Summary
Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l'imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.
Abstract
Gli organoidi sono un metodo affidabile per modellare il tessuto degli organi grazie alle loro proprietà auto-organizzanti e alla conservazione della funzione e dell'architettura dopo la propagazione dal tessuto primario o dalle cellule staminali. Questo metodo di generazione di organoidi rinuncia alla differenziazione di singole cellule attraverso passaggi multipli e utilizza invece la centrifugazione differenziale per isolare organoidi epiteliali mammari da tessuti dissociati meccanicamente ed enzimaticamente. Questo protocollo fornisce una tecnica semplificata per produrre rapidamente organoidi epiteliali piccoli e grandi sia dal tessuto mammario di topo che da quello umano, oltre alle tecniche per l'incorporazione di organoidi nel collagene e nella matrice extracellulare basale. Inoltre, vengono fornite istruzioni per la fissazione in gel e la colorazione immunofluorescente allo scopo di visualizzare la morfologia e la densità degli organoidi. Queste metodologie sono adatte per una miriade di analisi a valle, come la co-coltura con cellule immunitarie e la modellazione di metastasi ex vivo tramite il saggio di invasione del collagene. Queste analisi servono a chiarire meglio il comportamento cellula-cellula e creare una comprensione più completa delle interazioni all'interno del microambiente tumorale.
Introduction
La capacità di modellare le cellule epiteliali in vitro è stata il fondamento della moderna ricerca biomedica perché cattura caratteristiche cellulari che non sono accessibili in vivo. Ad esempio, la crescita di linee cellulari epiteliali in un piano bidimensionale può fornire una valutazione dei cambiamenti molecolari che si verificano in una cellula epiteliale durante la proliferazione1. Inoltre, la misurazione della regolazione dinamica tra segnalazione ed espressione genica è limitata nei sistemi in vivo 2. Nella ricerca sul cancro, la modellazione della linea cellulare epiteliale del cancro ha permesso l'identificazione dei driver molecolari della progressione della malattia e dei potenziali bersagli farmacologici3. Tuttavia, la crescita di linee cellulari epiteliali tumorali su un piano bidimensionale ha dei limiti, poiché la maggior parte sono geneticamente immortalate e modificate, spesso di natura clonale, selezionate per la loro capacità di crescere in condizioni non fisiologiche, limitate nella loro valutazione dell'architettura tridimensionale (3D) del tessuto tumorale e non modellano adeguatamente le interazioni del microambiente all'interno di un ambiente tissutale realistico4. Questi vincoli sono particolarmente evidenti nella modellazione delle metastasi, che in vivo include diverse fasi biologiche distinte, tra cui invasione, disseminazione, circolazione e colonizzazione nel sito dell'organo distante5.
Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per ricapitolare meglio l'ambiente 3D e il comportamento dei tumori 6,7,8. Gli organoidi sono stati inizialmente sviluppati da singole cellule della cripta intestinale LRG5+ e differenziati per rappresentare la struttura 3D delle unità crypt-villus che hanno mantenuto la struttura gerarchica dell'intestino tenue in vitro9. Questo approccio ha permesso la visualizzazione in tempo reale e la caratterizzazione dell'architettura tissutale auto-organizzante in condizioni omeostatiche e di stress. Come estensione naturale, gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per modellare molti diversi tipi di cancro, tra cui colorettale 10, pancreatico 11, seno12, fegato 13, polmone 14, cervello 15 e tumori gastrici 16. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sfruttati per caratterizzare l'evoluzione del cancro17,18 e i comportamenti spazio-temporali metastatici 19,20 e interrogare l'eterogeneità tumorale 21 e testare le chemioterapie 22. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati anche isolati e raccolti durante gli studi clinici in corso per prevedere la risposta del paziente agli agenti antitumorali e alla radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Inoltre, i sistemi che incorporano organoidi epiteliali tumorali possono essere combinati con altre cellule non tumorali, come le cellule immunitarie, per formare un modello più completo del microambiente tumorale per visualizzare le interazioni in tempo reale, scoprire come le cellule epiteliali tumorali cambiano la natura fondamentale delle cellule immunitarie effettrici citotossiche come le cellule natural killer e testare potenziali immunoterapie e attività citotossica anticorpo-farmaco dipendente26, 27,28. Questo articolo dimostra un metodo per generare organoidi epiteliali senza passare e incorporare nel collagene e nella matrice extracellulare basale (ECM). Inoltre, vengono condivise anche tecniche per l'imaging a valle di organoidi isolati.
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Protocol
Tutti i tessuti di topo utilizzati in questo manoscritto sono stati raccolti eticamente in conformità con i regolamenti e le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas Southwestern Medical Center. Allo stesso modo, tutti i pazienti hanno acconsentito prima della donazione di tessuti sotto la supervisione di un Institutional Review Board (IRB) e i campioni sono stati deidentificati.
NOTA: Questo protocollo descrive la generazione di organoidi dal tessuto primario.
1. Preparazione notturna dei materiali
- Per l'incorporazione nella matrice extracellulare basale (BECM), scongelare l'aliquota BECM lasciandola a 4 °C.
2. Preparazione della soluzione di rivestimento di collagenasi e albumina sierica bovina (BSA)
- Preparare una soluzione di rivestimento BSA/PBS al 2,64% (soluzione BSA): filtro sterile 50 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e 4,10 ml di soluzione BSA al 30% utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Questa soluzione BSA può essere filtrata e riutilizzata.
- Preparare la soluzione di collagenasi per il tessuto mammario del topo: filtro sterile 27 mL di terreno basocellulare, 1,5 mL di siero fetale bovino (FBS), 30 μL di 50 mg/mL di gentamicina, 15 μL di 10 mg/mL di insulina, 600 μL di 0,1 g/mL di collagenasi A e 600 μL di 0,1 g/mL di tripsina utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Allocare tra 10 ml e 30 ml di soluzione di collagenasi per topo, a seconda della massa tissutale.
- Preparare la soluzione di collagenasi per il tessuto mammario umano: filtro sterile 18 mL di RPMI-1640, 200 μL di soluzione 100x di penicillina-streptomicina (penna/streptococco), 200 μL di 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) tampone, 1 mL di FBS e 400 μL di 0,1 g/mL di collagenasi A utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Allocare tra 10 ml e 20 ml per campione di tessuto, a seconda della massa tissutale.
3. Preparazione dei supporti
- Preparare i mezzi organoidi: mezzo filtrante a cellule basali sterili con penna/streptococco all'1% e insulina-transferrina-selenio (ITS) all'1% utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Per produrre un fattore di crescita organoide, aggiungere il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) a una concentrazione finale di 2,5 nM.
- Preparare i mezzi epiteliali mammari: per produrre 100 ml di mezzi epiteliali mammari, filtro sterile mezzo basale comune ad alto contenuto di glucosio con 1 ml di integratore di glutammina 100x, 1 ml di penna/streptococco, 1 ml di tampone HEPES da 10 mM (7,3 pH), 250 μL di 30% di stock di BSA, 1 μL di 1 mg/mL di stock di tossine colerarie, 1 mL di 50 μg/mL di stock di idrocortisone in PBS, 50 μL di soluzione insulinica umana da 10 mg/ml, 10 μL di 50 μg/mL di fattore di crescita epidermico (EGF) e 1% FBS utilizzando un matraccio filtrante da 150 ml/0,2 μm. Conservare il supporto a 4 °C e utilizzarlo per un massimo di 2 settimane.
- Preparare il lavaggio con amfotericina: filtro sterile PBS con penna/streptococco al 2% e amfotericina B al 2%. Conservare a 4 °C.
4. Raccolta e digestione dei tessuti
- Tessuto mammario del topo
- Eutanasia del topo mettendo in una camera CO 2 per2-5 minuti, e poi seguire con la lussazione cervicale. Con il lato ventrale rivolto verso l'alto, allargare gli arti del topo e utilizzare quattro aghi da 19 G per fissare il topo per le zampe a una tavola coperta da un cuscinetto assorbente. Spruzzare con etanolo al 70% per levigare il pelo e igienizzare la pelle. Pulire le feci con una garza o un fazzoletto.
- A partire appena sopra la regione anogenitale, tagliare verso l'alto dalla linea mediana usando le forbici chirurgiche, facendo attenzione a non perforare il peritoneo. Dopo aver raggiunto il mento, effettuare tagli laterali su entrambe le clavicole e le zampe posteriori e appuntare la pelle del topo tesa alla tavola per esporre i cuscinetti di grasso mammario.
- Localizzare i cuscinetti di grasso mammario inguinale su topi selvatici identificando il linfonodo inguinale situato vicino agli arti posteriori. Localizzare i cuscinetti di grasso mammario toracico su topi selvatici come il tessuto più spesso e vascolarizzato sotto gli arti anteriori.
- Utilizzare una pinza per elevare il cuscinetto di grasso mammario. Evitare di raccogliere il muscolo sottostante. Usando l'estremità smussata delle forbici affilate, crea una tasca sotto il cuscinetto di grasso mammario, lontano dalla pelle. Tagliare via il cuscinetto di grasso mammario in un unico pezzo.
- Una volta rimossi i cuscinetti di grasso mammario, sciacquare in PBS prima di metterli in un piatto di coltura di tessuto sterile. Trasferire rapidamente a una cappa di coltura tissutale.
NOTA: Per i tumori mammari, utilizzare un batuffolo di cotone bagnato con PBS per far rotolare delicatamente il tumore lontano dalla pelle. Assicurati di evitare aree scure o morbide, poiché lo scolorimento scuro indica necrosi, che non produrrà organoidi sani. - Tritare i tumori mammari con un bisturi # 10 o # 11 per allentare il tessuto fino a raggiungere una consistenza pastosa. Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico contenente 10-30 ml di soluzione di collagenasi usando un bisturi. Per garantire che tutto il tessuto venga raccolto, pipettare 1 mL di soluzione di collagenasi sulla piastra di coltura tissutale e di nuovo nel tubo conico.
NOTA: Per produrre organoidi più grandi, la digestione meccanica dovrebbe essere ridotta al minimo, lasciando intatti alcuni piccoli pezzi visibili di tessuto. In alternativa, il tessuto può essere conservato congelato per una successiva preparazione di organoidi con una perdita minima di vitalità. Per fare ciò, lavare il tessuto in una soluzione di PBS o media cellulare basale + 1% FBS, quindi tritare grossolanamente per aumentare la superficie (mantenendo il tessuto in uno o due pezzi solidi). Spostare il tessuto in una criofiala, coprire con mezzi di congelamento (90% FBS + 10% dimetil solfossido (DMSO)). Congelare i flaconcini in un contenitore di congelamento a velocità controllata per una notte prima di passare allo stoccaggio in azoto liquido. - Posizionare il tubo conico in un'incubatrice da banco a 37 °C a 180 RPM fino a quando il tessuto diventa stopposo e la soluzione di collagenasi diventa torbida. Ad esempio, una grande massa tissutale (circa 500-800 mg) da un tumore richiede 30-60 minuti. Una massa tissutale più piccola (circa 100-300 mg) da cuscinetti di grasso mammario selvatico richiede circa 20-30 minuti. In caso di dubbi, controllare a intervalli di 5 minuti.
- Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo conico per 10 minuti a 550 x g a temperatura ambiente (RT).
- Aspirare con attenzione il surnatante dal tubo conico.
NOTA: Andando avanti, pre-rivestire tutte le punte delle pipette, i pipelli sierologici e i tubi conici con la soluzione BSA per evitare la perdita di organoidi dovuta all'adesione alla plastica. - Aggiungere 8 mL di mezzo basocellulare e 80 μL di soluzione di DNasi [2 U/μL] al tubo. Capovolgere delicatamente per 1-3 minuti.
- Aggiungere 12 mL di media cellulare basale al tubo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio o ruotare delicatamente il tubo 15 volte per miscelare.
- Centrifugare per 10 minuti a 550 x g a RT.
- Aspirare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 12 ml di media basocellulare.
- Lascia che i frammenti di tessuto più pesanti si depositino sul fondo. Raccogliere il surnatante con un pipet sierologico e trasferirlo in un tubo conico da 15 ml. Questa sospensione contiene organoidi epiteliali e cellule stromali/immunitarie.
- Tessuto mammario umano
- Elaborare i campioni di tessuto mammario umano per organoidi o conservarli entro 24 ore dalla raccolta. Conservare i campioni a 4 °C in terreni CO2-indipendenti con antibiotico-antimicotico 100x all'1%.
- Trasferire il tessuto in una piastra di coltura tissutale. Inclinare la piastra e aspirare il supporto di conservazione in eccesso, quindi risciacquare il fazzoletto con 5 ml di lavaggio con amfotericina B. Rimuovere immediatamente il lavaggio dell'amfotericina B.
- Tritare il campione di tessuto con un bisturi #10 o #11 per allentare il tessuto fino a raggiungere una consistenza pastosa. Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico contenente 10-30 ml di soluzione di collagenasi usando un bisturi. Per garantire che tutto il tessuto sia raccolto, pipettare 1 mL di soluzione di collagenasi sulla piastra di coltura tissutale e tornare al tubo conico.
NOTA: Per produrre organoidi più grandi, la digestione meccanica dovrebbe essere ridotta al minimo, lasciando intatti alcuni piccoli pezzi visibili di tessuto. La massa tissutale iniziale per questo protocollo variava tra 100-250 mg. In alternativa, il tessuto può essere conservato congelato per la successiva preparazione di organoidi con una minima perdita di vitalità dopo la fase 4.2.2 in 90% FBS + 10% DMSO come sopra. - Posizionare il tubo conico in un'incubatrice da banco a 37 °C a 180 giri/min fino a quando il tessuto diventa più piccolo e la collagenasi diventa torbida. Controllare il tessuto ad intervalli di 5 minuti. La dissociazione della collagenasi dei campioni umani richiede circa 5-20 minuti.
- Dopo l'incubazione, ruotare lungo il tubo conico per 10 minuti a 550 x g a RT.
- Aspirare con attenzione il surnatante dal tubo conico.
NOTA: Andando avanti, pre-rivestire tutte le punte delle pipette, i pipì sierologici e i tubi conici con soluzione BSA per evitare la perdita di organoidi dovuta all'adesione alla plastica. - Aggiungere 4 mL di mezzo basocellulare e 40 μL di soluzione di DNasi [2 U/μL] al tubo conico. Capovolgere delicatamente per 3 minuti.
- Aggiungere 6 mL di media a cellule basali al tubo e miscelare accuratamente mediante pipettaggio o ruotare delicatamente il tubo conico 15 volte per miscelare.
- Centrifugare per 10 minuti a 550 x g a RT.
- Aspirare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 10 ml di mezzi basocellulari.
- Lascia che i frammenti di tessuto più pesanti si depositino sul fondo. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un tubo conico da 15 ml. Questa sospensione contiene organoidi epiteliali e cellule stromali/immunitarie.
5. Centrifugazione differenziale
- Pulsare a 550 x g per 3-4 s a RT, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno basocellulare. Ripeti questo passaggio altre tre volte (per un totale di quattro giri).
- Dopo ogni centrifugazione, assicurarsi che il pellet diventi sempre più opaco. Questo pellet rimanente sarà organoidi epiteliali.
6. Raccolta di piccoli organoidi
- Pulsare a 80-100 x g per 3 s a RT. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco rivestito di BSA, quindi pulsare a 550 x g per 3 s a RT per pellettare i piccoli organoidi.
7. Incorporazione di organoidi in BECM
- Aliquot sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità degli organoidi rispetto alla quantità di BECM per pozzetto (tabella 1). Ad esempio, utilizzare 50-100 organoidi per 20 μL di BECM in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
NOTA: La densità degli organoidi può essere contata utilizzando la seguente formula: ((Numero medio di organoidi)/50 μL) x fattore di diluizione. - Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio. Posizionare il BECM scongelato sul ghiaccio in una cappa di coltura di tessuti. Durante la preparazione della cappa, posizionare tutte le punte delle pipette sul ghiaccio per raffreddare.
- Centrifugare le provette da microcentrifuga per 10 minuti a 300 x g a RT. Eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i tubi con pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di BECM a ciascuna provetta di microcentrifuga (Tabella 1).
NOTA: Poiché BECM è viscoso, aggiungere volumi aggiuntivi (circa il 10% -20% in più del volume della cupola) di BECM per tenere conto della perdita nella punta del pipet. - Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi in BECM, facendo attenzione a non produrre bollicine.
- Pipettare lentamente e con attenzione gli organoidi sospesi BECM sulla superficie di placcatura. Durante il pipettaggio, sollevare lentamente la pipetta per creare una cupola. Riempi tutti i pozzi vuoti con PBS per mantenere l'umidità.
- Porre la piastra in un incubatore a 37 °C per 1 ora per consentire al BECM di solidificarsi, quindi coprire con il volume appropriato di mezzo (Tabella 1).
8. Incorporazione di organoidi nel collagene
- Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio. Preparare la soluzione di collagene combinando, in ordine sequenziale, 375 μL di 10x DMEM, 100 μL di idrossido di sodio 1 N (NaOH) e 3 mL di soluzione di collagene I a coda di ratto in un tubo conico da 15 ml. Miscela di pipette, facendo attenzione a non fare bolle. Titolare la soluzione a un pH di 7,2-7,4 con piccole quantità (incrementi di 1-3 μL) di NaOH o 10x DMEM secondo necessità.
- Rivestire il fondo dei pozzetti con la quantità minima di collagene necessaria per coprire completamente il fondo del pozzo. Un approccio è quello di posizionare una piccola quantità di collagene e scuotere il piatto da un lato all'altro per rivestire. Lasciare che i sottostrati di collagene si stabilizzino a 37 °C per 30 min-2 h.
- Aliquot la sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità degli organoidi rispetto alla quantità di collagene per pozzetto (Tabella 1). Collocare in un'incubatrice a 37 °C.
- Conservare la soluzione di collagene a 4 °C e monitorare la polimerizzazione controllando la formazione di fibre al microscopio ogni 10 minuti. Il collagene raggiungerà una polimerizzazione appropriata tra 30 min-2 h.
NOTA: La corretta polimerizzazione può essere determinata dalla presenza di fibre ramificate in tutta la matrice. Procedere immediatamente al punto 8.5 una volta osservate alcune fibre nel campo visivo. - Centrifugare le provette da microcentrifuga a 300 x g per 10 minuti a RT. Eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di collagene a ciascuna provetta di microcentrifuga (Tabella 1).
NOTA: Poiché il collagene è viscoso, aggiungere ulteriori volumi (circa il 10% -20% in più del volume della cupola) di collagene per tenere conto della perdita nella punta del pipet. - Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi nel collagene, facendo attenzione a non produrre bolle.
- Pipettare lentamente e con attenzione gli organoidi sospesi al collagene sulla superficie di placcatura. Durante il pipettaggio, sollevare lentamente la pipetta per creare una cupola. Riempi tutti i pozzi vuoti con PBS per mantenere l'umidità.
- Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C per 1 ora per consentire al collagene di solidificarsi, quindi coprire con il volume appropriato di terreno (Tabella 1).
- NOTA: Gli organoidi mantengono la vitalità nella matrice 3D per un massimo di 7 giorni. Se l'imaging viene utilizzato per l'analisi, procedere ai passaggi 9 e 10.
9. Fissaggio degli organoidi incorporati
- Utilizzare una pipetta per rimuovere tutti i fluidi dai pozzetti senza entrare in contatto con le cupole ECM.
- Fissare con una soluzione di paraformaldeide (PFA)/PBS al 4% per 5 minuti.
- Lavare due o tre volte applicando PBS ai pozzetti dopo averli posizionati su uno shaker a movimento lento. Dopo i lavaggi, applicare PBS fresco sulle cupole e conservare la piastra a 4 °C.
10. Colorazione immunofluorescente di organoidi incorporati
- Preparazione di soluzioni per la colorazione immunofluorescente
- Tampone di permeabilizzazione: preparare una soluzione PBS con Triton X-100 al 10%.
- Buffer di blocco: preparare una soluzione PBS con 10% FBS e 0,2% Triton X-100.
- Tampone anticorpale: preparare una soluzione PBS con 2% FBS e 0,2% Triton X-100.
- Permeabilizzazione e blocco
- Pipetta sufficiente tampone di permeabilizzazione per coprire le cupole ECM. Incubare per 1 ora a RT su uno shaker che si muove lentamente.
- Rimuovere il tampone di permeabilizzazione con una pipetta e applicare lo stesso volume di tampone bloccante per 3 ore.
- Incubazione di anticorpi primari
- Rimuovere il tampone bloccante con una pipetta e applicare il tampone anticorpale contenente l'anticorpo primario alle concentrazioni specificate dal produttore. Incubare il campione a 4 °C per 12-16 ore su un agitatore a movimento lento.
- Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i campioni tre volte per 10 minuti con PBS a RT su uno shaker che si muove lentamente.
- Incubazione di anticorpi secondari e colorazione nucleare
- Aspirare il lavaggio PBS rimanente e applicare il tampone anticorpale contenente anticorpi secondari alle concentrazioni specificate dal produttore. Inoltre, aggiungere DAPI o Hoechst (per etichettare i nuclei) o falloidina (per etichettare l'actina) al tampone con un rapporto 1:250. Incubare per 2-4 ore a RT su uno shaker che si muove lentamente.
- Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i campioni tre volte per 10 minuti in PBS a RT su uno shaker. Conservare i campioni in PBS a 4 °C fino all'imaging.
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Representative Results
Le immagini presenti nella Figura 1 forniscono un esempio di organoidi epiteliali mammari wild-type e tumorali provenienti da tessuti umani e murini. Un'illustrazione a colpo d'occhio del metodo per isolare gli organoidi epiteliali attraverso la centrifugazione differenziale è fornita nel flusso di lavoro del fumetto nella Figura 1A, che mostra che i tessuti primari di specie diverse possono essere trattati in modi quasi identici mentre producono tessuto epiteliale come mostrato nelle immagini in campo chiaro (Figura 1B ). Inoltre, queste somiglianze di composizione tissutale interspecie possono essere viste nelle immagini immunofluorescenti di organoidi incorporati nella matrice extracellulare basale o nel collagene visualizzate nella Figura 2A-D. La struttura organoide può essere visualizzata attraverso l'etichettatura del pomodoro di membrana (mTomato) o la colorazione falloidina dell'actina. Queste cifre dimostrano anche la composizione e la dimensione degli organoidi attesi utilizzando questo metodo. Gli organoidi incorporati nella matrice di collagene possono essere utilizzati per un test di invasione e analizzati monitorando l'espansione dei viticci che si diramano dall'organoide stesso, come si vede nella Figura 2C. Infine, la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) degli organoidi incorporati in paraffina mostra che gli organoidi mantengono la stessa istologia del cancro al seno (Figura 2E).
Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di organoidi epiteliali con organoidi di esempio. (A) Schema del flusso di lavoro per la generazione di organoidi da tessuto di topo o umano senza passaggio. (B) Immagini rappresentative di organoidi epiteliali isolati da ghiandole mammarie WT di topo, tumori mammari di topo e tumori mammari umani in media dopo l'isolamento. Ogni immagine è stata regolata individualmente per la luminosità e il contrasto per una migliore visualizzazione. Le immagini sono state scattate in campo chiaro su un microscopio epi-fluorescente invertito con un ingrandimento di 10x. La barra della scala rappresenta 20 μm. I tumori mammari sono stati isolati da topi MMTV-PyMT; il tessuto mammario normale è stato isolato dai topi FVB. I topi variavano da 8 a 14 settimane di età29. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Imaging degli organoidi nella matrice extracellulare. Ogni immagine è stata regolata individualmente per la luminosità e il contrasto per una migliore visualizzazione per questa collezione. Prima dell'imaging, i campioni sono stati fissati con paraformaldeide al 4%. I campioni wild-type sono stati colorati con falloidina 568 per visualizzare la membrana cellulare e tutti i campioni sono stati colorati con Hoechst per visualizzare i nuclei, mostrando morfologia e densità organoide. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 10x su un microscopio confocale e ulteriormente ingrandite con uno zoom di scansione di 3,003. La lunghezza d'onda del laser utilizzata per rilevare DAPI era di 405 nm con una potenza di 5 e la lunghezza d'onda del laser utilizzata per rilevare la falloidina era di 561,0 nm per il canale 3 con una potenza di 0,5. La dimensione del foro stenopeico confocale è stata mantenuta a 19,16 per tutte le immagini. (A) Immagine rappresentativa in campo chiaro dell'organoide mammario WT di topo incorporato nel BECM al giorno 0. (A') 1:250 Hoechst marcando nuclei e (A'') 1:250 marcando falloidina immagini immunofluorescenti di actina di A. La barra della scala rappresenta 20 μm. Il tessuto mammario normale è stato isolato dai topi FVB. I topi avevano un'età compresa tra 8 e 12 settimane. (B) Immagine rappresentativa in campo chiaro dell'organoide del tumore mammario di topo incorporato nel BECM al giorno 0. (B') 1:250 Nuclei di marcatura Hoechst e (B'') immagine immunofluorescente marcata con pomodoro di B. La barra della scala rappresenta 20 μm. I tumori mammari sono stati isolati da topi MMTV-PyMT. I topi avevano un'età compresa tra 12 e 14 settimane. (C) Immagine rappresentativa in campo chiaro dell'organoide del tumore mammario di topo incorporato nel collagene I al giorno 3. L'immagine rappresenta un organoide che dimostra proprietà "invasive". (C') 1:250 Hoechst marcatura nuclei e (C') mImmagine immunofluorescente marcata con pomodoro di C. La barra della scala rappresenta 20 μm. I tumori mammari sono stati isolati da topi MMTV-PyMT. I topi avevano un'età compresa tra 12 e 14 settimane. (D) Immagine rappresentativa in campo chiaro dell'organoide del tumore mammario umano incorporato nel BECM al giorno 0. (') Nuclei di marcatura di Hoechst e (D'') 1:250 Immagine immunofluorescente marcata con falloidina mirata all'actina di D. La barra della scala rappresenta 20 μm. (E) Immagine sezionata di un organoide incorporato in BECM e colorato con H & E preso a ingrandimento 20x. La barra della scala rappresenta 20 μm. La colorazione H&E è stata eseguita dalla University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource30. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Piatto di coltura | Volume cupola ECM | Numero raccomandato di organoidi | Volume multimediale |
| Piastra a 6 pozzetti | 200 μL | 300 | 3 ml |
| Piastra a 12 pozzetti | 150 μL | 225 | 2 ml |
| Piastra a 24 pozzetti | 100 μL | 150 | 1 mL |
| Piastra a 48 pozzetti | 40 μL | 60 | 300 μL |
| Piastra a 96 pozzetti | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tabella 1: Volume raccomandato dei componenti ECM per le cupole, densità degli organoidi e volume di mezzi necessari per pozzetto su piastre di coltura variabili.
| Problema | Causa potenziale | Soluzione | |||
| Le cupole ECM sono crollate. | La piastra era scossa, il volume ECM era troppo grande per sostenere la forma della cupola, o le cupole toccavano il bordo del pozzo, facendole aderire e cadere. | Evitare di spostare la piastra troppo vigorosamente prima che le cupole si siano impostate, ridurre il volume di ECM utilizzato per la risospensione degli organoidi o fare molta attenzione a pipettare le cupole al centro della piastra. | |||
| C'è tessuto che non assomiglia agli organoidi. | Il tessuto muscolare o il nervo possono essere stati raccolti nel processo di raccolta del cuscinetto di grasso mammario. | Taglia via solo quello che è chiaramente un cuscinetto di grasso mammario. Evitare di rimuovere il tessuto che aderisce strettamente alla pelle. | |||
| Ci sono molti organoidi morti. | Il tessuto tumorale necrotico è stato raccolto. | Evitare di raccogliere il tessuto da tumori che sono necrotici, cistici, eccessivamente morbidi o di colore più scuro. Il tessuto tumorale dovrebbe essere solido. | |||
| Ci sono più cellule singole che organoidi. | Il tessuto è stato tritato troppo finemente o la digestione della collagenasi è stata eseguita troppo a lungo. | Evitare di macinare eccessivamente il tessuto o ridurre il tempo di incubazione della collagenasi. | |||
| Ci sono bolle in ECM. | La risospensione mediante pipettaggio era troppo vigorosa e l'espulsione durante il pipettaggio delle cupole era troppo veloce. | Risospendere lentamente gli organoidi nell'ECM e pipettarli lentamente nelle cupole. Se il problema persiste, evitare di passare alla seconda fermata durante il pipettaggio. | |||
| Non c'è invasione di organoidi all'interno del collagene. | Il collagene non è stato adeguatamente polimerizzato o sovra-polimerizzato. | Non risospendere l'organoide nel collagene fino a quando non è adeguatamente polimerizzato. Controlla ogni 30 min. Se non è visibile alcuna polimerizzazione, risospendere immediatamente al segno di 2 ore e placcare. | |||
| Non ci sono fibre di collagene visibili mentre si osserva la polimerizzazione. | Le impostazioni del microscopio non erano favorevoli. | Regolare il contrasto di fase per la massima oscurità, quindi portare la luminosità del microscopio fino in fondo. Inoltre, l'aumento dell'ingrandimento può migliorare la visualizzazione. | |||
| Le cupole ECM si sono dissolte. | Il tempo di fissazione era troppo lungo o il PFA non era stato completamente rimosso dai campioni incorporati nell'ECM. | Mantenere il tempo di fissaggio delle cupole ECM al di sotto di 5 minuti e seguire con cinque lavaggi su uno shaker rotante per 5 minuti ciascuno. | |||
Tabella 2: Tabella dei potenziali problemi, cause e soluzioni.
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Discussion
Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per generare organoidi tumorali. Questo protocollo evidenzia un metodo per generare organoidi tumorali direttamente dal tumore senza passare. Utilizzando questo metodo, gli organoidi tumorali sono producibili entro poche ore dall'inizio della procedura e generano quasi il 100% di organoidi vitali rispetto al 70% riportato in letteratura31. In confronto, altri metodi richiedono il passaggio seriale delle cellule in organoidi per diverse settimane. Pertanto, le applicazioni a valle, come la determinazione e la visualizzazione delle interazioni delle cellule immunitarie con campioni organoidi e immunitari abbinati dallo stesso ospite senza l'impatto della coltura a lungo termine, diventano più fattibili. Inoltre, come evidenziato nella Figura 2C, l'incorporazione di organoidi tumorali in diverse matrici extracellulari può consentire l'identificazione di fenotipi chiave durante la cascata metastatica, come l'invasione dal tumore primario. Altre applicazioni a valle includono saggi fenotipici di morfogenesi ramificata32, invasione, disseminazione e formazione di colonie33 per valutare vari comportamenti delle cellule epiteliali. Le interazioni immunitarie possono anche essere catturate funzionalmente e visivamente con questi saggi basati su organoidi. Inoltre, i gel possono essere sciolti per isolare le cellule incorporate per l'analisi a valle del contenuto genetico e proteico utilizzando saggi biochimici e basati sul flusso standard. Infine, poiché grandi quantità di organoidi possono essere generate rapidamente dal tessuto tumorale, questi test possono essere scalati per applicazioni di screening farmacologico e integrazione nei flussi di lavoro degli studi clinici.
Ci sono diversi passaggi chiave che sono fondamentali per questo protocollo. In primo luogo, la quantità di tempo necessaria per la digestione della collagenasi dipende dalla composizione del tessuto e dalla quantità di tessuto digerito. Ad esempio, quando si lavora con pezzi di tessuto più piccoli, come campioni chirurgici di tumore al seno umano (in media 100-250 mg), è necessario un tempo più breve di digestione. Tuttavia, i tumori mammari raccolti da un topo sono di dimensioni molto più grandi (500-800 mg) e possono richiedere 30-60 minuti di digestione enzimatica. In secondo luogo, per garantire la massima resa di organoidi epiteliali, è anche importante rivestire tutte le punte delle pipette e i pipetti sierologici con BSA per evitare la perdita dall'adesione cellulare alla plastica. In terzo luogo, un breve tempo di centrifugazione differenziale è cruciale per eliminare i componenti tissutali non epiteliali. Questo approccio consente agli organoidi epiteliali più pesanti di pelletizzarsi mentre i compartimenti stromali e immunitari più leggeri rimangono nel surnatante. Per creare saggi di invasione incorporando organoidi nel collagene, è fondamentale consentire una corretta polimerizzazione del collagene prima di incorporare gli organoidi. Questo passaggio dovrebbe essere controllato visivamente confermando la formazione di fibre di collagene al microscopio ottico. Infine, per ottenere i migliori risultati di imaging, fare attenzione a evitare di produrre bolle quando si risospendono organoidi in ECM e placcatura. Le bolle oscurano gli organoidi all'interno del gel e distorcono le immagini. La tabella 2 elenca i potenziali problemi che sono stati incontrati e le soluzioni per superare queste sfide.
Alcuni passaggi del protocollo consentono modifiche per personalizzare le dimensioni degli organoidi generati o ridurre il tempo necessario per eseguire il protocollo. Ad esempio, aumentare la durata del tempo di digestione meccanica può comportare un tempo di digestione della collagenasi più breve, organoidi più piccoli e più cellule individuali. La centrifugazione dopo la digestione della collagenasi può essere ridotta a 5 minuti se si lavora con una grande quantità di tessuto tumorale. I terreni utilizzati per la coltura e la coltivazione degli organoidi possono essere preparati un giorno prima per risparmiare tempo durante le fasi di generazione degli organoidi. Allo stesso modo, il tessuto tumorale può essere conservato fino a 24 ore in mezzi appropriati prima della preparazione organoide. Se il tempo è estremamente limitato, questo protocollo include la sospensione dei passaggi congelando il tessuto tumorale il giorno della raccolta. Quindi, questi tessuti congelati possono essere utilizzati per generare organoidi vitali in un secondo momento. Circa il 90% degli organoidi derivati dal tessuto congelato erano vitali, confermati visivamente al microscopio ottico e con una soluzione di tripano.
Ci sono alcune limitazioni a questo protocollo. Mentre questo approccio genera rapidamente organoidi vitali, la quantità di organoidi generati è limitata dalla quantità di tessuto tumorale. Questa limitazione diventa particolarmente evidente quando si lavora con campioni clinici in cui la quantità di tessuto tumorale è inferiore o, a volte, anche limitata a poche cellule. In quei casi estremi in cui solo poche cellule possono essere recuperate come materiale di partenza, il passaggio può essere un'opzione migliore. Un altro limite è l'approccio riduzionista di questo metodo. La rimozione di compartimenti stromali come fibroblasti o cellule endoteliali arricchisce la generazione di organoidi epiteliali. Tuttavia, queste popolazioni cellulari sono fondamentali per la funzione del tumore. Pertanto, la loro rimozione limita l'interpretazione della biologia tumorale che deriva esclusivamente da modelli organoidi epiteliali. In conclusione, questo protocollo fornisce un approccio per la generazione rapida di organoidi epiteliali per l'uso immediato nell'imaging a valle, applicazioni funzionali (comprese le interazioni immunitarie) e di screening farmacologico.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da finanziamenti forniti da METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation e NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Riconosciamo l'assistenza della University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, una risorsa condivisa presso il Simmons Comprehensive Cancer Center, che è supportata in parte dal National Cancer Institute con il numero di premio P30 CA142543. Un ringraziamento speciale a tutti i membri del Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
