Summary
Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.
Abstract
De beschikbaarheid van cellen geïsoleerd uit gezonde en zieke weefsels en organen vormt een sleutelelement voor gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen. Hoewel biobanken een brede verzameling primaire en onsterfelijke cellen voor biomedisch onderzoek kunnen bieden, dekken deze niet alle experimentele behoeften, met name die met betrekking tot specifieke ziekten of genotypen. Vasculaire endotheelcellen (EC's) zijn belangrijke componenten van de immuunontstekingsreactie en spelen dus een centrale rol in de pathogenese van een verscheidenheid aan aandoeningen. Met name EC's van verschillende locaties vertonen verschillende biochemische en functionele eigenschappen, waardoor de beschikbaarheid van specifieke EC-typen (d.w.z. macrovasculair, microvasculair, arterieel en veneus) essentieel is voor het ontwerpen van betrouwbare experimenten. Hier worden eenvoudige procedures voor het verkrijgen van hoogrenderende, vrijwel zuivere menselijke macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen uit de longslagader en longparenchym in detail geïllustreerd. Deze methode kan gemakkelijk worden gereproduceerd tegen relatief lage kosten door elk laboratorium om onafhankelijk te worden van commerciële bronnen en EC-fenotypen / genotypen te verkrijgen die nog niet beschikbaar zijn.
Introduction
Het vasculaire endotheel bekleedt het binnenoppervlak van de bloedvaten. Het speelt een sleutelrol bij het reguleren van bloedstolling, vasculaire tonus en immuun-inflammatoire reacties 1,2,3,4. Hoewel de kweek van endotheelcellen (EC's) geïsoleerd uit menselijke specimens essentieel is voor onderzoeksdoeleinden, moet worden opgemerkt dat de EC's uit verschillende bloedvaten (slagaders, aderen, haarvaten) specifieke functies hebben. Deze kunnen niet volledig worden samengevat door humane navelstreng-endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk verkrijgbaar zijn en op grote schaal worden gebruikt in studies naar vasculaire endotheelpathofysiologie 5,6. Menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen (HLMVECs) spelen bijvoorbeeld een sleutelrol bij longontsteking door de rekrutering en accumulatie van leukocyten te beheersen 4,7. Een experimentele setting gericht op het reproduceren van longontsteking met hoge getrouwheid zou dus HLMVEC's moeten omvatten. Aan de andere kant kan EC-disfunctie worden waargenomen in verschillende pathologieën; daarom zijn EC's van de patiënt van fundamenteel belang voor het bouwen van een betrouwbaar in vitro model van de ziekte. Bijvoorbeeld, de isolatie van fragmenten van EC's uit de longslagader (HPAECs), ontleed uit de geëxplanteerde longen van mensen die getroffen zijn door cystic fibrosis (CF), hebben ons in staat gesteld om mechanismen van endotheeldisfunctie bij deze ziekte te ontdekken 8,9.
Protocollen gericht op het optimaliseren van de isolatie van EC's uit verschillende bronnen / organen, ook in ziektetoestanden, zijn dus essentieel om onderzoekers waardevolle onderzoeksinstrumenten te bieden, vooral wanneer deze hulpmiddelen niet commercieel beschikbaar zijn. HLMVEC- en HPAEC-isolatieprotocollen zijn eerder gemeld 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In alle gevallen resulteerde de enzymatische vertering van de longmonsters in gemengde celpopulaties, die werden gezuiverd met behulp van ad hoc selectieve media en magnetische kralen- of cytometrische celsortering. Verdere optimalisaties van deze protocollen moeten twee belangrijke problemen in EG-isolatie aanpakken: (1) cel- en weefselverontreiniging, die zo snel mogelijk moet worden opgelost om EG-replicatieve senescentie te minimaliseren20; en (2) de lage opbrengst van primaire EC-isolaten.
Deze studie beschrijft een nieuw protocol voor de high-yield, high-purity isolatie van HLMVECs en HPAECs. Deze procedure kan eenvoudig toepasbaar zijn en geeft in een paar stappen vrijwel zuivere macrovasculaire en microvasculaire EC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd en het protocol volgde de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Universiteit van Chieti-Pescara (# 237_2018bis). Figuur 1 illustreert de isolatie van endotheelcellen uit segmenten (1-3 cm lang) van longparenchym of longslagader van niet-geïdentificeerde menselijke proefpersonen (met schriftelijke toestemming) die om verschillende redenen thoracale chirurgie ondergaan, zoals pneumothorax of lobectomie. In dit laatste geval verzamelden de chirurgen ook een longslagadersegment. Met name de chirurgen werden nauwkeurig geïnstrueerd om kankervrije monsters te verzamelen. Het gepresenteerde protocol werd geoptimaliseerd om een zo groot mogelijke opbrengst en zuiverheid te verkrijgen.
1. Experimentele voorbereiding
- Collagenase reconstitutie
- Los collagenasepoeder op in fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder CaCl 2 en MgCl 2 (PBS−−, zie materiaaltabel) bij een concentratie van2 mg/ml en filter de oplossing met een poriënfilter van 0,22 μm.
- Bereid 5 ml aliquots en bewaar ze bij −20 °C. Ontdooi en verwarm de aliquots voor gebruik voor op 37 °C.
- Plaatcoating
- Voor plaatcoating, pipetteer 1,5% gelatine-oplossing of 50 μg/ml fibronectine (zie tabel met materialen) in de kweekplaat (500 μL is voldoende om het oppervlak van elke put van een 6-putplaat te bedekken) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Verwijder na incubatie de overtollige gelatine en was de putjes met PBS−−. Zuig de PBS−− aan en laat de plaat drogen in een steriele kap.
OPMERKING: Voor gelatinereconstitutie, los het poeder op in water om een 1,5% -oplossing te maken, autoclaaf het vervolgens en bewaar het bij 4 °C. Gelatine van 1,5% is niet vloeibaar bij 4 °C; daarom moet het worden opgewarmd voordat het wordt gecoat. Als alternatief kan elke commerciële gelatine-oplossing die geschikt is voor celculturen worden gebruikt voor de plaatcoating.
2. Monstervoorbereiding
- Longparenchym
- Was de verzamelde monsters door ze onder te dompelen in een buis van 50 ml met PBS−−.
- Breng de monsters over in een steriele petrischaal en hak het monster handmatig met een chirurgische schaar (optimale grootte: >2 cm) in kleine fragmenten van elk ongeveer 3-4 mm.
- Slagadersegment(en)
- Was de verzamelde monsters door ze onder te dompelen in een buis van 50 ml met PBS−−.
- Breng het over in een steriele petrischaal zonder te hakken, omdat fragmentatie het oppervlak van de doorsnede van het slagadersegment zal vergroten, waardoor de mogelijkheid om niet-EC's te isoleren toeneemt.
3. Enzymatische spijsvertering
- Was het in blokjes gesneden longparenchym of het longslagadersegment(en) tweemaal met PBS−−. Deze stap verwijdert een groot deel van het resterende bloed.
- Plaats de monsters in buisjes van 15 ml en incubeer met 5 ml collagenase type 2 (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Tijdens deze incubatie geeft de afbraak van de extracellulaire matrix afzonderlijke cellen en celaggregaten vrij.
4. Herstel van de verteerde cellen
- Plaats een steriele staal/metalen zeef (d.w.z. een theezeef met een maaswijdte van ~1 mm) op de bovenkant van een opvangbuis van 50 ml.
- Giet de volledige inhoud van de buis van 15 ml op de zeef, masseer het verteerde weefsel voorzichtig met een spatel en spoel het monster af met PBS−− totdat de opvangbuis is gevuld.
OPMERKING: Deze stap elimineert grote weefselfragmenten op de millimeterschaal, waardoor een grotere efficiëntie van de volgende filtratiestappen wordt gegarandeerd.
5. Niet-EG-verwijdering door filtratie
- Filter de uitstroom die in stap 4.2 is verzameld met behulp van een celzeef met een maaswijdte van 70 μm en vang de uitstroom op in een verse buis van 50 ml.
- Gebruik vervolgens een celzeef met een maaswijdte van 40 μm en verzamel de uitstroom in een verse buis van 50 ml. Label deze buis als "tube 1".
OPMERKING: Deze filtraties in stap 5.1 en stap 5.2 verwijderen grote celaggregaten, die vaak zijn samengesteld uit gemengde celpopulaties.
6. Sedimentatie van celclusters en celzaaien
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 30 x g om de celclusters te bezinken.
- Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een steriele pipet (niet gieten) en plaats het in een verse buis van 50 ml ("tube 2").
- Suspensie de pellet in "buis 1" en vul de buis tot 50 ml met PBS−−. Vul "tube 2" tot 50 ml met PBS−−.
OPMERKING: Vanaf deze stap worden beide buizen op dezelfde manier behandeld. - Centrifugeer de monsters op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Suspensie de pellets met 2 ml groeimedium (zie materiaaltabel) en zaai de suspensie in twee afzonderlijke putjes van een voorgecoate 6-putplaat (stap 1.2).
OPMERKING: Vanaf deze stap voedt u de cellen om de 2 dagen met het groeimedium totdat ze confluentie bereiken (ongeveer 1 week, afhankelijk van de steekproefgrootte) om een redelijk aantal cellen te verkrijgen om te sorteren.
7. Celuitbreiding
- Was de cellen met 2 ml PBS met CaCl 2 en MgCl2 (PBS++, zie materiaaltabel) om de resterende bloedcellen te verwijderen (het gebruik van PBS++ is belangrijk om celloslating te voorkomen).
- Verwijder de PBS++ en voeg vers kweekmedium toe.
- Herhaal stap 7.1 en stap 7.2 totdat de cellen confluentie bereiken (ongeveer 1 week, afhankelijk van de steekproefgrootte).
8. Celsortering
- Maak de cellen los met behulp van 500 μL trypsine-EDTA (0,05%, zie tabel met materialen), centrifugeer en resuspensie van de pellet met 190 μL PBS−−.
- Voeg 10 μL van een fluorescerend geconjugeerd anti-humaan CD31-FITC-antilichaam toe (1:20 verdunning, zie tabel met materialen) en incubeer de celsuspensie bij 4 °C gedurende 30 minuten.
- Was de cellen met 10 ml PBS−−, centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g bij kamertemperatuur en resuspensie van de pellet in 300 μL PBS−−.
- Isoleer en verzamel CD31-positieve (CD31+) cellen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), met behulp van een 100 μm mondstuk, en verzamel ze in een buis.
- Volgens de gating-strategie definieert u eerst de celmorfologie met behulp van de parameters van het zijverstrooiingsgebied, SSC-A en FSC-A. Selecteer vervolgens afzonderlijke cellen met behulp van een FSC-Area/FSC-Height of SSC-Area/SSC-Height dot plot, definieer de positieve cellen in het gemarkeerde monster versus het niet-gekleurde controlemonster en leid de fluorescerende cellen naar de verzamelbuis21.
- Centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en suspensie de pellet in 2 ml groeimedium voor zaaien in de voorgecoate putten van een 6-putplaat.
9. Uitbreiding na sortering
- Vervang twee dagen na het sorteren van de cellen het geconditioneerde medium door vers groeimedium.
- Herhaal stap 7.1 en stap 7.2 elke 2 dagen voor celuitbreiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HLMEC isolatie
Het grootste probleem tijdens de isolatie van HLMVECs is de aanwezigheid van verontreinigende cellen, omdat de microscopische haarvaten niet gemakkelijk van het stromale weefsel kunnen worden gescheiden. Daarom is het bereiken van de hoogst mogelijke zuiverheid in de vroegste stadia van het isolatieproces cruciaal om de kweekpassages en dus de celveroudering te verminderen. Evenzo moet een optimaal isolatieprotocol de hoogst mogelijke opbrengst van zuivere HLMVEC's geven. Om deze doelen te bereiken is een nieuwe procedure opgezet op basis van eerder beschreven protocollen 10,11,12,14,15.
Hoewel het longparenchym sterk gevasculariseerd is en dus een uitstekende bron van HLMVECs vertegenwoordigt, wordt het grotendeels bevolkt door gladde spiercellen (SMC's), collageenvezels en fibroblasten. Deze cellen, vooral SMC's, kunnen zich aanpassen aan een verscheidenheid aan kweekmedia en repliceren in bijna alle gevallen veel sneller in vitro dan andere celpopulaties, wat betekent dat ze de gemengde celcultuur overnemen. Daarom was onze eerste zorg om de enzymatische vertering van het parenchym te kalibreren om de overdracht van ongewenste cellen te verminderen. Omdat type 2 collagenase snel groepen endotheelcellen losmaakt van de rest van het capillair, redeneerden we dat de verteringstijd van het longmonster cruciaal zou kunnen zijn voor het minimaliseren van celbesmetting. Daarom werd als eerste stap de tijd van blootstelling aan collagenase van het weggesneden longfragment teruggebracht tot maximaal 10 minuten in plaats van de voorgestelde 20 min15 (figuur 2A). Na deze behandeling werd waargenomen dat een deel van de celaggregaten, waaronder de SMC's en fibroblasten, nog steeds gebonden waren aan lange vezels (figuur 2B), terwijl SMC's de meerderheid van de niet-bloedcel singlets vertegenwoordigden. Kleine, compacte clusters van cellen, met diameters die over het algemeen niet groter zijn dan 10-20 μm, werden ook waargenomen zonder elementen die kunnen worden toegeschreven aan fragmenten van stromaal weefsel (d.w.z. grote vezels) (figuur 2B). Er werd verondersteld dat deze kleincellige aggregaten voornamelijk uit HLMVECs konden bestaan.
Volgens deze hypothese werden seriële filtratiestappen uitgevoerd om het HLMVEC-herstel te maximaliseren. Voor de eerste filtratie werd een metalen zeef gebruikt en het monster werd gemasseerd met een pincet om de ontsnapping van HLMVECs uit de haarvaten te vergemakkelijken (figuur 2C, rechts). Het doel van deze stap was om de grote clusters van gladde spiercellen en fibroblasten te verwijderen die nog steeds gebonden zijn aan de extracellulaire matrix. De uitstroom werd vervolgens gefilterd met behulp van een reeks zeven met een maaswijdte van 70 μm en 40 μm om de resterende grote, hoewel niet oogzichtbare, aggregaten te verwijderen (figuur 2C, midden, links). Om de cel singlets te verwijderen, werden de monsters gecentrifugeerd bij 30 x g gedurende 5 minuten, een snelheid die cellen en aggregaten met een diameter >7-10 μm sedimenteert, waardoor de kleinere cellen in suspensie blijven. Deze centrifugatieparameters werden gekozen op basis van die gerapporteerd door Miron et al. voor het pelleteren van circulerende bloedcellen22. Met name na deze centrifugatie was het supernatant rood gekleurd (figuur 2D), wat wijst op de aanwezigheid van veel rode bloedcellen (~ 5 μm in diameter). Op dit punt werd het supernatant voorzichtig verwijderd en in een tweede buis geplaatst. Beide buizen met het supernatant en de pellet werden gevuld met PBS−− en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 300 x g . Na centrifugatie vertoonde de buis met het supernatant een rode pellet verrijkt met bloedcellen, wat suggereert dat het ook de meeste geëxplanteerde cel singlets bevatte (figuur 2E, rechts).
De verkregen pellets werden gesuspendeerd met het endotheelcelgroeimedium en afzonderlijk gezaaid in twee putjes van een 6-putplaat, die waren voorgecoat met 1,5% gelatine uit varkenshuid (figuur 2E, midden). Na 3 dagen werden de cellen gewassen met PBS++, gevoed met vers medium en in beeld gebracht. Zoals links in figuur 2E te zien is, waren EC-eilanden overvloediger aanwezig in de put met de cellen van "buis 1" (boven), terwijl de put met de cellen van "buis 2" (onder) meestal werd bevolkt door enkele en niet-endotheelachtige cellen.
Dezelfde procedure werd toegepast op het minder uitdagende HPAEC-isolatieprotocol dat in ons eerdere werk werd gerapporteerd, waarbij de HPAEC-scheiding inhield dat hun kortere hechtingstijd werd benut in vergelijking met die van verontreinigingscellen8. Vanwege hun grote omvang kunnen slagaders gemakkelijk worden gereinigd van resterende bind- en vetweefsels, waardoor een groot deel van de niet-EC's wordt geëlimineerd. Een groot deel van de fibroblasten en extracellulaire matrixvezels was in dit stadium echter nog steeds aanwezig in de monsters, naast vasculaire SMC's8. De nieuwe procedure verhoogde de initiële EG-zuiverheid tijdens de HPAEC-explantaties verder (resultaten niet getoond).
Zuivering en fenotypische en functionele karakterisering van vers geïsoleerde HLMVECs
Aan het einde van het isolatieprotocol werd de zuiverheid van de HLMVECs geanalyseerd door de flowcytometrische detectie van celmembraan CD31. Om het CD31+ celcompartiment correct te identificeren, werd een poort ingesteld op een forward-scatter (FSC)/side-scatter (SSC) dot plot, en een morfologisch homogene populatie van cellen werd geïdentificeerd. Een dergelijke populatie werd weergegeven op een FSC-Area/FSC-Height dot plot, en enkele cellen werden gated en geanalyseerd voor de oppervlakte-expressie van CD31 (hiërarchische gatingstrategie, niet getoond). In het beste geval werden ~70% zuivere HLMVEC enkelcellige cellen (figuur 3A,B) verkregen. Van belang is dat de HLMVEC-opbrengst aanzienlijk werd verminderd wanneer het monster niet onmiddellijk na de operatie werd verwerkt of wanneer de donor bejaard of een roker was.
Om zuiverdere HLMVEC-preparaten te verkrijgen, werden de CD31+ cellen gesorteerd en gezaaid in 1,5% gelatine-gecoate kweekplaten. De gesorteerde cellen namen de karakteristieke endotheelachtige vorm aan (figuur 3C) en zoals gerapporteerd in figuur 3D, toonde confocale microscopie aan dat bijna 100% van de FACS-gezuiverde cellen positief kleurde voor EC-antigenen, namelijk CD31 en de meer specifieke von Willebrand-factor (vWF)23. Bovendien, toen deze cellen in Matrigel werden gezaaid, genereerden ze buisvormige structuren, evenals HUVECs (figuur 3E), waardoor hun endotheelfenotype werd bevestigd.
Figuur 1: Schematische weergave van de procedure. Het stroomdiagram toont de procedure voor endotheelcelisolatie en niet-endotheelcelverwijdering. Elke stap vat de gebeurtenissen samen die worden beschreven in stap 2-6 van het experimentele protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van de geoptimaliseerde EG-isolatieprocedure. (A) Representatief beeld van een longparenchymmonster dat vóór de collagenasevertering in kleine fragmenten is gesneden (links) en geïncubeerd in een buis van 15 ml met 5 ml collagenase type 2 (rechts). (B) Schematische (links) en werkelijke (rechts; vergroting: 100x) weergave van de celpopulaties verkregen na collagenasevertering. Deze populaties omvatten singlets van niet-EC's en EC's, groepen EC's en groepen niet-EC's gebonden aan vezels, die worden verwijderd met behulp van zeven. (C) Seriële filtraties met behulp van metalen zeven mazen van 70 μm en 40 μm. (D) Afbeelding van de buis van 50 ml na centrifugeren bij lage snelheid en vóór het scheiden van de supernatanten van de pellets in "buis 1" en "buis 2". Celclusters bevinden zich in de pellet, terwijl de afzonderlijke cellen zich meestal in het supernatant bevinden. (E) afbeelding van de verschillende kleuren en samenstellingen van de pellet en de geïsoleerde cellen van "buis 1" (boven) en "buis 2" (onder); Vergroting: 100x. Afkorting: EC = endotheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: HLMVEC fenotypische en functionele karakterisering . (A) Een gemengde celpopulatie verkregen uit een longparenchymexplant. (B) CD31-detectie door flowcytometrie op het oppervlak van cellen aan het einde van de eerste passage. Het zuiverheidspercentage (70%) verwijst naar de gebruikte hiërarchische gatingstrategie. (C) Zuivere HLMVEC's na live-sortering op het CD31-antigeen. (D) Representatieve immunofluorescentie confocale microscopische beelden van CD31 (links) en vWF (rechts) positieve kleuring (schaalbalk: 50 μm). (E) Brightfield-beelden werden 6 uur na het zaaien van HUVECs of HLMVECs op Matrigel vastgelegd.Vergroting (A, C, E): 100x. Afkortingen: HLMVECs = menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vele rollen die vasculaire endotheelcellen spelen in de menselijke pathofysiologie maken deze cellen een onmisbaar hulpmiddel voor in vitro pathogenetische en farmacologische studies. Aangezien EC's van verschillende vasculaire locaties / organen eigenaardige kenmerken en functies vertonen, zou de beschikbaarheid van gezonde en zieke EC's van het orgaan van belang ideaal zijn voor onderzoeksdoeleinden. HLMVECs zijn bijvoorbeeld essentieel voor studies naar longontsteking; Daarom zal een methodologie voor de hoogrenderende, zeer zuivere isolatie van deze cellen verschillende onderzoeksgebieden ten goede komen.
Methoden om HLMVECs te isoleren zijn gemeld door verschillende groepen 10,11,12,14,15,17,18,19. Elke methode heeft innovatieve benaderingen geïntroduceerd, zoals celsortering met magnetische kralen 11,12,15,17,18 of mechanische dissociatie met behulp van een stompe canule17,18. Het huidige protocol was ontworpen om de kleine eilandjes van endotheelcellen verkregen na collagenasevertering te verzamelen en gebruikte op sedimentatietijd gebaseerde seriële centrifugaties om de zuiverheid van de EC's in de initiële gemengde celpopulatie te verhogen. Dit punt is cruciaal omdat hogere startcelaantallen betekenen dat lagere aantallen in vitro expansies nodig zijn om het aantal cellen te bereiken dat nodig is voor de experimenten, wat op zijn beurt betekent dat meer onderzoeken kunnen worden voltooid voordat de EC's senesce. Dit aspect is strikt gerelateerd aan de mate van zuiverheid van de HLMVEC-isolaten, wat ook relevant is voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Bovendien, als het longmonster zeer klein is en er geen mogelijkheid is om EC-sortering onmiddellijk na de explant uit te voeren, wat in onze ervaring het meest voorkomende scenario was, zullen de verontreinigende SMC's sneller groeien dan de EC's, waardoor de cultuur wordt overgenomen en de opbrengst van EC's na celsortering wordt verminderd.
In deze studie hebben we geprobeerd deze punten aan te pakken. Hiervoor werd aanvankelijk gecontroleerd wat er met de longmonsters gebeurde na collagenasevertering en werd significante besmetting geïdentificeerd door verschillende celtypen, met name SMC's (figuur 2), die snel groeien en HLMVEC's in gemengde culturen kunnen inhalen. Daarom werd een strategie opgesteld om deze verontreiniging onmiddellijk na de vertering te minimaliseren (figuur 1 en figuur 2). Opmerkelijk is dat HLMVECs met ~70% zuiverheid (figuur 3A,B) consistent werden verkregen in de eerste isolatiefase. Dit uitstekende resultaat vergemakkelijkte de daaropvolgende zuiveringsstap door FACS, wat leidde tot het uiteindelijke resultaat van het verkrijgen van vrijwel zuivere, functionele HLMVECs (figuur 3C-E). Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer longslagadersegmenten werden gebruikt als uitgangsmateriaal en HPAEC's de geïsoleerde cellen waren, wat betekent dat deze methodologie een verbetering vertegenwoordigt van de eerder gerapporteerde methodologie8.
Hoewel eenvoudig en reproduceerbaar, heeft deze procedure belangrijke vereisten. We slaagden er bijvoorbeeld in om HLMVEC-isolatie te bereiken door alleen longfragmenten te verwerken die binnen 3-6 uur na chirurgische excisie waren verkregen, terwijl langere intervallen geassocieerd waren met slechte resultaten (gegevens niet getoond). De collagenaseverteringstijd zou ook variabiliteit in de EC-opbrengst kunnen introduceren als gevolg van de lot-tot-partij variaties in enzymatische activiteit24. Een ander kritiek punt heeft betrekking op de toestand van de steekproef. Longparenchym afkomstig van rokers of oudere donoren gaf lage HLMVEC-opbrengsten. Bovendien kan het supernatant van centrifugeren bij lage snelheid enkele aggregaten bevatten die worden overgebracht naar "buis 2". Om deze reden wordt aanbevolen om de inhoud van "buis 1" en "buis 2" in cultuur te houden, althans tijdens het vroege stadium van celisolatie. Het direct sorteren van CD31+ cellen, zoals eerder beschreven in EC isolatieprotocollen 11,12,15,17,18, kan ook een goede oplossing zijn om de zuiverheid vanaf het begin te verhogen. We hebben deze vroege sorteerfase niet toegepast vanwege de kleine omvang van de geanalyseerde monsters. Deze mogelijkheid zal echter in de toekomst worden getest bij de implementatie van het protocol.
Een eenvoudig en betrouwbaar isolatieprotocol voor het isoleren van HLMVEC's en HPAEC's zal onderzoekers aanmoedigen om deze route te gebruiken om cellen te verkrijgen voor hun studies, vooral wanneer deze cellen niet commercieel beschikbaar zijn. Het isoleren van HLMEC's uit CF-longen zal bijvoorbeeld de bouw van een volledige CF-luchtweg op een chip25 mogelijk maken. Bovendien zal het maken van een eigen EC-collectie onderzoekers in staat stellen om meer experimenten te plannen en uit te voeren tegen lagere kosten.
Kortom, deze methode, die enkele kritieke punten oplost die kunnen optreden tijdens EC-isolatie van chirurgische monsters, verbetert de bestaande methoden, waardoor onderzoek naar EC-pathobiologie en ontsteking wordt vergemakkelijkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen van het Italiaanse ministerie van de Universiteit en Onderzoek (ex 60% 2021 en 2022) aan R. P. en door subsidies van de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC # 23/2014) en van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (L548/93) aan M. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A.
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G.
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D.
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
