Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64626
Automatic Translation
1,2, 2,3,4,5, 1,2, 1,2, 1,2, 6, 1,2, 2,3,4,5, 1,2,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 6Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Denne protokol diskuterer en tilgang til generering af epitelorganoider fra primær normal og tumorbrystvæv gennem differentiel centrifugering. Desuden er instruktioner inkluderet til tredimensionel dyrkning samt immunofluorescerende billeddannelse af indlejrede organoider.

Abstract

Organoider er en pålidelig metode til modellering af organvæv på grund af deres selvorganiserende egenskaber og tilbageholdelse af funktion og arkitektur efter formering fra primært væv eller stamceller. Denne metode til organoidgenerering giver afkald på enkeltcelledifferentiering gennem flere passager og bruger i stedet differentiel centrifugering til at isolere brystepitelorganoider fra mekanisk og enzymatisk dissocieret væv. Denne protokol giver en strømlinet teknik til hurtigt at producere små og store epitelorganoider fra både muse- og humant brystvæv ud over teknikker til organoidindlejring i kollagen og kælder ekstracellulær matrix. Desuden gives instruktioner til in-gel-fiksering og immunofluorescerende farvning med det formål at visualisere organoidmorfologi og densitet. Disse metoder er velegnede til utallige downstream-analyser, såsom co-kultivering med immunceller og ex vivo-metastasemodellering via kollageninvasionsassay. Disse analyser tjener til bedre at belyse celle-celleadfærd og skabe en mere fuldstændig forståelse af interaktioner inden for tumormikromiljøet.

Introduction

Evnen til at modellere epitelceller in vitro har været grundlaget for moderne biomedicinsk forskning, fordi den fanger cellulære funktioner, der ikke er tilgængelige in vivo. For eksempel kan voksende epitelcellelinjer i et todimensionelt plan give en vurdering af de molekylære ændringer, der opstår i en epitelcelle under proliferation1. Desuden er måling af den dynamiske regulering mellem signalering og genekspression begrænset i in vivo-systemer 2. I kræftforskning har kræftepitelcellelinjemodellering muliggjort identifikation af molekylære drivkræfter for sygdomsprogression og potentielle lægemiddelmål3. Imidlertid har voksende kræftepitelcellelinjer på et todimensionelt plan begrænsninger, da de fleste er genetisk udødeliggjort og modificeret, ofte klonale, udvalgt for deres evne til at vokse under ikke-fysiologiske forhold, begrænset i deres vurdering af tredimensionel (3D) tumorvævsarkitektur og ikke tilstrækkeligt modellere mikromiljøinteraktioner inden for et realistisk vævsmiljø4. Disse begrænsninger er især tydelige i modellering af metastaser, som in vivo inkluderer flere forskellige biologiske stadier, herunder invasion, spredning, cirkulation og kolonisering på det fjerne organsted5.

Cancer epitelorganoider er udviklet til bedre at rekapitulere 3D-miljøet og opførsel af tumorer 6,7,8. Organoider blev først udviklet fra enkelte LRG5+ tarmkryptceller og differentieret til at repræsentere 3D-strukturen af krypt-villus-enheder, der opretholdt tyndtarmens hierarkiske struktur in vitro9. Denne tilgang tillod visualisering og karakterisering i realtid af selvorganiserende vævsarkitektur under homeostatiske og stressforhold. Som en naturlig forlængelse blev kræftepitelorganoider udviklet til at modellere mange forskellige kræfttyper, herunder kolorektal 10, bugspytkirtel11, bryst12, lever13, lunge 14, hjerne 15 og gastrisk kræft 16. Kræftepitelorganoider er blevet udnyttet til at karakterisere kræftudvikling17,18 og metastatisk spatiotemporal adfærd 19,20 og forhøre tumorheterogenitet 21 og teste kemoterapier22. Kræftepitelorganoider er også blevet isoleret og indsamlet under igangværende kliniske forsøg for at forudsige patientens respons på kræftmidler og strålebehandling ex vivo 8,23,24,25. Desuden kan systemer, der inkorporerer kræftepitelorganoider, kombineres med andre ikke-kræftceller, såsom immunceller, for at danne en mere omfattende model af tumormikromiljøet for at visualisere interaktioner i realtid, afdække, hvordan kræftepitelceller ændrer den grundlæggende karakter af cytotoksiske effektorimmunceller såsom naturlige dræberceller og teste potentielle immunterapier og antistofafhængig cytotoksisk aktivitet26, 27,28. Denne artikel demonstrerer en metode til generering af epitelorganoider uden passage og indlejring i kollagen og kælder ekstracellulær matrix (ECM). Derudover deles teknikker til nedstrøms billeddannelse af isolerede organoider også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt musevæv, der anvendes i dette manuskript, er blevet etisk indsamlet i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) regler og retningslinjer fra University of Texas Southwestern Medical Center. Ligeledes samtykkede alle patienterne forud for vævsdonation under tilsyn af et Institutional Review Board (IRB), og prøverne blev afidentificeret.

BEMÆRK: Denne protokol beskriver dannelsen af organoider fra primært væv.

1. Forberedelse af materialer natten over

  1. Til indlejring i kælderens ekstracellulære matrix (BECM) optøes BECM-delprøven ved at lade den stå ved 4 °C.

2. Fremstilling af kollagenase og bovin serumalbumin (BSA) belægningsopløsning

  1. Forbered 2,64% BSA / PBS-belægningsopløsning (BSA-opløsning): Sterilt filter 50 ml fosfatbufret saltvand (PBS) og 4,10 ml 30% BSA-opløsning ved hjælp af en 50 ml / 0,2 μm filterkolbe. Denne BSA-opløsning kan filtreres og bruges igen.
  2. Forbered kollaganaseopløsning til musebrystvæv: Sterilt filter 27 ml basalcellemedium, 1,5 ml føtalt bovint serum (FBS), 30 μL 50 mg / ml gentamicin, 15 μL 10 mg / ml insulin, 600 μL 0,1 g / ml collagenase A og 600 μL 0,1 g / ml trypsin ved hjælp af en 50 ml / 0,2 μm filterkolbe. Alloker mellem 10 ml og 30 ml kollagenaseopløsning pr. mus, afhængigt af vævsmasse.
  3. Forbered kollaganaseopløsning til humant brystvæv: Sterilt filter 18 ml RPMI-1640, 200 μL 100x penicillin-streptomycinopløsning (pen / strep), 200 μL 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) buffer, 1 ml FBS og 400 μL 0,1 g / ml kollagenase A ved hjælp af en 50 ml / 0,2 μm filterkolbe. Alloker mellem 10 ml og 20 ml pr. vævsprøve, afhængigt af vævsmassen.

3. Forberedelse af medier

  1. Forbered organoide medier: Sterilt filter basalcellemedium med 1% pen / strep og 1% insulin-transferrin-selen (ITS) ved hjælp af en 50 ml / 0,2 μm filterkolbe. For at fremstille organoid vækstfaktormedier tilsættes basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) til en endelig koncentration på 2,5 nM.
  2. Forbered brystepitelmedier: For at fremstille 100 ml brystepitelmedier, sterilt filter med højt glukose fælles basalmedium med 1 ml 100x glutamintilskud, 1 ml pen / strep, 1 ml 10 mM HEPES-buffer (7,3 pH), 250 μL 30% BSA-lager, 1 μL 1 mg / ml koleratoksinstamme, 1 ml 50 μg / ml hydrocortisonbestand i PBS, 50 μL 10 mg/ml human insulinopløsning, 10 μL 50 μg/ml epidermal vækstfaktor (EGF) og 1 % FBS ved hjælp af en 150 ml/0,2 μm filterkolbe. Opbevar mediet ved 4 °C og brug det i op til 2 uger.
  3. Forbered amfotericinvask: Sterilt filter PBS med 2% pen/strep og 2% amphotericin B. Opbevares ved 4 °C.

4. Indsamling og fordøjelse af væv

  1. Musens brystvæv
    1. Afliv musen ved at placere den i et CO 2 kammer i2-5 min, og følg derefter med cervikal dislokation. Med den ventrale side opad, spil muselemmer og brug fire 19 G nåle til at fastgøre musen ved poterne til et bræt dækket med en absorberende pude. Spray med 70% ethanol for at glatte pelsen ned og desinficere huden. Tør afføring væk med en gasbind eller væv.
    2. Start lige over det anogenitale område, skær opad fra midterlinjen ved hjælp af kirurgisk saks, pas på ikke at gennembore gennem bughinden. Når du når hagen, skal du lave laterale snit ned ad begge kraveben og ned bagbenene og fastgøre musens hud stram til brættet for at udsætte brystfedtpuder.
    3. Find de indinale brystfedtpuder på vildtypemus ved at identificere den indinale lymfeknude placeret nær bagbenene. Find thorax bryst bryst fedt puder på vildtype mus som det tykkere, vaskulariserede væv under de forreste lemmer.
    4. Brug tang til at hæve brystfedtpuden. Undgå at samle underliggende muskler. Brug den stumpe ende af skarp stump saks til at oprette en lomme under brystfedtpuden, væk fra huden. Skær brystfedtpuden væk i et komplet stykke.
    5. Når brystfedtpuder er fjernet, skylles PBS i, inden de placeres i en steril vævskulturskål. Overfør hurtigt til en vævskulturhætte.
      BEMÆRK: For brysttumorer, brug en vatpind fugtet med PBS til forsigtigt at rulle tumoren væk fra huden. Sørg for at undgå mørke eller bløde områder, da mørk misfarvning indikerer nekrose, hvilket ikke giver sunde organoider.
    6. Hak brysttumorerne med en # 10 eller # 11 skalpel for at løsne væv, indtil den når en pastalignende konsistens. Overfør hakket væv til et konisk rør indeholdende 10-30 ml kollagenaseopløsning ved hjælp af en skalpel. For at sikre, at alt væv opsamles, pipetteres 1 ml kollagenaseopløsning på vævskulturpladen og tilbage i det koniske rør.
      BEMÆRK: For at producere større organoider bør mekanisk fordøjelse minimeres, hvilket efterlader nogle små synlige stykker væv intakt. Alternativt kan væv opbevares frosset til senere organoid forberedelse med minimalt tab af levedygtighed. For at gøre dette skal du vaske væv i en opløsning af PBS eller basalcellemedier + 1% FBS og derefter groft hakket for at øge overfladearealet (holde vævet i et eller to faste stykker). Flyt vævet til et kryohætteglas, top med frysemedier (90% FBS + 10% dimethylsulfoxid (DMSO)). Hætteglassene fryses ned i en frysebeholder med kontrolleret hastighed natten over, inden de opbevares i flydende nitrogen.
    7. Det koniske rør anbringes i en 37 °C stationær rysteinkubator ved 180 omdr./min., indtil vævet bliver trævlet, og kollagenaseopløsningen bliver uklar. For eksempel tager en stor vævsmasse (ca. 500-800 mg) fra en tumor 30-60 min. En mindre vævsmasse (ca. 100-300 mg) fra vildtype brystfedtpuder tager ca. 20-30 min. Hvis du er usikker, skal du kontrollere med 5 minutters mellemrum.
    8. Efter inkubation centrifugeres det koniske rør i 10 minutter ved 550 x g ved stuetemperatur (RT).
    9. Supernatanten suges forsigtigt ud af det koniske rør.
      BEMÆRK: Fremadrettet skal du forcoate alle pipettespidser, serologiske pipetter og koniske rør med BSA-opløsning for at undgå tab af organoider på grund af vedhæftning til plast.
    10. Der tilsættes 8 ml basalcellemedier og 80 μL DNaseopløsning [2 E/μL] til røret. Vend forsigtigt i 1-3 min.
    11. Tilsæt 12 ml basalcellemedier til røret og bland forsigtigt ved pipettering eller drej forsigtigt røret 15 gange for at blande.
    12. Centrifuger i 10 min ved 550 x g ved RT.
    13. Supernatanten suges op, og pelletsen resuspenderes derefter i 12 ml basalcellemedier.
    14. Lad de tungeste vævsfragmenter slå sig ned til bunden. Supernatanten opsamles med en serologisk pipet og overføres til et 15 ml konisk rør. Denne suspension indeholder epitelorganoider og stromale / immunceller.
  2. Menneskeligt brystvæv
    1. Behandl de humane brystvævsprøver for organoider, eller opbevar dem inden for 24 timer efter indsamling. Opbevar prøverne ved 4 °C i CO2-uafhængige medier med 1% 100x antibiotika-antimykotikum.
    2. Overfør vævet til en vævskulturplade. Vip pladen og aspirer det overskydende opbevaringsmedie, og skyl derefter vævet med 5 ml amfotericin B-vask. Fjern amfotericinen B vask straks.
    3. Hak vævsprøven med en #10 eller #11 skalpel for at løsne vævet, indtil det når en pastalignende konsistens. Overfør hakket væv til et konisk rør indeholdende 10-30 ml kollagenaseopløsning ved hjælp af en skalpel. For at sikre, at alt væv opsamles, pipetteres 1 ml kollagenaseopløsning på vævskulturpladen og vender tilbage til det koniske rør.
      BEMÆRK: For at producere større organoider bør mekanisk fordøjelse minimeres, hvilket efterlader nogle små synlige stykker væv intakt. Startvævsmasse for denne protokol varierede mellem 100-250 mg. Alternativt kan væv opbevares frosset til senere organoidpræparation med minimalt tab af levedygtighed efter trin 4.2.2 i 90% FBS + 10% DMSO som ovenfor.
    4. Placer det koniske rør i en 37 ° C benchtop rystende inkubator ved 180 RPM, indtil vævet bliver mindre og kollagenase bliver uklar. Kontroller vævet med 5 minutters mellemrum. Collagenase dissociation af humane prøver tager ca. 5-20 min.
    5. Efter inkubation drejes det koniske rør ned i 10 minutter ved 550 x g ved RT.
    6. Supernatanten suges forsigtigt ud af det koniske rør.
      BEMÆRK: Fremadrettet skal du forcoate alle pipettespidser, serologiske pipetter og koniske rør med BSA-opløsning for at undgå tab af organoider på grund af vedhæftning til plast.
    7. Der tilsættes 4 ml basalcellemedier og 40 μL DNaseopløsning [2 U/μL] til det koniske rør. Vend forsigtigt i 3 min.
    8. Tilsæt 6 ml basalcellemedier til røret og bland forsigtigt ved pipettering eller drej forsigtigt det koniske rør 15 gange for at blande.
    9. Centrifuger i 10 min ved 550 x g ved RT.
    10. Supernatanten suges op, og pelletsen opslæmmes derefter igen i 10 ml basalcellemedier.
    11. Lad de tungeste vævsfragmenter slå sig ned til bunden. Supernatanten opsamles og overføres til et 15 ml konisk glas. Denne suspension indeholder epitelorganoider og stromale / immunceller.

5. Differentiel centrifugering

  1. Der pulseres til 550 x g i 3-4 s ved RT, supernatanten suges op, og pelletsen resuspenderes i 10 ml basalcellemedier. Gentag dette trin tre gange mere (i alt fire spins).
  2. Efter hver centrifugering skal du sikre dig, at pelleten bliver mere og mere uigennemsigtig. Denne resterende pellet vil være epitelorganoider.

6. Indsamling af små organoider

  1. Puls til 80-100 x g i 3 s ved RT. Supernatanten samles i et frisk BSA-belagt glas, og pulseres derefter til 550 x g i 3 s ved RT for at pelletere de små organoider.

7. Indlejring af organoider i BECM

  1. Alikvote passende suspension af organoider i mikrocentrifugeglas i overensstemmelse med organoiddensiteten i forhold til mængden af BECM pr. hul (tabel 1). Brug for eksempel 50-100 organoider til 20 μL BECM i en brønd i en 96-brøndplade.
    BEMÆRK: Organoiddensitet kan tælles ved hjælp af følgende formel: ((Gennemsnitligt antal organoider)/50 μL) x fortyndingsfaktor.
  2. Udfør alle trin på is. Placer den optøede BECM på is i en vævskulturhætte. Mens du forbereder emhætten, skal du placere alle pipettespidserne på is for at afkøle.
  3. Mikrocentrifugeglassene centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g ved RT. Supernatanten kasseres fra glassene. Glassene med organoidpiller flyttes til is, og der tilsættes en passende mængde BECM til hvert mikrocentrifugeglas (tabel 1).
    BEMÆRK: Da BECM er tyktflydende, skal der tilføjes yderligere volumener (ca. 10% -20% ekstra kuppelvolumen) af BECM for at tage højde for tabet i pipetspidsen.
  4. Pipetter forsigtigt op og ned for at resuspendere organoiderne i BECM, og pas på ikke at producere bobler.
  5. Langsomt og forsigtigt pipetteres de BECM-suspenderede organoider på pletteringsoverfladen. Under pipettering skal du langsomt bringe pipetten op for at skabe en kuppel. Fyld alle de tomme brønde med PBS for at opretholde fugtigheden.
  6. Pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C i 1 time, så BECM kan størkne, og dækkes derefter med en passende mængde medier (tabel 1).

8. Indlejring af organoider i kollagen

  1. Udfør alle trin på is. Forbered kollagenopløsningen ved at kombinere i sekventiel rækkefølge 375 μL 10x DMEM, 100 μL 1 N natriumhydroxid (NaOH) og 3 ml rottehalekollagen I-opløsning i et 15 ml konisk rør. Pipette mix, pas på ikke at lave bobler. Opløsningen titreres til en pH-værdi på 7,2-7,4 med små mængder (trin på 1-3 μL) NaOH eller 10x DMEM efter behov.
  2. Coat bunden af brøndene med den mindste mængde kollagen, der kræves for fuldt ud at dække bunden af brønden. En tilgang er at placere en lille mængde kollagen og rocke pladen fra side til side til frakke. Lad kollagenunderlagene sætte sig ved 37 °C i 30 min-2 timer.
  3. Alikvote passende suspension af organoider i mikrocentrifugeglas i henhold til organoiddensiteten i forhold til mængden af kollagen pr. hul (tabel 1). Anbring i en 37 °C inkubator.
  4. Opbevar kollagenopløsningen ved 4 °C og overvåg polymerisationen ved at kontrollere for fiberdannelse under et mikroskop hvert 10. minut. Kollagen vil nå passende polymerisation mellem 30 min-2 timer.
    BEMÆRK: Korrekt polymerisation kan bestemmes af tilstedeværelsen af fibre, der forgrener sig gennem matrixen. Fortsæt straks til trin 8.5, når der er observeret nogle få fibre i synsfeltet.
  5. Mikrocentrifugeglassene centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved RT. Supernatanten kasseres fra glassene. Flyt de organoide pellets til is og tilsæt den passende mængde kollagen til hvert mikrocentrifugerør (tabel 1).
    BEMÆRK: Da kollagen er tyktflydende, tilsættes yderligere volumener (ca. 10% -20% ekstra kuppelvolumen) kollagen for at tage højde for tabet i pipetspidsen.
  6. Pipette forsigtigt op og ned for at resuspendere organoider i kollagen, pas på ikke at producere bobler.
  7. Pipette langsomt og forsigtigt de kollagensuspenderede organoider på pletteringsoverfladen. Under pipettering skal du langsomt bringe pipetten op for at skabe en kuppel. Fyld alle de tomme brønde med PBS for at opretholde fugtigheden.
  8. Pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C i 1 time, så kollagen kan størkne, og dækkes derefter med en passende mængde medier (tabel 1).
  9. BEMÆRK: Organoider opretholder levedygtighed i 3D-matrix i op til 7 dage. Hvis billeddannelse bruges til analyse, skal du fortsætte til trin 9 og 10.

9. Fastgørelse af indlejrede organoider

  1. Brug en pipette til at fjerne alle medier fra brøndene uden at komme i kontakt med ECM-kupler.
  2. Fastgør med 4% paraformaldehyd (PFA)/PBS opløsning i 5 min.
  3. Vask to til tre gange ved at påføre PBS på brønde efter at have placeret dem på en langsomt bevægende ryster. Efter vask påføres frisk PBS på kuplerne, og pladen opbevares ved 4 °C.

10. Immunofluorescerende farvning af indlejrede organoider

  1. Forberedelse af opløsninger til immunofluorescerende farvning
    1. Permeabiliseringsbuffer: Forbered en PBS-opløsning med 10% Triton X-100.
    2. Blokeringsbuffer: Forbered en PBS-opløsning med 10% FBS og 0,2% Triton X-100.
    3. Antistoffortyndingsbuffer: Forbered en PBS-opløsning med 2% FBS og 0,2% Triton X-100.
  2. Permeabilisering og blokering
    1. Pipette nok permeabiliseringsbuffer til at dække ECM-kuplerne. Der inkuberes i 1 time ved RT på en langsomt bevægende ryster.
    2. Permeabiliseringsbufferen fjernes med en pipette, og påfør det samme volumen blokerende buffer i 3 timer.
  3. Primær antistofinkubation
    1. Den blokerende buffer fjernes med en pipette, og antistoffortyndingsbufferen, der indeholder det primære antistof, påføres i producentspecificerede koncentrationer. Prøven inkuberes ved 4 °C i 12-16 timer på en langsomt bevægende ryster.
    2. Fjern den primære antistofopløsning og vask prøverne tre gange i 10 minutter med PBS ved RT på en langsomt bevægende ryster.
  4. Sekundær antistofinkubation og nuklear plet
    1. Opsug den resterende PBS-vask og påfør antistoffortyndingsbufferen, der indeholder sekundært antistof, i producentspecificerede koncentrationer. Derudover tilsættes DAPI eller Hoechst (for at mærke kerner) eller phalloidin (for at mærke actin) til bufferen i forholdet 1:250. Inkuber i 2-4 timer ved RT på en langsomt bevægende ryster.
    2. Fjern den sekundære antistofopløsning og vask prøver tre gange i 10 minutter i PBS ved RT på en ryster. Prøverne opbevares i PBS ved 4 °C indtil billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Billederne i figur 1 giver et eksempel på vildtype- og tumorholdige brystepitelorganoider fra menneske- og musevæv. Et hurtigt overblik over metoden til isolering af epitelorganoider gennem differentiel centrifugering findes i tegneseriearbejdsgangen i figur 1A, der viser, at primære væv fra forskellige arter kan behandles på næsten identiske måder, mens det giver epitelvæv som vist på brightfield-billederne (figur 1B ). Desuden kan disse vævssammensætningsligheder mellem arter ses i de immunofluorescerende billeder af indlejrede organoider i enten kælderekstracellulær matrix eller kollagen vist i figur 2A-D. Den organoide struktur kan visualiseres gennem enten membran Tomat (mTomat) -mærkning eller phalloidin farvning af actin. Disse tal viser også den forventede organoidsammensætning og størrelse ved hjælp af denne metode. Organoider indlejret i kollagenmatrix kan bruges til et invasionsassay og analyseres ved at spore udvidelsen af tendrils, der forgrener sig fra selve organoiden, som det ses i figur 2C. Endelig viser hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af paraffinindlejrede organoider, at organoider opretholder den samme histologi af brystkræft (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: Arbejdsproces for epitelorganoidgenerering med eksempler på organoider . (A) Skema over arbejdsgang for organoidgenerering fra væv fra mus eller humant væv uden passaging. (B) Repræsentative billeder af isolerede epitelorganoider fra WT-brystkirtler hos mus, musebrysttumorer og humane brysttumorer i medier efter isolation. Hvert billede blev justeret individuelt for lysstyrke og kontrast for forbedret visualisering. Billeder blev taget i brightfield på et omvendt epifluorescerende mikroskop ved 10x forstørrelse. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. Brysttumorer blev isoleret fra MMTV-PyMT-mus; normalt brystvæv blev isoleret fra FVB-mus. Mus varierede fra 8-14 uger i alderen29. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Billeddannende organoider i den ekstracellulære matrix. Hvert billede blev justeret individuelt for lysstyrke og kontrast for forbedret visualisering for denne samling. Før billeddannelse blev prøverne fikseret med 4% paraformaldehyd. Vildtypeprøver blev farvet med phalloidin 568 for at visualisere cellemembranen, og alle prøver blev farvet med Hoechst for at visualisere kerner, der viste organoid morfologi og densitet. Billeder blev taget ved 10x forstørrelse på et konfokalmikroskop og yderligere forstørret med en scanningszoom på 3.003. Laserbølgelængden, der blev brugt til at detektere DAPI, var 405 nm med en effekt på 5, og laserbølgelængden, der blev brugt til at detektere phalloidin, var 561,0 nm for kanal 3 med en effekt på 0,5. Konfokal pinhole størrelse blev opretholdt på 19.16 for alle billeder. (A) Repræsentativt brightfield-billede af WT-organoid fra musebryst indlejret i BECM på dag 0. (A') 1:250 Hoechst-mærkningskerner og (A'') 1:250 phalloidinmærkning, actinimmunofluorescerende billeder af A. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. Normalt brystvæv blev isoleret fra FVB-mus. Mus varierede fra 8-12 uger. (B) Repræsentativt brightfield-billede af musebrysttumororganoid indlejret i BECM på dag 0. (B') 1:250 Hoechst-mærkningskerner og (B'') mtomatmærket immunfluorescerende billede af B. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. Brysttumorer blev isoleret fra MMTV-PyMT-mus. Mus varierede fra 12-14 uger. (C) Repræsentativt brightfield-billede af musebrysttumororganoid indlejret i kollagen I på dag 3. Billedet repræsenterer en organoid, der demonstrerer "invasiv" egenskab. (C') 1:250 Hoechst-mærkningskerner og (C') mtomatmærket immunfluorescerende billede af C. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. Brysttumorer blev isoleret fra MMTV-PyMT-mus. Mus varierede fra 12-14 uger. (D) Repræsentativt brightfield-billede af human brysttumororganoid indlejret i BECM på dag 0. (D') Hoechsts mærkningskerner og (D'') 1:250 Actin-targeting phalloidin-labeled immunofluorescerende billede af D. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. (E) Snitbillede af en organoid indlejret i BECM og farvet med H&E taget ved 20x forstørrelse. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. H&E-farvning blev udført af University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource30. Klik her for at se en større version af denne figur.

Kulturplade ECM dome volumen Anbefalet antal organoider Medievolumen
6-brønds plade 200 μL 300 3 ml
12-brønds plade 150 μL 225 2 ml
24-brønds plade 100 μL 150 1 ml
48-brønds plade 40 μL 60 300 μL
96-brønds plade 20 μL 30 150 μL

Tabel 1: Anbefalet volumen af ECM-komponenter til kupler, densitet af organoider og volumen af medier, der er nødvendige pr. brønd på forskellige dyrkningsplader.

Problem Potentiel årsag Opløsning
ECM-kupler er kollapset. Pladen blev rystet, ECM-volumenet var for stort til, at kuppelformen kunne opretholdes, eller kuplerne rørte ved kanten af brønden, hvilket fik dem til at klæbe og falde. Undgå at flytte pladen for kraftigt, før kuplerne har stivnet sig, reducer mængden af ECM, der bruges til resuspension af organoider, eller vær meget omhyggelig med at pipette kuplerne i midten af pladen.
Der er væv, der ikke ligner organoider. Muskelvæv eller nerve kan være blevet indsamlet i processen med at høste brystfedtpuden. Skær kun væk, hvad der klart er en brystfedtpude. Undgå at fjerne vævet, der klæbes tæt til huden.
Der er mange døde organoider. Nekrotisk tumorvæv blev høstet. Undgå at samle vævet fra tumorer, der er nekrotiske, cystiske, overdrevent bløde eller mørkere i farven. Tumorvæv skal være fast.
Der er flere enkeltceller end organoider. Væv blev hakket for fint, eller kollagenasefordøjelsen blev kørt for længe. Undgå over-mincing vævet eller reducere kollagenaseinkubationstiden.
Der er bobler i ECM. Resuspension ved pipettering var for kraftig, og udslyngning under pipettering af kupler var for hurtig. Langsomt resuspendere organoiderne i ECM og langsomt pipette dem i kupler. Hvis problemet fortsætter, skal du undgå at gå til det andet stop, mens du pipetterer.
Der er ingen invasion af organoider i kollagen. Kollagen blev ikke korrekt polymeriseret eller overpolymeriseret. Resuspender ikke organoiden i kollagen, før den er korrekt polymeriseret. Tjek hvert 30. minut. Hvis der ikke er nogen polymerisation, resuspenderes straks ved 2 timers mærket og pladen.
Der er ingen kollagenfibre synlige, mens du ser efter polymerisation. Mikroskopindstillinger var ikke gunstige. Juster fasekontrasten for maksimal mørke, og bring derefter mikroskopets lysstyrke helt op. Derudover kan øget forstørrelse forbedre visningen.
ECM-kupler er opløst. Fikseringstiden var for lang, eller PFA blev ikke grundigt fjernet fra de ECM-indlejrede prøver. Hold fiksering af ECM domes tid under 5 min og følg op med fem vaske på en roterende ryster i 5 min hver.

Tabel 2: Tabel over potentielle problemer, årsager og løsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskellige metoder er blevet beskrevet i litteraturen til at generere tumororganoider. Denne protokol fremhæver en metode til generering af tumororganoider direkte fra tumoren uden at passere. Ved hjælp af denne metode kan tumororganoider produceres inden for få timer efter initiering af proceduren og genererer tæt på 100% levedygtige organoider sammenlignet med 70% rapporteret i litteraturen31. Til sammenligning kræver andre metoder seriel passaging af celler i organoider over flere uger. Således bliver downstream-applikationerne, såsom bestemmelse og visualisering af immuncelleinteraktioner med matchede organoid- og immunprøver fra samme vært uden påvirkning af langvarig kultur, mere gennemførlige. Som fremhævet i figur 2C kan indlejring af tumororganoider i forskellige ekstracellulære matricer tillade identifikation af nøglefænotyper gennem den metastatiske kaskade, såsom invasion ud af den primære tumor. Andre downstream-applikationer inkluderer fænotypiske assays af forgreningsmorfogenese32, invasion, formidling og kolonidannelse33 for at vurdere for forskellige epitelcelleadfærd. Immuninteraktioner kan også fanges funktionelt og visuelt med disse organoidbaserede assays. Endvidere kan geler opløses for at isolere indlejrede celler til downstream-analyse af genetisk og proteinindhold ved hjælp af standard biokemiske og flowbaserede assays. Endelig, fordi store mængder organoider hurtigt kan genereres fra tumorvæv, kan disse assays skaleres til lægemiddelscreeningsapplikationer og integration i arbejdsgange i kliniske forsøg.

Der er flere vigtige trin, der er afgørende for denne protokol. For det første afhænger den tid, der kræves til fordøjelsen af kollagenase, af vævssammensætningen og mængden af væv, der fordøjes. For eksempel, når man arbejder med mindre stykker væv, såsom humane brysttumorkirurgiske prøver (i gennemsnit 100-250 mg), kræves en kortere fordøjelsestid. Imidlertid er brysttumorer høstet fra en mus meget større i størrelse (500-800 mg) og kan kræve 30-60 min enzymatisk fordøjelse. For det andet er det også vigtigt at belægge alle pipettespidser og serologiske pipetter med BSA for at undgå tab fra celleadhæsion til plast for at sikre et maksimalt udbytte af epitelorganoider. For det tredje er en kort differentiel centrifugeringstid afgørende for eliminering af ikke-epitelvævskomponenter. Denne fremgangsmåde tillader pellet af tungere epitelorganoider, mens lettere stromale og immunrum forbliver i supernatanten. For at skabe invasionsanalyser ved indlejring af organoider i kollagen er det afgørende at muliggøre korrekt polymerisation af kollagenet, før organoider indlejres. Dette trin skal kontrolleres visuelt ved at bekræfte kollagendannelse af kollagenfibre under et lysmikroskop. Endelig skal du for de bedste billeddannelsesresultater passe på at undgå at producere bobler, når du resuspenderer organoider i ECM og plettering. Bobler vil skjule organoider i gelen og forvrænge billeder. Tabel 2 indeholder en liste over potentielle problemer, der er opstået, og løsninger til at overvinde disse udfordringer.

Visse trin i protokollen tillader ændringer for at tilpasse størrelsen af de genererede organoider eller reducere den tid, der kræves for at udføre protokollen. For eksempel kan forøgelse af varigheden af mekanisk fordøjelsestid resultere i en kortere kollagenasefordøjelsestid, mindre organoider og flere individuelle celler. Centrifugering efter kollagenasefordøjelse kan forkortes til 5 min, hvis der arbejdes med en stor mængde tumorvæv. Medier, der anvendes til dyrkning og dyrkning af organoider, kan fremstilles en dag før for at spare tid under organoidgenereringstrinnene. Tilsvarende kan tumorvæv opbevares i op til 24 timer i passende medier før organoidpræparation. Hvis tiden er ekstremt begrænset, inkluderer denne protokol pause trin ved at fryse tumorvæv på indsamlingsdagen. Derefter kan disse frosne væv bruges til at generere levedygtige organoider på et senere tidspunkt. Ca. 90% af organoiderne afledt af det frosne væv var levedygtige, bekræftet visuelt under et lysmikroskop og med en trypanblå opløsning.

Der er nogle begrænsninger for denne protokol. Mens denne tilgang genererer levedygtige organoider hurtigt, er mængden af genererede organoider begrænset af mængden af tumorvæv. Denne begrænsning bliver især tydelig, når man arbejder med kliniske prøver, hvor mængden af tumorvæv er mindre eller til tider endda begrænset til nogle få celler. I de ekstreme tilfælde, hvor kun få celler kan genvindes som udgangsmateriale, kan passaging være en bedre mulighed. En anden begrænsning er den reduktionistiske tilgang til denne metode. Fjernelse af stromale rum såsom fibroblaster eller endotelceller beriger epitelorganoidgenerering. Imidlertid er disse cellepopulationer kritiske for tumorens funktion. Derfor begrænser deres fjernelse fortolkningen af tumorbiologi, der udelukkende er afledt af epitelorganoidmodeller. Afslutningsvis giver denne protokol en tilgang til hurtig generering af epitelorganoider til øjeblikkelig brug i nedstrøms billeddannelse, funktionelle (herunder immuninteraktioner) og lægemiddelscreeningsapplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af finansiering fra METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation og NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi anerkender hjælpen fra University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delt ressource på Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvist støttes af National Cancer Institute under tildelingsnummer P30 CA142543. Særlig tak til alle medlemmer af Chan Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM HEPES Buffer Gibco  15630080
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco  15240-096
100x Glutamax Life Technologies  35050-061 Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)  Life Technologies  51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Sigma  P4333
10x DMEM Sigma  D2429
50 mL/0.2 µm filter flask Fisher  #564-0020
Amphotericin B Life Technologies  15290-018
bFGF Sigma F0291
BSA Solution (32%) Sigma  #A9576
Cholera Toxin  Sigma  C8052
CO2-Independent Medium  Gibco 18045-088
Collagenase A  Sigma  C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) Sigma D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma D6546 Common basal medium
D-MEM/F12  Life Technologies  #10565-018 Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)  Sigma #D8662 PBS
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F0926
Gentamicin  Life Technologies  #15750-060
Human epidermal growth factor (EGF) Sigma  E9644
Hydrocortisone  Sigma  H0396
Insulin  Sigma  #I9278
Matrigel  Corning  #354230 Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N) Sigma  S2770
Rat Tail Collagen I Corning  354236
RPMI-1640 media Fisher  SH3002701
Trypsin  Life Technologies  27250-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Tags

Kræftforskning nr. 189
Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornelius, S. L., Colonnetta, M. M., … More

Cornelius, S. L., Colonnetta, M. M., Lake, K. E., Smith, C. A., Zhang, Y. A., Roussos-Torres, E. T., Reddy, S. M., Chen, E. H., Chan, I. S. Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging. J. Vis. Exp. (189), e64626, doi:10.3791/64626 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter