Summary
Detta protokoll diskuterar ett tillvägagångssätt för att generera epitelorganoider från primär normal och tumörbröstvävnad genom differentiell centrifugering. Vidare ingår instruktioner för tredimensionell odling samt immunofluorescerande avbildning av inbäddade organoider.
Abstract
Organoider är en pålitlig metod för modellering av organvävnad på grund av deras självorganiserande egenskaper och bibehållande av funktion och arkitektur efter förökning från primärvävnad eller stamceller. Denna metod för organoidgenerering avstår från encellsdifferentiering genom flera passager och använder istället differentiell centrifugering för att isolera bröstepitelorganoider från mekaniskt och enzymatiskt dissocierade vävnader. Detta protokoll ger en strömlinjeformad teknik för att snabbt producera små och stora epitelorganoider från både mus och mänsklig bröstvävnad utöver tekniker för organoidinbäddning i kollagen och extracellulär matris i källaren. Vidare tillhandahålls instruktioner för in-gelfixering och immunofluorescerande färgning i syfte att visualisera organoidmorfologi och densitet. Dessa metoder är lämpliga för otaliga nedströmsanalyser, såsom samodling med immunceller och ex vivo-metastasmodellering via kollageninvasionsanalys. Dessa analyser tjänar till att bättre belysa cell-cellbeteende och skapa en mer fullständig förståelse för interaktioner inom tumörmikromiljön.
Introduction
Möjligheten att modellera epitelceller in vitro har varit grunden för modern biomedicinsk forskning eftersom den fångar cellulära egenskaper som inte är tillgängliga in vivo. Till exempel kan växande epitelcellinjer i ett tvådimensionellt plan ge en bedömning av de molekylära förändringar som uppstår i en epitelcell under proliferation1. Dessutom är mätning av den dynamiska regleringen mellan signalering och genuttryck begränsad i in vivo-system 2. Inom cancerforskning har cancerepitelial cellinjemodellering möjliggjort identifiering av molekylära drivkrafter för sjukdomsprogression och potentiella läkemedelsmål3. Växande cancerepitelcellinjer på ett tvådimensionellt plan har emellertid begränsningar, eftersom de flesta är genetiskt odödliga och modifierade, ofta klonala i naturen, utvalda för sin förmåga att växa under icke-fysiologiska förhållanden, begränsade i sin bedömning av tredimensionell (3D) tumörvävnadsarkitektur och inte tillräckligt modellerar mikromiljöinteraktioner inom en realistisk vävnadsmiljö4. Dessa begränsningar är särskilt tydliga vid modellering av metastaser, som in vivo inkluderar flera distinkta biologiska stadier, inklusive invasion, spridning, cirkulation och kolonisering vid den avlägsna organplatsen5.
Cancer epitelorganoider har utvecklats för att bättre rekapitulera 3D-miljön och beteendet hos tumörer 6,7,8. Organoider utvecklades först från enstaka LRG5 + intestinala kryptceller och differentierades för att representera 3D-strukturen hos krypt-villusenheter som upprätthöll tunntarmens hierarkiska struktur in vitro 9. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde visualisering och karakterisering i realtid av självorganiserande vävnadsarkitektur under homeostatiska och stressförhållanden. Som en naturlig förlängning utvecklades cancerepitelorganoider för att modellera många olika cancertyper, inklusive kolorektal 10, bukspottskörtel 11, bröst 12, lever 13, lunga14, hjärna 15 och magcancer 16. Cancerepitelorganoider har utnyttjats för att karakterisera cancerutveckling17,18 och metastaserande spatiotemporala beteenden 19,20 och förhöra tumörheterogenitet 21 och testa kemoterapier 22. Cancerepitelorganoider har också isolerats och samlats in under pågående kliniska prövningar för att förutsäga patientens svar på cancerläkemedel och strålbehandling ex vivo 8,23,24,25. Vidare kan system som innehåller cancerepitelorganoider kombineras med andra icke-cancerceller, såsom immunceller, för att bilda en mer omfattande modell av tumörmikromiljön för att visualisera interaktioner i realtid, avslöja hur cancerepitelceller förändrar den grundläggande karaktären hos cytotoxiska effektorimmunceller, såsom naturliga mördarceller, och testa potentiella immunterapier och antikroppsberoende cytotoxisk aktivitet26, 27,28. Denna artikel demonstrerar en metod för att generera epitelorganoider utan att passera och bädda in i kollagen och källare extracellulär matris (ECM). Dessutom delas tekniker för nedströms avbildning av isolerade organoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All musvävnad som används i detta manuskript har samlats in etiskt i enlighet med IACUC: s (Institutional Animal Care and Use Committee) föreskrifter och riktlinjer från University of Texas Southwestern Medical Center. På samma sätt samtyckte alla patienter före vävnadsdonation under överinseende av en institutionell granskningsnämnd (IRB), och proverna avidentifierades.
OBS: Detta protokoll beskriver genereringen av organoider från primärvävnad.
1. Beredning av material över natten
- För inbäddning i extracellulär matris i källaren (BECM), tina BECM-alikvoten genom att lämna den vid 4 °C.
2. Beredning av kollagenas och bovint serumalbumin (BSA) beläggningslösning
- Bered 2,64 % BSA/PBS-beläggningslösning (BSA-lösning): Sterilfilter 50 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 4,10 ml 30 % BSA-lösning med en 50 ml/0,2 μm filterkolv. Denna BSA-lösning kan filtreras och användas igen.
- Bered kollagenaslösning för bröstvävnad från mus: Sterilt filter 27 ml basalcellmedium, 1,5 ml fetalt bovint serum (FBS), 30 μl 50 mg/ml gentamicin, 15 μl 10 mg/ml insulin, 600 μl 0,1 g/ml kollagenas A och 600 μl 0,1 g/ml trypsin med en 50 ml/0,2 μm filterkolv. Tilldela mellan 10 ml och 30 ml kollagenaslösning per mus, beroende på vävnadsmassa.
- Bered kollagenaslösning för mänsklig bröstvävnad: Sterilt filter 18 ml RPMI-1640, 200 μL 100x penicillin-streptomycinlösning (penna/strep), 200 μl 10 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyrabuffert (HEPES), 1 ml FBS och 400 μl 0,1 g/ml kollagenas A med en 50 ml/0,2 μm filterkolv. Tilldela mellan 10 ml och 20 ml per vävnadsprov, beroende på vävnadsmassan.
3. Förbereda media
- Bered organoidmedia: Sterilt filterbasalcellmedium med 1 % penna/strep och 1 % insulintransferrinselen (ITS) med en 50 ml/0,2 μm filterkolv. För att göra organoida tillväxtfaktormedier, tillsätt grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) till en slutlig koncentration av 2,5 nM.
- Förbered bröstepitelmedia: För att göra 100 ml bröstepitelmedia, sterilt filter högglukos vanligt basalmedium med 1 ml 100x glutamintillskott, 1 ml penna / strep, 1 ml 10 mM HEPES-buffert (7,3 pH), 250 μL 30% BSA-lager, 1 μL 1 mg / ml koleratoxinstam, 1 ml 50 μg / ml hydrokortisonlager i PBS, 50 μl 10 mg/ml human insulinlösning, 10 μl 50 μg/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 1 % FBS med en 150 ml/0,2 μm filterkolv. Förvara mediet vid 4 °C och använd det i upp till 2 veckor.
- Förbered amfotericintvätt: Sterilfilter PBS med 2% penna/strep och 2% amfotericin B. Förvaras vid 4 °C.
4. Samla och smälta vävnad
- Mus bröstvävnad
- Avliva musen genom att placera i en CO 2-kammare i2-5 minuter och följ sedan med cervikal dislokation. Med den ventrala sidan vänd uppåt, spela musbenen och använd fyra 19 G nålar för att fästa musen vid tassarna på ett bräde täckt med en absorberande dyna. Spraya med 70% etanol för att släta pälsen ner och desinficera huden. Torka bort avföring med en gasväv eller vävnad.
- Börja strax ovanför den anogenitala regionen, skär uppåt från mittlinjen med kirurgisk sax, var försiktig så att du inte tränger igenom bukhinnan. När du når hakan, gör laterala snitt ner både nyckelben och ner bakben och fäst musens hud spänd på brädet för att exponera bröstfettkuddar.
- Lokalisera de inguinala bröstfettkuddarna på vildtypsmöss genom att identifiera den inguinala lymfkörteln som ligger nära bakbenen. Leta reda på bröstkorgsfettkuddarna på vildtypsmöss som den tjockare, vaskulariserade vävnaden under frambenen.
- Använd pincett för att höja bröstfettkudden. Undvik att samla underliggande muskler. Använd den trubbiga änden av den vassa trubbiga saxen och skapa en ficka under bröstfettkudden, bort från huden. Skär bort bröstfettkudden i ett komplett stycke.
- När bröstfettkuddar har tagits bort, skölj i PBS innan du placerar dem i en steril vävnadsodlingsskål. Överför snabbt till en vävnadsodlingshuva.
OBS: För brösttumörer, använd en bomullspinne fuktad med PBS för att försiktigt rulla tumören bort från huden. Var noga med att undvika mörka eller mjuka områden, eftersom mörk missfärgning indikerar nekros, vilket inte ger friska organoider. - Hacka brösttumörerna med en skalpell # 10 eller # 11 för att lossa vävnaden tills den når en pastaliknande konsistens. Överför den malet vävnaden till ett koniskt rör innehållande 10-30 ml kollagenaslösning med en skalpell. För att säkerställa att all vävnad samlas in, pipettera 1 ml kollagenaslösning på vävnadsodlingsplattan och tillbaka in i det koniska röret.
OBS: För att producera större organoider bör mekanisk matsmältning minimeras och lämna några små synliga bitar av vävnad intakta. Alternativt kan vävnad förvaras fryst för senare organoidberedning med minimal förlust av livskraft. För att göra det, tvätta vävnad i en lösning av PBS eller basalcellmedia + 1% FBS och hacka sedan grovt för att öka ytan (håll vävnaden i en eller två fasta bitar). Flytta vävnaden till en kryoflaska, topp med frysmedel (90% FBS + 10% dimetylsulfoxid (DMSO)). Frys injektionsflaskorna i en frysbehållare med kontrollerad hastighet över natten innan du flyttar till förvaring i flytande kväve. - Placera det koniska röret i en 37 °C bänkinkubator vid 180 rpm tills vävnaden blir trådig och kollagenaslösningen blir grumlig. Till exempel tar en stor vävnadsmassa (cirka 500-800 mg) från en tumör 30-60 min. En mindre vävnadsmassa (cirka 100-300 mg) från bröstfettkuddar av vildtyp tar cirka 20-30 minuter. Om du är osäker, kontrollera med 5 minuters intervall.
- Efter inkubation, centrifugera det koniska röret i 10 minuter vid 550 x g vid rumstemperatur (RT).
- Aspirera försiktigt supernatanten från det koniska röret.
OBS: Framåt, förbelägga alla pipettspetsar, serologiska pipetter och koniska rör med BSA-lösning för att undvika förlust av organoider på grund av vidhäftning till plast. - Tillsätt 8 ml basalcellsmedia och 80 μL DNas-lösning [2 E/μL] till röret. Vänd försiktigt i 1-3 min.
- Tillsätt 12 ml basalcellsmedia till röret och blanda försiktigt genom pipettering eller rotera röret försiktigt 15 gånger för att blanda.
- Centrifugera i 10 minuter vid 550 x g vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och suspendera sedan pelleten i 12 ml basalcellsmedia.
- Låt de tyngsta vävnadsfragmenten sätta sig i botten. Samla upp supernatanten med en serologisk pipett och överför till ett 15 ml koniskt rör. Denna suspension innehåller epitelorganoider och stroma-/immunceller.
- Mänsklig bröstvävnad
- Bearbeta de mänskliga bröstvävnadsproverna för organoider eller förvara dem inom 24 timmar efter insamling. Förvara proverna vid 4 °C iCO2-oberoende media med 1% 100x antibiotika-antimykotisk.
- Överför vävnaden till en vävnadsodlingsplatta. Luta plattan och aspirera överflödigt lagringsmedium och skölj sedan vävnaden med 5 ml amfotericin B-tvätt. Ta bort amfotericin B-tvätten omedelbart.
- Finhacka vävnadsprovet med en skalpell #10 eller #11 för att lossa vävnaden tills den når en pastaliknande konsistens. Överför den malet vävnaden till ett koniskt rör innehållande 10-30 ml kollagenaslösning med en skalpell. För att säkerställa att all vävnad samlas upp, pipettera 1 ml kollagenaslösning på vävnadsodlingsplattan och återgå till det koniska röret.
OBS: För att producera större organoider bör mekanisk matsmältning minimeras och lämna några små synliga bitar av vävnad intakta. Startvävnadsmassa för detta protokoll varierade mellan 100-250 mg. Alternativt kan vävnad förvaras fryst för senare organoidberedning med minimal förlust av livskraft efter steg 4.2.2 i 90% FBS + 10% DMSO enligt ovan. - Placera det koniska röret i en 37 °C bänkskiva skaka inkubator vid 180 rpm tills vävnaden blir mindre och kollagenas blir grumligt. Kontrollera vävnaden med 5 minuters intervall. Kollagenasdissociation av humana prover tar ungefär 5-20 min.
- Efter inkubation, snurra ner det koniska röret i 10 minuter vid 550 x g vid rumstemperatur.
- Aspirera försiktigt supernatanten från det koniska röret.
OBS: Framåt, förbelägga alla pipettspetsar, serologiska pipetter och koniska rör med BSA-lösning för att undvika förlust av organoider på grund av vidhäftning till plast. - Tillsätt 4 ml basalcellsmedia och 40 μl DNase-lösning [2 E/μL] till det koniska röret. Vänd försiktigt i 3 min.
- Tillsätt 6 ml basalcellsmedia till röret och blanda försiktigt genom pipettering eller rotera försiktigt det koniska röret 15 gånger för att blanda.
- Centrifugera i 10 minuter vid 550 x g vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och suspendera sedan pelleten i 10 ml basalcellsmedia.
- Låt de tyngsta vävnadsfragmenten sätta sig i botten. Samla upp supernatanten och överför den till ett 15 ml koniskt rör. Denna suspension innehåller epitelorganoider och stroma-/immunceller.
5. Differentiell centrifugering
- Puls till 550 x g i 3-4 s vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml basalcellsmedia. Upprepa detta steg ytterligare tre gånger (totalt fyra snurr).
- Efter varje centrifugering, se till att pelleten blir alltmer ogenomskinlig. Denna återstående pellet kommer att vara epitelorganoider.
6. Samla små organoider
- Puls till 80-100 x g i 3 s vid RT. Samla supernatanten i ett nytt BSA-belagt rör och pulsa sedan till 550 x g i 3 s vid RT för att pellet de små organoiderna.
7. Inbäddning av organoider i BECM
- Alikvot lämplig suspension av organoider i mikrocentrifugrör i enlighet med organoiddensiteten i förhållande till mängden BECM per brunn (tabell 1). Använd till exempel 50-100 organoider för 20 μL BECM i en brunn på en 96-brunnsplatta.
OBS: Organoiddensiteten kan räknas med följande formel: ((Genomsnittligt antal organoider)/50 μL) x utspädningsfaktor. - Utför alla steg på is. Placera den tinade BECM på is i en vävnadsodlingshuva. När du förbereder huven, placera alla pipettspetsar på is för att svalna.
- Centrifugera mikrocentrifugrören i 10 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur. Kassera supernatanten från rören. Flytta rören med organoidpellets till is och tillsätt lämplig volym BECM till varje mikrocentrifugrör (tabell 1).
OBS: Eftersom BECM är viskös, lägg till ytterligare volymer (cirka 10% -20% extra av kupolvolymen) av BECM för att ta hänsyn till förlusten i pipetspetsen. - Pipettera försiktigt upp och ner för att återsuspendera organoiderna i BECM, var försiktig så att du inte producerar bubblor.
- Pipettera långsamt och försiktigt de BECM-suspenderade organoiderna på pläteringsytan. Under pipettering, ta långsamt upp pipetten för att skapa en kupol. Fyll alla tomma brunnar med PBS för att bibehålla fuktigheten.
- Placera plattan i en 37 °C inkubator i 1 timme så att BECM stelnar och täck sedan med lämplig volym media (tabell 1).
8. Bädda in organoider i kollagen
- Utför alla steg på is. Bered kollagenlösningen genom att i sekventiell ordning kombinera 375 μL 10x DMEM, 100 μL 1 N natriumhydroxid (NaOH) och 3 ml råttsvanskollagen I-lösning i ett 15 ml koniskt rör. Pipettblandning, var försiktig så att du inte gör bubblor. Titrera lösningen till ett pH på 7,2-7,4 med små mängder (steg om 1-3 μl) NaOH eller 10x DMEM efter behov.
- Belägg botten av brunnarna med den minsta mängd kollagen som krävs för att helt täcka brunnens botten. Ett tillvägagångssätt är att placera en liten mängd kollagen och gunga plattan från sida till sida för att täcka. Låt kollagenunderlagen stelna till 37 °C i 30 min-2 timmar.
- Alikvot lämplig suspension av organoider i mikrocentrifugrör i enlighet med organoiddensiteten i förhållande till mängden kollagen per brunn (tabell 1). Placera i en 37 °C inkubator.
- Förvara kollagenlösningen vid 4 °C och övervaka polymerisationen genom att kontrollera fiberbildning under ett mikroskop var 10:e minut. Kollagen kommer att nå lämplig polymerisation mellan 30 min-2 h.
OBS: Korrekt polymerisation kan bestämmas genom närvaron av fibrer som förgrenar sig genom matrisen. Fortsätt omedelbart till steg 8.5 när några fibrer har observerats i synfältet. - Centrifugera mikrocentrifugrören vid 300 x g i 10 minuter vid RT. Kassera supernatanten från rören. Flytta organoidpelletsen till is och tillsätt lämplig volym kollagen till varje mikrocentrifugrör (tabell 1).
OBS: Eftersom kollagen är visköst, tillsätt ytterligare volymer (cirka 10% -20% extra av kupolvolymen) kollagen för att ta hänsyn till förlusten i pipetspetsen. - Pipettera försiktigt upp och ner för att återsuspendera organoider i kollagen, var försiktig så att du inte producerar bubblor.
- Pipettera långsamt och försiktigt de kollagensuspenderade organoiderna på pläteringsytan. Under pipettering, ta långsamt upp pipetten för att skapa en kupol. Fyll alla tomma brunnar med PBS för att bibehålla fuktigheten.
- Placera plattan i en 37 °C inkubator i 1 timme så att kollagenet stelnar och täck sedan med lämplig volym media (tabell 1).
- OBS: Organoider bibehåller livskraften i 3D-matris i upp till 7 dagar. Om bilddiagnostik används för analys, fortsätt till steg 9 och 10.
9. Fixering av inbäddade organoider
- Använd en pipett för att ta bort alla medier från brunnarna utan att komma i kontakt med ECM-kupoler.
- Fixera med 4% paraformaldehyd (PFA)/PBS lösning i 5 min.
- Tvätta två till tre gånger genom att applicera PBS på brunnar efter att ha placerat dem på en långsamt rörlig shaker. Efter tvätt, applicera färsk PBS på kupolerna och förvara plattan vid 4 °C.
10. Immunofluorescerande färgning av inbäddade organoider
- Förbereda lösningar för immunofluorescerande färgning
- Permeabiliseringsbuffert: Förbered en PBS-lösning med 10% Triton X-100.
- Blockerande buffert: Förbered en PBS-lösning med 10% FBS och 0,2% Triton X-100.
- Antikroppsutspädningsbuffert: Förbered en PBS-lösning med 2% FBS och 0,2% Triton X-100.
- Permeabilisering och blockering
- Pipettera tillräckligt med permeabiliseringsbuffert för att täcka ECM-kupolerna. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i en långsamt rörlig skakapparat.
- Ta bort permeabiliseringsbufferten med en pipett och applicera samma volym blockerande buffert i 3 timmar.
- Primär antikroppsinkubation
- Ta bort blockeringsbufferten med pipett och applicera antikroppsutspädningsbufferten som innehåller den primära antikroppen i koncentrationer som anges av tillverkaren. Inkubera provet vid 4 °C i 12–16 timmar i en långsamt rörlig skakapparat.
- Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta proverna tre gånger i 10 minuter med PBS vid RT på en långsamt rörlig shaker.
- Sekundär antikroppsinkubation och nukleär fläck
- Aspirera återstående PBS-tvätt och applicera antikroppsutspädningsbufferten innehållande sekundär antikropp vid tillverkarspecificerade koncentrationer. Lägg dessutom till DAPI eller Hoechst (för att märka kärnor) eller falloidin (för att märka aktin) till bufferten i förhållandet 1:250. Inkubera i 2-4 timmar vid rumstemperatur på en långsamt rörlig skakapparat.
- Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta proverna tre gånger i 10 minuter i PBS vid RT på en shaker. Förvara proverna i PBS vid 4 °C tills de avbildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilderna i figur 1 ger ett exempel på vildtyp och tumörösa bröstepitelorganoider från mänskliga vävnader och musvävnader. En översiktlig illustration av metoden för att isolera epitelorganoider genom differentiell centrifugering finns i det tecknade arbetsflödet i figur 1A, som visar att primära vävnader från olika arter kan bearbetas på nästan identiska sätt samtidigt som epitelvävnad erhålls, vilket visas i ljusfältsbilderna (figur 1B ). Vidare kan dessa likheter mellan artvävnadskompositioner ses i de immunofluorescerande bilderna av inbäddade organoider i antingen extracellulär matris eller kollagen i källaren som visas i figur 2A-D. Den organoida strukturen kan visualiseras genom antingen membran Tomat (mTomat)-märkning eller falloidinfärgning av aktin. Dessa figurer visar också den förväntade organoidkompositionen och storleken med hjälp av denna metod. Organoider inbäddade i kollagenmatris kan användas för en invasionsanalys och analyseras genom att spåra expansionen av tendrils som förgrenar sig från själva organoiden, vilket ses i figur 2C. Slutligen visar hematoxylin och eosin (H &E) färgning av paraffininbäddade organoider att organoider upprätthåller samma histologi för bröstcancer (figur 2E).
Figur 1: Arbetsflöde för epitelorganoidgenerering med exempel organoider . (A) Schema för arbetsflöde för organoidgenerering från mus eller mänsklig vävnad utan passaging. (B) Representativa bilder av isolerade epitelorganoider från WT-bröstkörtlar hos mus, musbrösttumörer och humana brösttumörer i media efter isolering. Varje bild justerades individuellt för ljusstyrka och kontrast för förbättrad visualisering. Bilder togs i ljusfält på ett inverterat epifluorescerande mikroskop vid 10x förstoring. Skalstapeln representerar 20 μm. Brösttumörer isolerades från MMTV-PyMT-möss; normal bröstvävnad isolerades från FVB-möss. Möss varierade från 8-14 veckors ålder29. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Avbildning av organoider i den extracellulära matrisen. Varje bild justerades individuellt för ljusstyrka och kontrast för förbättrad visualisering för den här samlingen. Före avbildning fixerades prover med 4% paraformaldehyd. Vildtypprover färgades med falloidin 568 för att visualisera cellmembranet och alla prover färgades med Hoechst för att visualisera kärnor, vilket visar organoidmorfologi och densitet. Bilderna togs med 10x förstoring på ett konfokalmikroskop och förstorades ytterligare med en skanningszoom på 3,003. Laservåglängden som användes för att detektera DAPI var 405 nm med en effekt på 5 och laservåglängden som användes för att detektera falloidin var 561,0 nm för kanal 3 med en effekt på 0,5. Konfokal hålstorlek bibehölls på 19.16 för alla bilder. (A) Representativ ljusfältsbild av musbröst WT-organoid inbäddad i BECM vid dag 0. (A') 1:250 Hoechst märkning kärnor och (A'') 1:250 falloidin märkning aktin immunofluorescerande bilder av A. Skala bar representerar 20 μm. Normal bröstvävnad isolerades från FVB-möss. Möss varierade från 8-12 veckors ålder. (B) Representativ ljusfältsbild av musbrösttumörorganoid inbäddad i BECM vid dag 0. (B') 1:250 Hoechst märkning kärnor och (B'') mTomat-märkt immunofluorescerande bild av B. Skala bar representerar 20 μm. Brösttumörer isolerades från MMTV-PyMT-möss. Möss varierade från 12-14 veckors ålder. (C) Representativ ljusfältsbild av musbrösttumörorganoid inbäddad i kollagen I vid dag 3. Bilden representerar en organoid som visar "invasiv" egenskap. (C') 1:250 Hoechst märkning kärnor och (C') mTomat-märkt immunofluorescerande bild av C. Skala bar representerar 20 μm. Brösttumörer isolerades från MMTV-PyMT-möss. Möss varierade från 12-14 veckors ålder. (D) Representativ ljusfältsbild av human brösttumörorganoid inbäddad i BECM vid dag 0. (D') Hoechst märkning kärnor och (D'') 1:250 Actin-riktad falloidinmärkt immunofluorescerande bild av D. Skalstapeln representerar 20 μm. (E) Snittbild av en organoid inbäddad i BECM och färgad med H&E tagen vid 20x förstoring. Skalstapeln representerar 20 μm. H&E-färgning utfördes av University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource30. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Kultur tallrik | ECM kupol Volym | Rekommenderat antal organoider | Medievolym |
| 6-brunns tallrik | 200 μL | 300 | 3 ml |
| 12-brunns tallrik | 150 μL | 225 | 2 ml |
| 24-brunns tallrik | 100 μL | 150 | 1 ml |
| 48-brunns tallrik | 40 μL | 60 | 300 μL |
| 96-brunns tallrik | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tabell 1: Rekommenderad volym ECM-komponenter för kupoler, densitet av organoider och volym media som behövs per brunn på olika odlingsplattor.
| Problem | Potentiell orsak | Lösning | |||
| ECM-kupoler har kollapsat. | Plattan skakades, ECM-volymen var för stor för att kupolformen skulle kunna upprätthållas, eller kupolerna rörde vid brunnens kant och fick dem att fastna och falla. | Undvik att flytta plattan för kraftigt innan kupolerna har stelnat, minska volymen ECM som används för resuspension av organoider eller var mycket försiktig med att pipettera kupolerna i mitten av plattan. | |||
| Det finns vävnad som inte ser ut som organoider. | Muskelvävnad eller nerv kan ha samlats in i processen att skörda bröstfettkudden. | Skär bara bort det som helt klart är en bröstfettkudde. Undvik att ta bort vävnaden som fästs tätt på huden. | |||
| Det finns många döda organoider. | Nekrotisk tumörvävnad skördades. | Undvik att samla vävnaden från tumörer som är nekrotiska, cystiska, alltför mjuka eller mörkare i färg. Tumörvävnad bör vara fast. | |||
| Det finns fler enskilda celler än organoider. | Vävnaden hackades för fint, eller kollagenassmältningen kördes för länge. | Undvik att överhacka vävnaden eller minska kollagenasinkubationstiden. | |||
| Det finns bubblor i ECM. | Resuspension genom pipettering var för kraftig och utkastningen under pipettering av kupoler var för snabb. | Resuspendera långsamt organoiderna i ECM och pipettera dem långsamt till kupoler. Om problemet kvarstår, undvik att gå till det andra stoppet medan pipettering. | |||
| Det finns ingen invasion av organoider inom kollagen. | Kollagen var inte korrekt polymeriserat eller överpolymeriserat. | Resuspendera inte organoiden i kollagen förrän den är korrekt polymeriserad. Kontrollera var 30:e minut. Om ingen polymerisation är synlig, resuspendera omedelbart vid 2-timmarsmärket och plattan. | |||
| Det finns inga kollagenfibrer synliga när man tittar på polymerisation. | Mikroskopinställningarna var inte gynnsamma. | Justera faskontrasten för maximalt mörker och ta sedan mikroskopets ljusstyrka hela vägen upp. Dessutom kan ökad förstoring förbättra visningen. | |||
| ECM-kupoler har lösts upp. | Fixeringstiden var för lång, eller PFA avlägsnades inte grundligt från de ECM-inbäddade proverna. | Håll fixeringen av ECM-kupoler under 5 min och följ upp med fem tvättar på en roterande skakapparat i 5 minuter vardera. | |||
Tabell 2: Tabell över potentiella problem, orsaker och lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika metoder har beskrivits i litteraturen för att generera tumörorganoider. Detta protokoll belyser en metod för att generera tumörorganoider direkt från tumören utan att passera. Med hjälp av denna metod produceras tumörorganoider inom några timmar efter att proceduren initierats och genererar nära 100% livskraftiga organoider jämfört med 70% som rapporterats i litteraturen31. I jämförelse kräver andra metoder seriell passaging av celler i organoider under flera veckor. Således blir nedströmsapplikationerna, såsom att bestämma och visualisera immuncellsinteraktioner med matchade organoid- och immunprover från samma värd utan påverkan av långsiktig odling, mer genomförbara. Vidare, som framhävs i figur 2C, kan inbäddning av tumörorganoider i olika extracellulära matriser möjliggöra identifiering av viktiga fenotyper i hela metastaseringskaskaden, såsom invasion av den primära tumören. Andra nedströmsapplikationer inkluderar fenotypiska analyser av förgreningsmorfogenes32, invasion, spridning och kolonibildning33 för att bedöma olika epitelcellbeteenden. Immuninteraktioner kan också fångas funktionellt och visuellt med dessa organoidbaserade analyser. Vidare kan geler lösas för att isolera inbäddade celler för nedströmsanalys av genetiskt och proteininnehåll med hjälp av standard biokemiska och flödesbaserade analyser. Slutligen, eftersom stora mängder organoider snabbt kan genereras från tumörvävnad, kan dessa analyser skalas för läkemedelsscreeningapplikationer och integration i arbetsflöden för kliniska prövningar.
Det finns flera viktiga steg som är kritiska för detta protokoll. För det första är den tid som krävs för kollagenasuppslutning beroende av vävnadssammansättningen och mängden vävnad som smälts. Till exempel, när man arbetar med mindre bitar av vävnad, såsom kirurgiska prover av mänsklig brösttumör (i genomsnitt 100-250 mg), krävs en kortare tid av matsmältning. Brösttumörer skördade från en mus är emellertid mycket större i storlek (500-800 mg) och kan kräva 30-60 min enzymatisk matsmältning. För det andra, för att säkerställa ett maximalt utbyte av epitelorganoider, är det också viktigt att belägga alla pipettspetsar och serologiska pipetter med BSA för att undvika förlust från celladhesion till plast. För det tredje är en kort differentiell centrifugeringstid avgörande för att eliminera icke-epitelvävnadskomponenter. Detta tillvägagångssätt tillåter tyngre epitelorganoider att pelletera medan lättare stroma- och immunkompartment förblir i supernatanten. För att skapa invasionsanalyser genom att bädda in organoider i kollagen är det viktigt att möjliggöra korrekt polymerisation av kollagenet innan inbäddning av organoider. Detta steg bör kontrolleras visuellt genom att bekräfta kollagenfiberbildning under ett ljusmikroskop. Slutligen, för bästa bildresultat, var noga med att undvika att producera bubblor vid resuspendering av organoider i ECM och plätering. Bubblor kommer att dölja organoider i gelén och förvränga bilder. I tabell 2 förtecknas potentiella problem som har uppstått och lösningar för att övervinna dessa utmaningar.
Vissa steg i protokollet tillåter ändringar för att anpassa storleken på genererade organoider eller minska den tid som krävs för att utföra protokollet. Till exempel kan ökad varaktighet av mekanisk matsmältningstid resultera i en kortare kollagenasuppslutningstid, mindre organoider och fler enskilda celler. Centrifugering efter kollagenasuppslutning kan förkortas till 5 minuter om man arbetar med en stor mängd tumörvävnad. Media som används för odling och odling av organoider kan beredas en dag före för att spara tid under de organoidgenererande stegen. På liknande sätt kan tumörvävnad lagras i upp till 24 timmar i lämpliga medier före organoidberedning. Om tiden är extremt begränsad inkluderar detta protokoll paussteg genom att frysa tumörvävnad på insamlingsdagen. Sedan kan dessa frysta vävnader användas för att generera livskraftiga organoider vid ett senare tillfälle. Cirka 90% av organoiderna härrörande från den frysta vävnaden var livskraftiga, bekräftade visuellt under ett ljusmikroskop och med en trypanblå lösning.
Det finns vissa begränsningar för detta protokoll. Medan detta tillvägagångssätt genererar livskraftiga organoider snabbt, begränsas mängden organoider som genereras av mängden tumörvävnad. Denna begränsning blir särskilt tydlig när man arbetar med kliniska prover där mängden tumörvävnad är mindre eller ibland till och med begränsad till några celler. I de extrema fall där endast ett fåtal celler kan återvinnas som utgångsmaterial kan passaging vara ett bättre alternativ. En annan begränsning är den reduktionistiska metoden för denna metod. Avlägsnande av stromadelar såsom fibroblaster eller endotelceller berikar epitelial organoidgenerering. Dessa cellpopulationer är emellertid avgörande för tumörens funktion. Därför begränsar deras borttagning tolkningen av tumörbiologi som enbart härrör från epitelorganoidmodeller. Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett tillvägagångssätt för snabb generering av epitelorganoider för omedelbar användning i nedströms avbildning, funktionella (inklusive immuninteraktioner) och läkemedelsscreeningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av finansiering från METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation och NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi erkänner hjälpen från University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delad resurs vid Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvis stöds av National Cancer Institute under tilldelningsnummer P30 CA142543. Särskilt tack till alla medlemmar i Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
