Summary
В этом протоколе обсуждается подход к получению эпителиальных органоидов из первичной нормальной и опухолевой ткани молочной железы посредством дифференциального центрифугирования. Кроме того, включены инструкции по трехмерному культивированию, а также иммунофлуоресцентной визуализации встроенных органоидов.
Abstract
Органоиды являются надежным методом моделирования ткани органа благодаря своим самоорганизующимся свойствам и сохранению функции и архитектуры после размножения из первичной ткани или стволовых клеток. Этот метод генерации органоидов отказывается от дифференцировки одноклеточных клеток через несколько пассажей и вместо этого использует дифференциальное центрифугирование для выделения органоидов эпителия молочной железы из механически и ферментативно диссоциированных тканей. Этот протокол обеспечивает оптимизированную технику быстрого получения мелких и крупных эпителиальных органоидов как из ткани молочной железы мыши, так и из ткани молочной железы человека в дополнение к методам встраивания органоидов в коллаген и базис внеклеточного матрикса. Кроме того, приведены инструкции по фиксации в геле и иммунофлуоресцентному окрашиванию с целью визуализации морфологии и плотности органоидов. Эти методологии подходят для множества последующих анализов, таких как совместное культивирование с иммунными клетками и моделирование метастазов ex vivo с помощью анализа инвазии коллагена. Эти анализы служат для лучшего выяснения поведения клеток и создания более полного понимания взаимодействий в микроокружении опухоли.
Introduction
Способность моделировать эпителиальные клетки in vitro была основой современных биомедицинских исследований, поскольку она фиксирует клеточные особенности, которые недоступны in vivo. Например, выращивание эпителиальных клеточных линий в двумерной плоскости может дать оценку молекулярных изменений, происходящих в эпителиальной клетке во время пролиферации1. Кроме того, измерение динамической регуляции между передачей сигналов и экспрессией генов ограничено в системах in vivo 2. В исследованиях рака моделирование линии эпителиальных клеток рака позволило идентифицировать молекулярные драйверы прогрессирования заболевания и потенциальные мишени для лекарств3. Однако выращивание линий эпителиальных клеток рака в двумерной плоскости имеет ограничения, поскольку большинство из них генетически иммортализированы и модифицированы, часто клональны по своей природе, отобраны по их способности расти в нефизиологических условиях, ограничены в оценке трехмерной (3D) архитектуры опухолевой ткани и не адекватно моделируют взаимодействия микроокружения в реалистичной тканевой среде4. Эти ограничения особенно очевидны при моделировании метастазирования, которое in vivo включает в себя несколько различных биологических стадий, включая инвазию, распространение, циркуляцию и колонизацию в отдаленном участкеоргана 5.
Эпителиальные органоиды рака были разработаны для лучшего повторения 3D-среды и поведения опухолей 6,7,8. Органоиды были впервые разработаны из отдельных клеток кишечника LRG5+ и дифференцированы для представления 3D-структуры звеньев крипты-ворсинок, которые поддерживали иерархическую структуру тонкой кишки in vitro9. Этот подход позволил в режиме реального времени визуализировать и охарактеризовать самоорганизующуюся тканевую архитектуру в гомеостатических и стрессовых условиях. В качестве естественного расширения были разработаны органоиды эпителия рака для моделирования множества различных типов рака, включая колоректальный рак10, рак поджелудочной железы11, рак молочной железы12, печень13, легкие 14, мозг 15 и рак желудка16. Эпителиальные органоиды рака были использованы для характеристики эволюции рака17,18 и метастатического пространственно-временного поведения 19,20 и опроса гетерогенности опухоли 21 и тестирования химиотерапии 22. Раковые эпителиальные органоиды также были выделены и собраны во время текущих клинических испытаний для прогнозирования реакции пациента на противоопухолевые агенты и лучевую терапию ex vivo 8,23,24,25. Кроме того, системы, включающие раковые эпителиальные органоиды, могут быть объединены с другими нераковыми клетками, такими как иммунные клетки, для формирования более полной модели микроокружения опухоли для визуализации взаимодействий в режиме реального времени, раскрытия того, как раковые эпителиальные клетки изменяют фундаментальную природу цитотоксических эффекторных иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, и тестирования потенциальной иммунотерапии и антитело-лекарственной цитотоксической активности26, 27,28. В данной статье демонстрируется способ получения эпителиальных органоидов без пассажа и встраивания в коллаген и базальный внеклеточный матрикс (ECM). Кроме того, используются методы последующей визуализации изолированных органоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все ткани мышей, использованные в этой рукописи, были этически собраны в соответствии с правилами и рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Аналогичным образом, все пациенты дали согласие до донорства тканей под надзором Институционального наблюдательного совета (IRB), и образцы были деидентифицированы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает генерацию органоидов из первичной ткани.
1. Ночная подготовка материалов
- Для встраивания в подвальный внеклеточный матрикс (BECM) разморозьте аликвоту BECM, оставив ее при температуре 4 °C.
2. Приготовление раствора для покрытия коллагеназой и бычьим сывороточным альбумином (BSA)
- Приготовьте 2,64% раствор покрытия BSA/PBS (раствор BSA): стерильный фильтр 50 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и 4,10 мл 30% раствора BSA с использованием фильтрующей колбы объемом 50 мл/0,2 мкм. Этот раствор BSA можно отфильтровать и использовать снова.
- Приготовьте раствор коллагеназы для ткани молочной железы мыши: стерильный фильтр 27 мл базальноклеточной среды, 1,5 мл эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 30 мкл 50 мг/мл гентамицина, 15 мкл инсулина 10 мг/мл, 600 мкл 0,1 г/мл коллагеназы А и 600 мкл 0,1 г/мл трипсина 0,1 г/мл с использованием фильтрующей колбы 50 мл/0,2 мкм. Выделите от 10 мл до 30 мл раствора коллагеназы на мышь, в зависимости от массы ткани.
- Приготовьте раствор коллагеназы для тканей молочной железы человека: стерильный фильтр 18 мл RPMI-1640, 200 мкл 100-кратного раствора пенициллина-стрептомицина (ручка/стрептококк), 200 мкл 10 мМ буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанасульфоновой кислоты (HEPES), 1 мл FBS и 400 мкл 0,1 г/мл коллагеназы A с использованием фильтрующей колбы объемом 50 мл/0,2 мкм. Выделяют от 10 мл до 20 мл на образец ткани, в зависимости от массы ткани.
3. Подготовка носителей
- Подготовьте органоидную среду: стерильную фильтрующую базальноклеточную среду с 1% пером/стрептококком и 1% инсулин-трансферрин-селеном (ITS) с использованием фильтрующей колбы 50 мл/0,2 мкм. Чтобы получить среду с органоидным фактором роста, добавьте основной фактор роста фибробластов (bFGF) к конечной концентрации 2,5 нМ.
- Подготовьте эпителиальные среды молочной железы: чтобы сделать 100 мл эпителиальной среды молочной железы, стерильный фильтр с высоким содержанием глюкозы общей базальной среды с 1 мл 100-кратной добавки глютамина, 1 мл шприц-ручки / стрептококка, 1 мл 10 мМ буфера HEPES (7,3 pH), 250 мкл 30% запаса BSA, 1 мкл 1 мг / мл запаса холерного токсина, 1 мл 50 мкг / мл гидрокортизона в PBS, 50 мкл 10 мг/мл раствора человеческого инсулина, 10 мкл 50 мкг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 1% FBS с использованием фильтрующей колбы объемом 150 мл/0,2 мкм. Храните носитель при температуре 4 °C и используйте до 2 недель.
- Приготовьте промывку амфотерицином: стерильный фильтр PBS с 2% пером/стрептококком и 2% амфотерицином B. Хранить при температуре 4 °C.
4. Сбор и переваривание тканей
- Ткань молочной железы мыши
- Усыпьте мышь, поместив ее в камеру CO 2 на2-5 минут, а затем последует вывих шейки матки. Брюшной стороной вверх растопырите конечности мыши и используйте четыре иглы 19 G, чтобы прижать мышь за лапы к доске, покрытой впитывающей прокладкой. Сбрызните 70% этанолом, чтобы разгладить шерсть и продезинфицировать кожу. Вытрите кал марлевой салфеткой или салфеткой.
- Начиная чуть выше аногенитальной области, разрежьте вверх от средней линии хирургическими ножницами, стараясь не проткнуть брюшину. Достигнув подбородка, сделайте боковые надрезы по обеим ключицам и вниз задних лап и прижмите натянутую кожу мыши к доске, чтобы обнажить жировые подушечки молочной железы.
- Найдите паховые жировые подушечки молочной железы у мышей дикого типа, определив паховый лимфатический узел, расположенный рядом с задними конечностями. Найдите грудные жировые подушечки молочной железы у мышей дикого типа как более толстую васкуляризированную ткань под передними конечностями.
- Используйте щипцы, чтобы поднять жировую подушечку молочной железы. Избегайте скопления нижележащих мышц. Используя тупой конец ножниц с острым тупым предметом, создайте карман под жировой подушечкой молочной железы, подальше от кожи. Отрежьте жировую подушечку молочной железы одним целым куском.
- После удаления жировых отложений молочной железы промойте их в PBS, прежде чем помещать их в стерильную чашку для культивирования тканей. Быстро переносят в тканевый культуральный колпак.
ПРИМЕЧАНИЕ: При опухолях молочной железы используйте ватный тампон, смоченный PBS, чтобы аккуратно откатить опухоль от кожи. Обязательно избегайте затемненных или мягких участков, так как темное обесцвечивание указывает на некроз, который не даст здоровых органоидов. - Измельчите опухоли молочной железы скальпелем #10 или #11, чтобы ослабить ткань, пока она не достигнет пастообразной консистенции. Переведите измельченную ткань в коническую трубку, содержащую 10-30 мл раствора коллагеназы, с помощью скальпеля. Чтобы убедиться, что вся ткань собрана, пипеткой нанесите 1 мл раствора коллагеназы на пластину для культивирования тканей и обратно в коническую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более крупных органоидов механическое разложение должно быть сведено к минимуму, оставляя некоторые небольшие видимые кусочки ткани нетронутыми. В качестве альтернативы, ткань можно хранить в замороженном виде для последующего приготовления органоидов с минимальной потерей жизнеспособности. Для этого промойте ткань в растворе PBS или базальноклеточной среде + 1% FBS, а затем крупно измельчите для увеличения площади поверхности (сохраняя ткань в одном или двух твердых кусочках). Переместите ткань в крио-флакон, залейте замораживающей средой (90% FBS + 10% диметилсульфоксида (ДМСО)). Заморозьте флаконы в контейнере для замораживания с контролируемой скоростью на ночь, прежде чем перемещать их на хранение в жидком азоте. - Поместите коническую трубку в настольный встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C при 180 об/мин до тех пор, пока ткань не станет волокнистой, а раствор коллагеназы не помутнеет. Например, большая масса ткани (около 500-800 мг) из опухоли занимает 30-60 минут. Меньшая масса ткани (около 100-300 мг) из жировых подушечек молочной железы дикого типа занимает около 20-30 минут. Если вы не уверены, проверяйте с интервалом в 5 минут.
- После инкубации центрифугируют коническую пробирку в течение 10 мин при 550 x g при комнатной температуре (RT).
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двигаясь вперед, предварительно покройте все наконечники пипеток, серологические пипетки и конические трубки раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов из-за адгезии к пластику. - Добавьте в пробирку 8 мл базальноклеточной среды и 80 мкл раствора ДНКазы [2 ЕД/мкл]. Аккуратно переверните на 1-3 минуты.
- Добавьте 12 мл базальноклеточной среды в пробирку и тщательно перемешайте пипеткой или осторожно поверните пробирку 15 раз, чтобы перемешать.
- Центрифуга в течение 10 мин при 550 x g при RT.
- Аспирируют надосадочную жидкость, а затем ресуспендируют гранулу в 12 мл базальноклеточной среды.
- Пусть самые тяжелые фрагменты ткани осядут на дно. Соберите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки и перенесите в коническую пробирку объемом 15 мл. Эта суспензия содержит эпителиальные органоиды и стромальные/иммунные клетки.
- Ткань молочной железы человека
- Обработайте образцы тканей молочной железы человека на наличие органоидов или храните их в течение 24 часов после сбора. Храните образцы при температуре 4 °C в среде CO2-Independent с 1% 100-кратным антибиотиком-антимикотиком.
- Перенесите ткань в пластину для культивирования тканей. Наклоните пластину и аспирируйте излишки среды хранения, а затем промойте ткань 5 мл промывки амфотерицином B. Немедленно удалите смывку амфотерицина B.
- Измельчите образец ткани скальпелем #10 или #11, чтобы ослабить ткань, пока она не достигнет пастообразной консистенции. Переведите измельченную ткань в коническую трубку, содержащую 10-30 мл раствора коллагеназы, с помощью скальпеля. Чтобы убедиться, что вся ткань собрана, пипеткой нанесите 1 мл раствора коллагеназы на пластину для культивирования тканей и верните в коническую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более крупных органоидов механическое разложение должно быть сведено к минимуму, оставляя некоторые небольшие видимые кусочки ткани нетронутыми. Начальная масса ткани для этого протокола варьировалась в пределах 100-250 мг. В качестве альтернативы, ткань можно хранить замороженной для последующего приготовления органоидов с минимальной потерей жизнеспособности после шага 4.2.2 в 90% FBS + 10% DMSO, как указано выше. - Поместите коническую трубку в настольный встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C при 180 об/мин до тех пор, пока ткань не станет меньше, а коллагеназа не помутнеет. Проверяйте ткань с интервалом в 5 минут. Диссоциация коллагеназы образцов человека занимает примерно 5-20 минут.
- После инкубации откручивают коническую трубку в течение 10 мин при 550 x g при RT.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двигаясь вперед, предварительно покройте все наконечники пипеток, серологических пипеток и конических пробирок раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов из-за адгезии к пластику. - Добавьте 4 мл базальноклеточной среды и 40 мкл раствора ДНКазы [2 Ед/мкл] в коническую пробирку. Аккуратно переверните на 3 минуты.
- Добавьте 6 мл базальноклеточной среды в пробирку и тщательно перемешайте пипеткой или осторожно поверните коническую трубку 15 раз, чтобы перемешать.
- Центрифуга в течение 10 мин при 550 x g при RT.
- Аспирируют надосадочную жидкость, а затем ресуспендируют гранулу в 10 мл базальноклеточной среды.
- Пусть самые тяжелые фрагменты ткани осядут на дно. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Эта суспензия содержит эпителиальные органоиды и стромальные/иммунные клетки.
5. Дифференциальное центрифугирование
- Пульсируют до 550 x g в течение 3-4 с при RT, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 10 мл базальноклеточной среды. Повторите этот шаг еще три раза (всего четыре вращения).
- После каждого центрифугирования следите за тем, чтобы гранулы становились все более непрозрачными. Эта оставшаяся гранула будет эпителиальными органоидами.
6. Сбор мелких органоидов
- Импульс до 80-100 x g в течение 3 с при RT. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку, покрытую BSA, а затем импульсируйте до 550 x g в течение 3 с при RT, чтобы гранулировать мелкие органоиды.
7. Встраивание органоидов в BECM
- Аликвотировать целесообразную суспензию органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов по отношению к количеству БЭКМ на лунку (табл. 1). Например, используйте 50-100 органоидов на 20 мкл БЭКМ в одной лунке 96-луночного планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность органоидов можно рассчитать по следующей формуле: ((Среднее количество органоидов)/50 мкл) х коэффициент разбавления. - Выполняйте все действия на льду. Поместите размороженный BECM на лед в тканевый культуральный колпак. Во время подготовки вытяжки поместите все кончики пипеток на лед, чтобы они остыли.
- Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки в течение 10 мин при 300 x g при RT. Выбросьте надосадочную жидкость из пробирок. Переместите пробирки с органоидными гранулами на лед и добавьте соответствующий объем BECM в каждую микроцентрифужную пробирку (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку BECM является вязким, добавьте дополнительные объемы (примерно на 10-20% больше объема купола) BECM, чтобы учесть потери в наконечнике пипетки. - Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в BECM, стараясь не образовывать пузырьков.
- Медленно и осторожно нанесите суспендированные BECM органоиды на поверхность покрытия. Во время пипетки медленно поднимите пипетку, чтобы создать купол. Заполните все пустые колодцы PBS для поддержания влажности.
- Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час, чтобы дать BECM затвердеть, а затем накройте средой соответствующего объема (таблица 1).
8. Встраивание органоидов в коллаген
- Выполняйте все действия на льду. Приготовьте раствор коллагена, комбинируя в последовательном порядке 375 мкл 10x DMEM, 100 мкл 1 N гидроксида натрия (NaOH) и 3 мл раствора коллагена I крысиного хвоста в конической пробирке объемом 15 мл. Пипеткой перемешайте, стараясь не делать пузырьков. Титруйте раствор до рН 7,2-7,4 небольшими количествами (с шагом 1-3 мкл) NaOH или 10x DMEM по мере необходимости.
- Покройте дно лунок минимальным количеством коллагена, необходимым для полного покрытия дна лунки. Один из подходов заключается в том, чтобы поместить небольшое количество коллагена и раскачивать пластину из стороны в сторону, чтобы покрыть. Дайте коллагеновой подложке застыть при температуре 37 °C в течение 30 мин-2 ч.
- Аликвотируют соответствующую суспензию органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов относительно количества коллагена в лунке (табл. 1). Поместить в инкубатор с температурой 37 °C.
- Храните раствор коллагена при температуре 4 °C и контролируйте полимеризацию, проверяя образование волокон под микроскопом каждые 10 минут. Коллаген достигнет соответствующей полимеризации между 30 мин-2 часами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная полимеризация может быть определена по наличию волокон, разветвляющихся по всей матрице. Сразу же переходите к шагу 8.5, как только в поле зрения будет замечено несколько волокон. - Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки при 300 x g в течение 10 мин при ЛТ. Выбросьте надосадочную жидкость из пробирок. Переместите гранулы органоидов в лед и добавьте соответствующий объем коллагена в каждую микроцентрифужную пробирку (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку коллаген вязкий, добавьте дополнительные объемы (примерно на 10-20% больше объема купола) коллагена, чтобы учесть потерю наконечника пипетки. - Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в коллагене, стараясь не образовывать пузырьков.
- Медленно и осторожно нанесите суспендированные коллагеном органоиды на поверхность покрытия. Во время пипетки медленно поднимите пипетку, чтобы создать купол. Заполните все пустые колодцы PBS для поддержания влажности.
- Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час, чтобы коллаген затвердел, а затем накройте средой соответствующего объема (таблица 1).
- ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды сохраняют жизнеспособность в 3D-матрице до 7 дней. Если для анализа используется визуализация, перейдите к шагам 9 и 10.
9. Исправление встроенных органоидов
- Используйте пипетку для удаления всех сред из скважин, не вступая в контакт с куполами ECM.
- Зафиксируйте 4% раствором параформальдегида (PFA)/PBS в течение 5 мин.
- Вымойте два-три раза, нанеся PBS на лунки, поместив их на медленно движущийся шейкер. После мытья нанесите свежий PBS на купола и храните пластину при температуре 4 °C.
10. Иммунофлюоресцентное окрашивание встроенных органоидов
- Приготовление растворов для иммунофлюоресцентного окрашивания
- Буфер для пермеабилизации: Приготовьте раствор PBS с 10% Triton X-100.
- Блокирующий буфер: Приготовьте раствор PBS с 10% FBS и 0,2% Triton X-100.
- Буфер для разведения антител: Приготовьте раствор PBS с 2% FBS и 0,2% Triton X-100.
- Пермеабилизация и блокировка
- Пипетка достаточно проницаемого буфера, чтобы покрыть купола ECM. Инкубировать в течение 1 ч при РТ на медленно движущемся шейкере.
- Извлеките пермеабилизирующий буфер пипеткой и нанесите тот же объем блокирующего буфера в течение 3 ч.
- Первичная инкубация антител
- Удалите блокирующий буфер с помощью пипетки и нанесите буфер для разбавления антител, содержащий первичное антитело, в концентрациях, указанных производителем. Инкубируйте образец при температуре 4 °C в течение 12-16 ч на медленно движущемся шейкере.
- Удалите раствор первичного антитела и промойте образцы три раза в течение 10 минут с помощью PBS при RT на медленно движущемся шейкере.
- Инкубация вторичных антител и ядерное окрашивание
- Аспирируйте оставшуюся промывку PBS и нанесите буфер для разбавления антител, содержащий вторичные антитела, в концентрациях, указанных производителем. Кроме того, добавьте DAPI или Hoechst (для маркировки ядер) или фаллоидин (для маркировки актина) в буфер в соотношении 1:250. Инкубировать в течение 2-4 ч при RT на медленно движущемся шейкере.
- Удалите раствор вторичных антител и промойте образцы три раза в течение 10 мин в PBS при RT на шейкере. Храните образцы в PBS при температуре 4 °C до получения изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изображения, представленные на рисунке 1, представляют собой пример эпителиальных органоидов эпителия молочной железы дикого типа из тканей человека и мыши. Краткая иллюстрация метода выделения эпителиальных органоидов с помощью дифференциального центрифугирования представлена в мультипликационном рабочем процессе на рисунке 1A, показывая, что первичные ткани разных видов могут быть обработаны почти идентичными способами с получением эпителиальной ткани, как показано на изображениях светлого поля (рис. 1B ). Кроме того, эти межвидовые сходства состава тканей можно увидеть на иммунофлуоресцентных изображениях встроенных органоидов либо в базальном внеклеточном матриксе, либо в коллагене, показанных на рисунке 2A-D. Органоидная структура может быть визуализирована либо с помощью мембранной маркировки томата (mTomato), либо с помощью фаллоидного окрашивания актина. Эти рисунки также демонстрируют ожидаемый состав и размер органоидов с использованием этого метода. Органоиды, встроенные в коллагеновую матрицу, могут быть использованы для анализа инвазии и проанализированы путем отслеживания расширения усиков, ответвляющихся от самого органоида, как показано на рисунке 2C. Наконец, окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) органоидов, встроенных в парафин, показывает, что органоиды сохраняют ту же гистологию рака молочной железы (рис. 2E).
Рисунок 1: Рабочий процесс генерации эпителиальных органоидов с примерами органоидов. (A) Схема рабочего процесса генерации органоидов из тканей мыши или человека без пассажа. (B) Репрезентативные изображения изолированных эпителиальных органоидов из молочных желез WT мыши, опухолей молочной железы мыши и опухолей молочной железы человека в средах после выделения. Каждое изображение было индивидуально настроено на яркость и контрастность для улучшенной визуализации. Изображения были сделаны в светлом поле на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе с 10-кратным увеличением. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Опухоли молочной железы были выделены у мышей MMTV-PyMT; нормальная ткань молочной железы была выделена у мышей FVB. Мыши варьировались от 8 до 14 недель в возрасте29 лет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация органоидов во внеклеточном матриксе. Каждое изображение было индивидуально настроено на яркость и контрастность для улучшенной визуализации для этой коллекции. Перед визуализацией образцы фиксировали 4% параформальдегидом. Образцы дикого типа окрашивали фаллоидином 568 для визуализации клеточной мембраны, а все образцы окрашивали Хёхстом для визуализации ядер, демонстрируя морфологию и плотность органоидов. Изображения были получены с 10-кратным увеличением на конфокальный микроскоп и дополнительно увеличены с помощью сканирующего зума 3,003. Длина волны лазера, используемая для обнаружения DAPI, составляла 405 нм с мощностью 5, а длина волны лазера, используемая для обнаружения фаллоидина, составляла 561,0 нм для канала 3 с мощностью 0,5. Размер конфокального точечного отверстия был сохранен на уровне 19,16 для всех изображений. (A) Репрезентативное изображение светлого поля органоида WT молочной железы мыши, встроенного в BECM в день 0. (A') 1:250 Хёхста мечет ядра и (A'') 1:250 фаллоидин мечет актин иммунофлуоресцентные изображения A. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Нормальная ткань молочной железы была выделена от мышей FVB. Возраст мышей варьировался от 8 до 12 недель. (B) Репрезентативное изображение светлого поля органоида опухоли молочной железы мыши, встроенного в BECM в день 0. (B') 1:250 Ядра мечения Хёхста и (B'') меченое mTomato иммунофлуоресцентное изображение B. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Опухоли молочной железы были выделены у мышей MMTV-PyMT. Возраст мышей варьировался от 12 до 14 недель. (C) Репрезентативное изображение светлого поля органоида опухоли молочной железы мыши, встроенного в коллаген I на 3-й день. Изображение представляет собой органоид, демонстрирующий «инвазивное» свойство. (C') 1:250 Ядра маркировки Хёхста и (C') меченое томатами иммунофлуоресцентное изображение C. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Опухоли молочной железы были выделены у мышей MMTV-PyMT. Возраст мышей варьировался от 12 до 14 недель. (D) Репрезентативное изображение светлого поля органоида опухоли молочной железы человека, встроенного в BECM в день 0. (Д') Меченые ядра Хёхста и (D'') 1:250 Актин-нацеленное на меченое фаллоидином иммунофлуоресцентное изображение D. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. (E) Срезированное изображение органоида, встроенного в BECM и окрашенного H&E, полученное при 20-кратном увеличении. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Окрашивание H&E было выполнено Юго-западным управлением тканями Техасского университета Shared Resource30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Культуральная тарелка | Объем купола ECM | Рекомендуемое количество органоидов | Объем мультимедиа |
| 6-луночная пластина | 200 мкл | 300 | 3 мл |
| 12-луночная пластина | 150 мкл | 225 | 2 мл |
| 24-луночная пластина | 100 мкл | 150 | 1 мл |
| 48-луночная пластина | 40 мкл | 60 | 300 мкл |
| 96-луночная пластина | 20 мкл | 30 | 150 мкл |
Таблица 1: Рекомендуемый объем компонентов ECM для куполов, плотность органоидов и объем среды, необходимой для каждой скважины на различных культуральных планшетах.
| Проблема | Возможная причина | Решение | |||
| Купола ЭВМ рухнули. | Пластина тряслась, объем ECM был слишком велик для поддержания формы купола, или купола касались края колодца, заставляя их прилипать и падать. | Избегайте слишком энергичного перемещения пластины до того, как купола схватятся, уменьшите объем ECM, используемого для ресуспендирования органоидов, или будьте очень осторожны, чтобы пипетировать купола в центре пластины. | |||
| Есть ткани, которые не похожи на органоиды. | Мышечная ткань или нерв могли быть собраны в процессе сбора жировой подушечки молочной железы. | Отрежьте только то, что явно является жировой подушкой молочной железы. Избегайте удаления ткани, которая плотно прилегает к коже. | |||
| Есть много мертвых органоидов. | Была собрана некротическая опухолевая ткань. | Избегайте сбора ткани из опухолей, которые являются некротическими, кистозными, чрезмерно мягкими или более темными по цвету. Опухолевая ткань должна быть твердой. | |||
| Одиночных клеток больше, чем органоидов. | Ткань была слишком мелко измельчена, или переваривание коллагеназы было запущено слишком долго. | Избегайте чрезмерного измельчения тканей или сократите время инкубации коллагеназы. | |||
| В ECM есть пузыри. | Ресуспендирование с помощью пипетки было слишком энергичным, а выброс при пипетировании куполов был слишком быстрым. | Медленно ресуспендируйте органоиды в ECM и медленно пипетируйте их в купола. Если проблема не устранена, не переходите ко второй остановке во время пипетки. | |||
| В коллагене нет вторжения органоидов. | Коллаген не был должным образом полимеризован или чрезмерно полимеризован. | Не ресуспендируйте органоид в коллагене до надлежащей полимеризации. Проверка каждые 30 мин. Если полимеризация не видна, немедленно ресуспендируйте на отметке 2 ч и пластину. | |||
| При наблюдении за полимеризацией не видно коллагеновых волокон. | Настройки микроскопа были неблагоприятными. | Отрегулируйте фазовый контраст для максимальной темноты, а затем увеличьте яркость микроскопа до упора. Кроме того, увеличение увеличения может улучшить просмотр. | |||
| Купола ECM растворились. | Время фиксации было слишком большим, или PFA не был полностью удален из образцов, встроенных в ECM. | Поддерживайте время фиксации куполов ECM ниже 5 минут и проведите пять промывок на вращающемся шейкере по 5 минут каждая. | |||
Таблица 2: Таблица потенциальных проблем, причин и решений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В литературе описаны различные методы получения опухолевых органоидов. В этом протоколе описывается метод получения опухолевых органоидов непосредственно из опухоли без пассажа. Используя этот метод, опухолевые органоиды могут быть получены в течение нескольких часов после начала процедуры и генерируют почти 100% жизнеспособных органоидов по сравнению с 70%, о которых сообщается в литературе31. Для сравнения, другие методы требуют последовательного пассажа клеток в органоиды в течение нескольких недель. Таким образом, последующие приложения, такие как определение и визуализация взаимодействия иммунных клеток с соответствующими органоидными и иммунными образцами от одного и того же хозяина без воздействия долгосрочного культивирования, становятся более осуществимыми. Кроме того, как показано на рисунке 2C, встраивание опухолевых органоидов в различные внеклеточные матрицы может позволить идентифицировать ключевые фенотипы по всему метастатическому каскаду, такие как инвазия из первичной опухоли. Другие последующие приложения включают фенотипические анализы ветвящегося морфогенеза32, инвазии, диссеминации и образованияколоний 33 для оценки различного поведения эпителиальных клеток. Иммунные взаимодействия также могут быть функционально и визуально зафиксированы с помощью этих анализов на основе органоидов. Кроме того, гели могут быть растворены для выделения встроенных клеток для последующего анализа генетического и белкового содержания с использованием стандартных биохимических и проточных анализов. Наконец, поскольку большое количество органоидов может быть быстро получено из опухолевой ткани, эти анализы могут быть масштабированы для применения в скрининге лекарств и интеграции в рабочие процессы клинических испытаний.
Есть несколько ключевых шагов, которые имеют решающее значение для этого протокола. Во-первых, количество времени, необходимое для переваривания коллагеназы, зависит от состава ткани и количества перевариваемой ткани. Например, при работе с более мелкими кусочками ткани, такими как хирургические образцы опухолей молочной железы человека (в среднем 100-250 мг), требуется более короткое время переваривания. Однако опухоли молочной железы, собранные у мыши, намного больше по размеру (500-800 мг) и могут потребовать 30-60 минут ферментативного пищеварения. Во-вторых, чтобы обеспечить максимальный выход эпителиальных органоидов, также важно покрыть все наконечники пипеток и серологические пипетки BSA, чтобы избежать потери адгезии клеток к пластику. В-третьих, короткое время дифференциального центрифугирования имеет решающее значение для устранения неэпителиальных компонентов ткани. Такой подход позволяет более тяжелым эпителиальным органоидам гранулироваться, в то время как более легкие стромальные и иммунные компартменты остаются в надосадочной жидкости. Для создания анализов инвазии путем встраивания органоидов в коллаген очень важно обеспечить надлежащую полимеризацию коллагена перед встраиванием органоидов. Этот шаг следует проверить визуально, подтвердив образование коллагеновых волокон под световым микроскопом. Наконец, для достижения наилучших результатов визуализации позаботьтесь о том, чтобы избежать образования пузырьков при ресуспендировании органоидов в ECM и покрытии. Пузырьки будут скрывать органоиды внутри геля и искажать изображения. В таблице 2 перечислены потенциальные проблемы, с которыми они столкнулись, и решения для их преодоления.
Некоторые шаги в протоколе позволяют вносить изменения для настройки размера генерируемых органоидов или сокращения времени, необходимого для выполнения протокола. Например, увеличение продолжительности времени механического разложения может привести к сокращению времени переваривания коллагеназы, уменьшению органоидов и большему количеству отдельных клеток. Центрифугирование после переваривания коллагеназы может быть сокращено до 5 минут при работе с большим количеством опухолевой ткани. Среды, используемые для культивирования и выращивания органоидов, могут быть приготовлены за день до этого, чтобы сэкономить время на этапах генерации органоидов. Аналогичным образом, опухолевая ткань может храниться до 24 часов в соответствующих средах перед приготовлением органоидов. Если время крайне ограничено, этот протокол включает в себя приостановку шагов путем замораживания опухолевой ткани в день сбора. Затем эти замороженные ткани могут быть использованы для создания жизнеспособных органоидов на более позднем этапе. Приблизительно 90% органоидов, полученных из замороженной ткани, были жизнеспособными, что подтверждалось визуально под световым микроскопом и раствором трипанового синего.
У этого протокола есть некоторые ограничения. В то время как этот подход быстро генерирует жизнеспособные органоиды, количество генерируемых органоидов ограничено количеством опухолевой ткани. Это ограничение становится особенно очевидным при работе с клиническими образцами, в которых количество опухолевой ткани меньше или, порой, даже ограничено несколькими клетками. В тех крайних случаях, когда только несколько клеток могут быть восстановлены в качестве исходного материала, пассаж может быть лучшим вариантом. Другим ограничением является редукционистский подход этого метода. Удаление стромальных компартментов, таких как фибробласты или эндотелиальные клетки, обогащает образование эпителиальных органоидов. Однако эти клеточные популяции имеют решающее значение для функции опухоли. Следовательно, их удаление ограничивает интерпретацию биологии опухоли, которая вытекает исключительно из моделей эпителиальных органоидов. В заключение, этот протокол обеспечивает подход к быстрой генерации эпителиальных органоидов для немедленного использования в последующих приложениях визуализации, функциональных (включая иммунные взаимодействия) и скрининга лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано финансированием, предоставленным METAvivor, Фондом Питера Карлсона, Исследовательским фондом Терезы и Онкологическим центром Симмонса NCI / UTSW P30 CA142543. Мы выражаем признательность за помощь Общему ресурсу по управлению юго-западными тканями Техасского университета, общему ресурсу в Комплексном онкологическом центре Симмонса, который частично поддерживается Национальным институтом рака под номером P30 CA142543. Особая благодарность всем членам Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
