alejar suavemente el tumor de la piel. Asegúrese de evitar las áreas oscuras o blandas, ya que la decoloración oscura indica necrosis, que no producirá organoides saludables. - Picar los tumores mamarios con un bisturí # 10 o # 11 para aflojar el tejido hasta que alcance una consistencia pastosa. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico que contenga 10-30 ml de solución de colagenasa con un bisturí. Para asegurarse de que se recoge todo el tejido, pipetear 1 ml de solución de colagenasa en la placa de cultivo de tejidos y de nuevo en el tubo cónico.
NOTA: Para producir organoides más grandes, la digestión mecánica debe minimizarse, dejando intactas algunas pequeñas piezas visibles de tejido. Alternativamente, el tejido puede almacenarse congelado para su posterior preparación de organoides con una pérdida mínima de viabilidad. Para hacerlo, lave el tejido en una solución de PBS o medios de células basales + 1% de FBS, y luego pique grueso para aumentar el área de superficie (manteniendo el tejido en una o dos piezas sólidas). Mueva el tejido a un crio-vial, cubra con medios de congelación (90% FBS + 10% dimetilsulfóxido (DMSO)). Congele los viales en un recipiente de congelación de velocidad controlada durante la noche antes de pasar al almacenamiento en nitrógeno líquido. - Coloque el tubo cónico en una incubadora de agitación de sobremesa a 37 °C a 180 RPM hasta que el tejido se vuelva fibroso y la solución de colagenasa se vuelva turbia. Por ejemplo, una gran masa de tejido (alrededor de 500-800 mg) de un tumor tarda 30-60 minutos. Una masa de tejido más pequeña (alrededor de 100-300 mg) de almohadillas de grasa mamaria de tipo salvaje tarda unos 20-30 minutos. Si no está seguro, verifique a intervalos de 5 minutos.
- Después de la incubación, centrifugar el tubo cónico durante 10 min a 550 x g a temperatura ambiente (RT).
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante del tubo cónico.
NOTA: En el futuro, recubra previamente todas las puntas de pipetas, pipetas serológicas y tubos cónicos con solución BSA para evitar la pérdida de organoides debido a la adhesión al plástico. - Agregue 8 ml de medios celulares basales y 80 μL de solución de DNasa [2 U/μL] al tubo. Invertir suavemente durante 1-3 min.
- Agregue 12 ml de medios de células basales al tubo y mezcle cuidadosamente pipeteando o gire suavemente el tubo 15 veces para mezclar.
- Centrífuga durante 10 min a 550 x g en RT.
- Aspirar el sobrenadante, y luego resuspender el pellet en 12 ml de medios de células basales.
- Deje que los fragmentos de tejido más pesados se asienten en el fondo. Recoger el sobrenadante con una pipeta serológica y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Esta suspensión contiene organoides epiteliales y células estromales/inmunes.
- Tejido mamario humano
- Procesar las muestras de tejido mamario humano en busca de organoides o almacenarlas dentro de las 24 h posteriores a la recolección. Almacenar las muestras a 4 °C en medios independientes delCO2 con antibiótico-antimicótico 100x al 1%.
- Transfiera el tejido a una placa de cultivo de tejidos. Incline la placa y aspire el exceso de medios de almacenamiento, y luego enjuague el pañuelo con 5 ml del lavado de anfotericina B. Retire el lavado de anfotericina B inmediatamente.
- Picar la muestra de tejido con un bisturí #10 o #11 para aflojar el tejido hasta que alcance una consistencia similar a una pasta. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico que contenga 10-30 ml de solución de colagenasa con un bisturí. Para asegurarse de que se recoge todo el tejido, pipetear 1 ml de solución de colagenasa en la placa de cultivo de tejidos y volver al tubo cónico.
NOTA: Para producir organoides más grandes, la digestión mecánica debe minimizarse, dejando intactas algunas pequeñas piezas visibles de tejido. La masa tisular inicial para este protocolo osciló entre 100-250 mg. Alternativamente, el tejido se puede almacenar congelado para su posterior preparación de organoides con una pérdida mínima de viabilidad después del paso 4.2.2 en 90% FBS + 10% DMSO como se mencionó anteriormente. - Coloque el tubo cónico en una incubadora de agitación de sobremesa a 37 °C a 180 RPM hasta que el tejido se vuelva más pequeño y la colagenasa se vuelva turbia. Revise el tejido a intervalos de 5 minutos. La disociación de la colagenasa de muestras humanas toma aproximadamente 5-20 min.
- Después de la incubación, girar el tubo cónico durante 10 minutos a 550 x g en RT.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante del tubo cónico.
NOTA: Avanzando, recubra previamente todas las puntas de pipeta, pipetas serológicas y tubos cónicos con solución BSA para evitar la pérdida de organoides debido a la adhesión al plástico. - Agregue 4 ml de medios de células basales y 40 μL de solución de DNasa [2 U/μL] al tubo cónico. Invertir suavemente durante 3 min.
- Agregue 6 ml de medios de células basales al tubo y mezcle cuidadosamente pipeteando o gire suavemente el tubo cónico 15 veces para mezclar.
- Centrífuga durante 10 min a 550 x g en RT.
- Aspirar el sobrenadante, y luego resuspender el pellet en 10 ml de medios de células basales.
- Deje que los fragmentos de tejido más pesados se asienten en el fondo. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico de 15 ml. Esta suspensión contiene organoides epiteliales y células estromales/inmunes.
5. Centrifugación diferencial
- Pulse a 550 x g durante 3-4 s en RT, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 10 ml de medios de células basales. Repita este paso tres veces más (un total de cuatro giros).
- Después de cada centrifugación, asegúrese de que el pellet se vuelva cada vez más opaco. Este pellet restante serán organoides epiteliales.
6. Recolección de organoides pequeños
- Pulse a 80-100 x g durante 3 s en RT. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco recubierto de BSA, y luego pulse a 550 x g durante 3 s en RT para granular los organoides pequeños.
7. Incrustación de organoides en BECM
- Suspensión alícuota adecuada de organoides en tubos de microcentrífuga de acuerdo con la densidad organoide en relación con la cantidad de BECM por pocillo (Tabla 1). Por ejemplo, use 50-100 organoides para 20 μL de BECM en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
NOTA: La densidad de organoides se puede contar utilizando la siguiente fórmula: ((Número promedio de organoides)/50 μL) x factor de dilución. - Realice todos los pasos en hielo. Coloque el BECM descongelado en hielo en una campana de cultivo de tejidos. Mientras prepara la campana, coloque todas las puntas de pipeta en hielo para que se enfríen.
- Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 10 min a 300 x g en RT. Desechar el sobrenadante de los tubos. Mover los tubos con gránulos organoides al hielo y añadir el volumen adecuado de BECM a cada tubo de microcentrífuga (Tabla 1).
NOTA: Dado que BECM es viscoso, agregue volúmenes adicionales (aproximadamente 10% -20% adicionales del volumen de la cúpula) de BECM para tener en cuenta la pérdida en la punta de la pipeta. - Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los organoides en BECM, teniendo cuidado de no producir burbujas.
- Pipetear lenta y cuidadosamente los organoides suspendidos por BECM sobre la superficie de recubrimiento. Mientras pipetea, levante lentamente la pipeta para crear una cúpula. Llene todos los pozos vacíos con PBS para mantener la humedad.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante 1 h para permitir que BECM se solidifique, y luego cubrir con el volumen apropiado de medio (Tabla 1).
8. Incrustación de organoides en colágeno
- Realice todos los pasos en hielo. Prepare la solución de colágeno combinando, en orden secuencial, 375 μL de 10x DMEM, 100 μL de hidróxido de sodio (NaOH) de 1 N y 3 ml de solución de colágeno I de cola de rata en un tubo cónico de 15 ml. Mezcla de pipetas, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Valorar la solución a un pH de 7.2-7.4 con pequeñas cantidades (incrementos de 1-3 μL) de NaOH o 10x DMEM según sea necesario.
- Cubra el fondo de los pozos con la cantidad mínima de colágeno requerida para cubrir completamente el fondo del pozo. Un enfoque es colocar una pequeña cantidad de colágeno y mecer la placa de lado a lado para cubrir. Deje que las capas base de colágeno se fijen a 37 °C durante 30 min-2 h.
- Alícuota la suspensión adecuada de organoides en tubos de microcentrífuga de acuerdo con la densidad organoide relativa a la cantidad de colágeno por pocillo (Tabla 1). Colocar en una incubadora a 37 °C.
- Almacene la solución de colágeno a 4 °C y controle la polimerización comprobando la formación de fibra bajo un microscopio cada 10 minutos. El colágeno alcanzará la polimerización adecuada entre 30 min-2 h.
NOTA: La polimerización adecuada puede determinarse por la presencia de fibras que se ramifican en toda la matriz. Continúe con el paso 8.5 inmediatamente una vez que se observen algunas fibras en el campo de visión. - Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 300 x g durante 10 min a RT. Desechar el sobrenadante de los tubos. Mover los gránulos de organoides al hielo y añadir el volumen adecuado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga (Tabla 1).
NOTA: Dado que el colágeno es viscoso, agregue volúmenes adicionales (aproximadamente 10% -20% adicionales del volumen de la cúpula) de colágeno para tener en cuenta la pérdida en la punta de la pipeta. - Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los organoides en colágeno, teniendo cuidado de no producir burbujas.
- Pipetea lenta y cuidadosamente los organoides suspendidos en colágeno sobre la superficie del recubrimiento. Mientras pipetea, levante lentamente la pipeta para crear una cúpula. Llene todos los pozos vacíos con PBS para mantener la humedad.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante 1 h para permitir que el colágeno se solidifique, y luego cubrir con el volumen adecuado de medios (Tabla 1).
- NOTA: Los organoides mantienen la viabilidad en matriz 3D hasta por 7 días. Si se utilizan imágenes para el análisis, continúe con los pasos 9 y 10.
9. Fijación de organoides incrustados
- Utilice una pipeta para extraer todos los medios de los pocillos sin hacer contacto con los domos ECM.
- Fijar con solución de paraformaldehído (PFA)/PBS al 4% durante 5 min.
- Lave dos o tres veces aplicando PBS a los pozos después de colocarlos en una coctelera que se mueve lentamente. Después de los lavados, aplicar PBS fresco a las cúpulas y conservar la placa a 4 °C.
10. Tinción inmunofluorescente de organoides incrustados
- Preparación de soluciones para la tinción inmunofluorescente
- Tampón de permeabilización: Prepare una solución de PBS con Triton X-100 al 10%.
- Búfer de bloqueo: Prepare una solución PBS con 10% FBS y 0.2% Triton X-100.
- Tampón de dilución de anticuerpos: Prepare una solución de PBS con 2% FBS y 0.2% Triton X-100.
- Permebilización y bloqueo
- Pipetear suficiente tampón de permeabilización para cubrir las cúpulas ECM. Incubar durante 1 h en RT en una agitadora que se mueva lentamente.
- Retire el tampón de permeabilización con una pipeta y aplique el mismo volumen de tampón de bloqueo durante 3 h.
- Incubación de anticuerpos primarios
- Retire el tampón de bloqueo con una pipeta y aplique el tampón de dilución de anticuerpos que contiene el anticuerpo primario a concentraciones especificadas por el fabricante. Incubar la muestra a 4 °C durante 12-16 h en una agitadora de movimiento lento.
- Retire la solución de anticuerpos primarios y lave las muestras tres veces durante 10 minutos con PBS en RT en una coctelera de movimiento lento.
- Incubación secundaria de anticuerpos y tinción nuclear
- Aspirar el lavado de PBS restante y aplicar el tampón de dilución de anticuerpos que contiene anticuerpos secundarios a concentraciones especificadas por el fabricante. Además, agregue DAPI o Hoechst (para etiquetar núcleos) o faloidina (para etiquetar actina) al tampón en una proporción de 1:250. Incubar durante 2-4 h en RT en una agitadora de movimiento lento.
- Retire la solución de anticuerpos secundarios y lave las muestras tres veces durante 10 minutos en PBS a RT en un agitador. Almacene las muestras en PBS a 4 °C hasta obtener imágenes.
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Representative Results
Las imágenes presentadas en la Figura 1 proporcionan un ejemplo de organoides epiteliales mamarios de tipo salvaje y tumorales de tejidos humanos y de ratón. Una ilustración de un vistazo del método para aislar organoides epiteliales a través de centrifugación diferencial se proporciona en el flujo de trabajo de dibujos animados en la Figura 1A, que muestra que los tejidos primarios de diferentes especies pueden procesarse de maneras casi idénticas mientras producen tejido epitelial como se muestra en las imágenes de campo claro (Figura 1B ). Además, estas similitudes en la composición tisular entre especies se pueden ver en las imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados en la matriz extracelular basal o en el colágeno que se muestran en la Figura 2A-D. La estructura organoide se puede visualizar a través del marcado de tomate de membrana (mTomato) o la tinción faloidina de actina. Estas cifras también demuestran la composición y el tamaño esperados de los organoides utilizando este método. Los organoides incrustados en la matriz de colágeno se pueden usar para un ensayo de invasión y analizarse mediante el seguimiento de la expansión de los zarcillos que se ramifican desde el propio organoide, como se ve en la Figura 2C. Por último, la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de organoides incrustados en parafina muestra que los organoides mantienen la misma histología del cáncer de mama (Figura 2E).
Figura 1: Flujo de trabajo para la generación de organoides epiteliales con organoides de ejemplo. (A) Esquema de flujo de trabajo para la generación de organoides a partir de tejido humano o de ratón sin pasar por el tiempo. (B) Imágenes representativas de organoides epiteliales aislados de glándulas mamarias WT de ratón, tumores mamarios de ratón y tumores de mama humanos en medios después del aislamiento. Cada imagen se ajustó individualmente para el brillo y el contraste para una visualización mejorada. Las imágenes se tomaron en campo claro en un microscopio epifluorescente invertido con un aumento de 10x. La barra de escala representa 20 μm. Se aislaron tumores mamarios de ratones MMTV-PyMT; se aisló tejido mamario normal de ratones FVB. Los ratones tenían entre 8 y 14 semanas de edad29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de organoides en la matriz extracelular. Cada imagen se ajustó individualmente para el brillo y el contraste para una visualización mejorada de esta colección. Antes de la obtención de imágenes, las muestras se fijaron con paraformaldehído al 4%. Las muestras de tipo salvaje se tiñeron con faloidina 568 para visualizar la membrana celular y todas las muestras se tiñeron con Hoechst para visualizar núcleos, mostrando la morfología y densidad de organoides. Las imágenes se tomaron con un aumento de 10x en un microscopio confocal y se ampliaron aún más con un zoom de escaneo de 3.003. La longitud de onda del láser utilizada para detectar DAPI fue de 405 nm con una potencia de 5 y la longitud de onda del láser utilizada para detectar faloidina fue de 561.0 nm para el canal 3 con una potencia de 0.5. El tamaño estenopeico confocal se mantuvo en 19.16 para todas las imágenes. (A) Imagen representativa de campo claro del organoide WT mamario de ratón incrustado en BECM en el día 0. (A') 1:250 Hoechst marcando núcleos y (A'') 1:250 faloidina marcando actina imágenes inmunofluorescentes de A. La barra de escala representa 20 μm. Se aisló tejido mamario normal de ratones FVB. Los ratones tenían entre 8 y 12 semanas de edad. (B) Imagen representativa de campo claro del organoide tumoral mamario de ratón incrustado en BECM en el día 0. (B') 1:250 núcleos de marcado de Hoechst y (B'') imagen inmunofluorescente marcada con mTomato de B. La barra de escala representa 20 μm. Se aislaron tumores mamarios de ratones MMTV-PyMT. Los ratones tenían entre 12 y 14 semanas de edad. (C) Imagen representativa de campo claro del organoide tumoral mamario de ratón incrustado en colágeno I en el día 3. La imagen representa un organoide que demuestra una propiedad "invasiva". (C') 1:250 núcleos de marcado de Hoechst y (C') imagen inmunofluorescente marcada con mTomato de C. La barra de escala representa 20 μm. Se aislaron tumores mamarios de ratones MMTV-PyMT. Los ratones tenían entre 12 y 14 semanas de edad. (D) Imagen representativa de campo claro del organoide tumoral de mama humano incrustado en BECM en el día 0. (D') Núcleos de etiquetado de Hoechst y (D'') 1:250 Imagen inmunofluorescente marcada con faloidina dirigida a la actina de D. La barra de escala representa 20 μm. (E) Imagen seccionada de un organoide incrustado en BECM y teñido con H&E tomado con un aumento de 20x. La barra de escala representa 20 μm. La tinción de H&E fue realizada por el Recurso Compartido30 de Gestión de Tejidos del Suroeste de la Universidad de Texas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Placa de cultivo | Volumen domo ECM | Número recomendado de organoides | Volumen de medios |
| Placa de 6 pocillos | 200 μL | 300 | 3 ml |
| Placa de 12 pocillos | 150 μL | 225 | 2 ml |
| Placa de 24 pocillos | 100 μL | 150 | 1 ml |
| Placa de 48 pocillos | 40 μL | 60 | 300 μL |
| Placa de 96 pocillos | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tabla 1: Volumen recomendado de componentes de ECM para domos, densidad de organoides y volumen de medios necesarios por pocillo en placas de cultivo variables.
| Problema | Causa potencial | Solución | |||
| Los domos ECM se han colapsado. | La placa se sacudió, el volumen de ECM era demasiado grande para que la forma de la cúpula se sostuviera, o las cúpulas tocaban el borde del pozo, haciendo que se pegaran y cayeran. | Evite mover la placa demasiado vigorosamente antes de que las cúpulas se hayan fijado, reduzca el volumen de ECM utilizado para la resuspensión de organoides o tenga mucho cuidado de pipetear las cúpulas en el centro de la placa. | |||
| Hay tejido que no parece organoides. | El tejido muscular o el nervio pueden haber sido recolectados en el proceso de recolección de la almohadilla de grasa mamaria. | Solo corte lo que claramente es una almohadilla de grasa mamaria. Evite quitar el tejido que se adhiere firmemente a la piel. | |||
| Hay muchos organoides muertos. | Se recolectó tejido tumoral necrótico. | Evite recolectar el tejido de tumores que son necróticos, quísticos, excesivamente blandos o de color más oscuro. El tejido tumoral debe ser firme. | |||
| Hay más células individuales que organoides. | El tejido se picó demasiado finamente, o la digestión de la colagenasa se ejecutó durante demasiado tiempo. | Evite picar demasiado el tejido o reducir el tiempo de incubación de la colagenasa. | |||
| Hay burbujas en ECM. | La resuspensión por pipeteo era demasiado vigorosa, y la expulsión mientras se pipeteaban las cúpulas era demasiado rápida. | Resuspenda lentamente los organoides en el ECM y cápitelos lentamente en cúpulas. Si el problema persiste, evite ir a la segunda parada mientras pipetea. | |||
| No hay invasión de organoides dentro del colágeno. | El colágeno no se polimerizó adecuadamente ni se polimerizó en exceso. | No resuspenda el organoide en colágeno hasta que esté debidamente polimerizado. Comprobar cada 30 min. Si no hay polimerización visible, resuspender en la marca de 2 h y placa inmediatamente. | |||
| No hay fibras de colágeno visibles mientras se observa la polimerización. | Los ajustes del microscopio no fueron favorables. | Ajuste el contraste de fase para obtener la máxima oscuridad, luego aumente el brillo del microscopio. Además, aumentar la ampliación puede mejorar la visualización. | |||
| Los domos ECM se han disuelto. | El tiempo de fijación fue demasiado largo, o el PFA no se eliminó completamente de las muestras integradas en ECM. | Mantenga el tiempo de fijación de los domos ECM por debajo de 5 minutos y siga con cinco lavados en un agitador giratorio durante 5 minutos cada uno. | |||
Tabla 2: Tabla de posibles problemas, causas y soluciones.
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Discussion
Se han descrito diferentes métodos en la literatura para generar organoides tumorales. Este protocolo destaca un método para generar organoides tumorales directamente del tumor sin pasar. Utilizando este método, los organoides tumorales son producibles a las pocas horas de iniciar el procedimiento y generan organoides cerca del 100% viables en comparación con el 70% reportado en la literatura31. En comparación, otros métodos requieren el paso en serie de células a organoides durante varias semanas. Por lo tanto, las aplicaciones posteriores, como determinar y visualizar las interacciones de las células inmunes con muestras orgánicas e inmunes emparejadas del mismo huésped sin el impacto del cultivo a largo plazo, se vuelven más factibles. Además, como se destaca en la Figura 2C, la incrustación de organoides tumorales en diferentes matrices extracelulares puede permitir la identificación de fenotipos clave a lo largo de la cascada metastásica, como la invasión del tumor primario. Otras aplicaciones posteriores incluyen ensayos fenotípicos de morfogénesis ramificada32, invasión, diseminación y formación de colonias33 para evaluar diversos comportamientos de células epiteliales. Las interacciones inmunes también se pueden capturar funcional y visualmente con estos ensayos basados en organoides. Además, los geles se pueden disolver para aislar las células incrustadas para el análisis posterior del contenido genético y de proteínas utilizando ensayos bioquímicos estándar y basados en flujos. Finalmente, debido a que se pueden generar rápidamente grandes cantidades de organoides a partir del tejido tumoral, estos ensayos se pueden escalar para aplicaciones de detección de medicamentos e integración en flujos de trabajo de ensayos clínicos.
Hay varios pasos clave que son críticos para este protocolo. En primer lugar, la cantidad de tiempo requerido para la digestión de la colagenasa depende de la composición del tejido y la cantidad de tejido que se digiere. Por ejemplo, cuando se trabaja con piezas más pequeñas de tejido, como muestras quirúrgicas de tumores de mama humanos (en promedio 100-250 mg), se requiere un tiempo de digestión más corto. Sin embargo, los tumores mamarios cosechados de un ratón son mucho más grandes en tamaño (500-800 mg) y pueden requerir 30-60 minutos de digestión enzimática. En segundo lugar, para garantizar un rendimiento máximo de organoides epiteliales, también es importante recubrir todas las puntas de pipeta y pipetas serológicas con BSA para evitar la pérdida de adhesión celular al plástico. En tercer lugar, un breve tiempo de centrifugación diferencial es crucial para eliminar los componentes tisulares no epiteliales. Este enfoque permite que los organoides epiteliales más pesados se granulen, mientras que los compartimentos estromales e inmunes más ligeros permanecen en el sobrenadante. Para crear ensayos de invasión mediante la incorporación de organoides en colágeno, es fundamental permitir la polimerización adecuada del colágeno antes de incrustar organoides. Este paso debe verificarse visualmente confirmando la formación de fibra de colágeno bajo un microscopio óptico. Finalmente, para obtener los mejores resultados de imagen, tenga cuidado de evitar la producción de burbujas al resuspender organoides en ECM y chapado. Las burbujas oscurecerán los organoides dentro del gel y distorsionarán las imágenes. La Tabla 2 enumera los problemas potenciales que se han encontrado y las soluciones para superar estos desafíos.
Ciertos pasos en el protocolo permiten modificaciones para personalizar el tamaño de los organoides generados o reducir el tiempo requerido para ejecutar el protocolo. Por ejemplo, aumentar la duración del tiempo de digestión mecánica puede resultar en un tiempo de digestión de colagenasa más corto, organoides más pequeños y más células individuales. La centrifugación después de la digestión de la colagenasa se puede acortar a 5 minutos si se trabaja con una gran cantidad de tejido tumoral. Los medios utilizados para cultivar y cultivar organoides se pueden preparar un día antes para ahorrar tiempo durante los pasos de generación de organoides. Del mismo modo, el tejido tumoral se puede almacenar hasta 24 h en medios apropiados antes de la preparación del organoide. Si el tiempo es extremadamente limitado, este protocolo incluye pasos de pausa congelando el tejido tumoral el día de la recolección. Luego, estos tejidos congelados se pueden usar para generar organoides viables en una fecha posterior. Aproximadamente el 90% de los organoides derivados del tejido congelado fueron viables, confirmados visualmente bajo un microscopio óptico y con una solución de azul de tripano.
Hay algunas limitaciones a este protocolo. Si bien este enfoque genera organoides viables rápidamente, la cantidad de organoides generados está limitada por la cantidad de tejido tumoral. Esta limitación se hace especialmente evidente cuando se trabaja con muestras clínicas en las que la cantidad de tejido tumoral es menor o, a veces, incluso restringida a unas pocas células. En aquellos casos extremos en los que solo se pueden recuperar unas pocas células como material de partida, el paso puede ser una mejor opción. Otra limitación es el enfoque reduccionista de este método. La eliminación de compartimentos estromales como fibroblastos o células endoteliales enriquece la generación de organoides epiteliales. Sin embargo, estas poblaciones celulares son críticas para la función del tumor. Por lo tanto, su eliminación limita la interpretación de la biología tumoral que se deriva únicamente de modelos organoides epiteliales. En conclusión, este protocolo proporciona un enfoque para la generación rápida de organoides epiteliales para su uso inmediato en aplicaciones de detección de fármacos (incluidas las interacciones inmunitarias) y de imágenes posteriores.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por fondos proporcionados por METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation y el NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Reconocemos la asistencia del recurso compartido de manejo de tejidos del suroeste de la Universidad de Texas, un recurso compartido en el Simmons Comprehensive Cancer Center, que cuenta con el apoyo parcial del Instituto Nacional del Cáncer bajo el número de premio P30 CA142543. Un agradecimiento especial a todos los miembros del Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
