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Biology

Aislamiento y purificación de células endoteliales microvasculares y macrovasculares a partir de muestras derivadas de pulmón

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64885
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 2,3, 1, 4, 4,5, 1,2, 2,3, 1, 6,7, 1, 1,2
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

Aunque es un desafío, el aislamiento de las células endoteliales pulmonares es esencial para los estudios sobre la inflamación pulmonar. El presente protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de células endoteliales macrovasculares y microvasculares.

Abstract

La disponibilidad de células aisladas de tejidos y órganos sanos y enfermos representa un elemento clave para los enfoques de medicina personalizada. Aunque los biobancos pueden proporcionar una amplia colección de células primarias e inmortalizadas para la investigación biomédica, estos no cubren todas las necesidades experimentales, particularmente las relacionadas con enfermedades o genotipos específicos. Las células endoteliales vasculares (CE) son componentes clave de la reacción inflamatoria inmune y, por lo tanto, desempeñan un papel central en la patogénesis de una variedad de trastornos. En particular, las CE de diferentes sitios muestran diferentes propiedades bioquímicas y funcionales, lo que hace que la disponibilidad de tipos específicos de EC (es decir, macrovascular, microvascular, arterial y venosa) sea esencial para diseñar experimentos confiables. Aquí, se ilustran en detalle procedimientos simples para obtener células endoteliales macrovasculares y microvasculares humanas de alto rendimiento, prácticamente puras, a partir de la arteria pulmonar y el parénquima pulmonar. Esta metodología puede ser fácilmente reproducida a un costo relativamente bajo por cualquier laboratorio para lograr la independencia de las fuentes comerciales y obtener fenotipos/genotipos EC que aún no están disponibles.

Introduction

El endotelio vascular recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos. Desempeña un papel clave en la regulación de la coagulación sanguínea, el tono vascular y las respuestas inmunoinflamatorias 1,2,3,4. Aunque el cultivo de células endoteliales (CE) aisladas de especímenes humanos es esencial para fines de investigación, debe señalarse que las CE de diferentes vasos sanguíneos (arterias, venas, capilares) tienen funciones específicas. Estos no pueden ser completamente recapitulados por las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), que son fácilmente disponibles y ampliamente utilizadas en estudios sobre fisiopatología del endotelio vascular 5,6. Por ejemplo, las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) desempeñan un papel clave en la inflamación pulmonar al controlar el reclutamiento y la acumulación de leucocitos 4,7. Por lo tanto, un entorno experimental dirigido a reproducir la inflamación pulmonar con alta fidelidad debe incluir HLMVEC. Por otro lado, la disfunción EC se puede observar en varias patologías; por lo tanto, las CE del paciente son fundamentales para construir un modelo in vitro confiable de la enfermedad. Por ejemplo, el aislamiento de fragmentos de CE de la arteria pulmonar (HPAECs), diseccionados de los pulmones explantados de personas afectadas por fibrosis quística (FQ), nos ha permitido descubrir mecanismos de disfunción endotelial en esta enfermedad 8,9.

Por lo tanto, los protocolos destinados a optimizar el aislamiento de CE de diferentes fuentes / órganos también en estados de enfermedad son esenciales para proporcionar a los investigadores herramientas de investigación valiosas, particularmente cuando estas herramientas no están disponibles comercialmente. Los protocolos de aislamiento HLMVEC y HPAEC han sido reportados previamente 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. En todos los casos, la digestión enzimática de las muestras pulmonares dio lugar a poblaciones de células mixtas, que se purificaron utilizando medios selectivos ad hoc y perlas magnéticas o clasificación celular basada en citometría. Las optimizaciones adicionales de estos protocolos deben abordar dos problemas principales en el aislamiento de CE: (1) contaminación celular y tisular, que debe resolverse lo antes posible en los pasajes de cultivo para minimizar la senescencia replicativa EC20; y 2) el bajo rendimiento de las cepas primarias de CE.

Este estudio describe un nuevo protocolo para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de HLMVEC y HPAEC. Este procedimiento puede ser fácilmente aplicable y proporcionar CE macrovasculares y microvasculares prácticamente puras en unos pocos pasos.

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Protocol

Este estudio fue aprobado y el protocolo siguió las directrices del comité de ética en investigación humana de la Universidad de Chieti-Pescara (#237_2018bis). La Figura 1 ilustra el aislamiento de células endoteliales de segmentos (1-3 cm de largo) de parénquima pulmonar o arteria pulmonar de sujetos humanos no identificados (con consentimiento escrito) sometidos a cirugía torácica por diversas razones, como neumotórax o lobectomía. En este último caso, los cirujanos también recolectaron un segmento de la arteria pulmonar. En particular, los cirujanos recibieron instrucciones precisas para recolectar muestras libres de cáncer. El protocolo presentado fue optimizado para obtener el mayor rendimiento y pureza posibles.

1. Preparación experimental

  1. Reconstitución de colagenasa
    1. Disuelva el polvo de colagenasa en solución salina tamponada con fosfato sin CaCl 2 y MgCl 2 (PBS−−, ver Tabla de materiales) a una concentración de2 mg/ml, y filtre la solución usando un filtro de poros de 0,22 μm.
    2. Preparar 5 ml de alícuotas y almacenarlas a −20 °C. Descongelar y precalentar las alícuotas a 37 °C antes de su uso.
  2. Revestimiento de placas
    1. Para el recubrimiento de la placa, pipetear una solución de gelatina al 1,5% o 50 μg/ml de fibronectina (ver Tabla de materiales) en la placa de cultivo (500 μL es suficiente para cubrir la superficie de cada pocillo de una placa de 6 pocillos) e incubar durante 1 h a 37 °C.
    2. Después de la incubación, retire el exceso de gelatina y lave los pocillos con PBS−−. Aspire el PBS−−, y deje que la placa se seque en una campana estéril.
      NOTA: Para la reconstitución de la gelatina, disolver el polvo en agua para hacer una solución al 1,5%, luego autoclave, y almacenar a 4 °C. La gelatina al 1,5% no es líquida a 4 °C; Por lo tanto, debe calentarse antes del recubrimiento de la placa. Alternativamente, cualquier solución de gelatina comercial adecuada para cultivos celulares se puede utilizar para el recubrimiento de placas.

2. Preparación de la muestra

  1. Parénquima pulmonar
    1. Lave las muestras recolectadas sumergiéndolas en un tubo de 50 ml que contenga PBS−−.
    2. Transfiera las muestras a una placa de Petri estéril y corte manualmente la muestra con tijeras quirúrgicas (tamaño óptimo: >2 cm) en pequeños fragmentos de aproximadamente 3-4 mm cada uno.
  2. Segmento(s) arterial(es)
    1. Lave las muestras recolectadas sumergiéndolas en un tubo de 50 ml que contenga PBS−−.
    2. Transfiéralo a una placa de Petri estéril sin cortar, ya que la fragmentación aumentará el área de superficie de la sección transversal del segmento arterial, aumentando así la posibilidad de aislar los no CE.

3. Digestión enzimática

  1. Lave el parénquima pulmonar cortado en cubitos o el segmento o segmentos de la arteria pulmonar dos veces con PBS−−. Este paso eliminará una gran parte de la sangre residual.
  2. Colocar las muestras en tubos de 15 ml e incubar con 5 ml de colagenasa tipo 2 (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C y 5% deCO2. Durante esta incubación, la degradación de la matriz extracelular libera células individuales y agregados celulares.

4. Recuperación de las células digeridas

  1. Coloque un colador estéril de acero/metal (es decir, un colador de té con un tamaño de malla de ~ 1 mm) en la parte superior de un tubo de recolección de 50 ml.
  2. Vierta todo el contenido del tubo de 15 ml en el colador, masajee suavemente el tejido digerido con una espátula y enjuague la muestra con PBS−− hasta que se llene el tubo de recolección.
    NOTA: Este paso eliminará grandes fragmentos de tejido en la escala milimétrica, asegurando una mayor eficiencia de los pasos de filtración posteriores.

5. Eliminación no EC por filtración

  1. Filtrar el flujo de salida recogido en el paso 4.2 utilizando un filtro celular con un tamaño de malla de 70 μm y recoger el flujo de salida en un tubo fresco de 50 ml.
  2. Luego, use un filtro celular con un tamaño de malla de 40 μm y recoja el flujo de salida en un tubo fresco de 50 ml. Etiquete este tubo como "tubo 1".
    NOTA: Estas filtraciones de los pasos 5.1 y 5.2 eliminarán los agregados de células grandes, que a menudo están compuestos por poblaciones de células mixtas.

6. Sedimentación de grupos celulares y siembra celular

  1. Centrifugar las muestras a 30 x g durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar los grupos de células.
  2. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta estéril (no lo vierta) y colóquelo en un tubo fresco de 50 ml ("tubo 2").
  3. Suspenda el pellet en el "tubo 1" y llene el tubo hasta 50 ml con PBS−−. Llene el "tubo 2" hasta 50 ml con PBS−−.
    NOTA: A partir de este paso, ambos tubos se tratan de la misma manera.
  4. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Suspender los gránulos con 2 ml de medio de cultivo (ver Tabla de materiales) y sembrar la suspensión en dos pocillos separados de una placa prerecubierta de 6 pocillos (paso 1.2).
    NOTA: A partir de este paso, alimentar las células cada 2 días con el medio de cultivo hasta que alcancen la confluencia (aproximadamente 1 semana, dependiendo del tamaño de la muestra) con el fin de obtener un número razonable de células para la clasificación.

7. Expansión celular

  1. Lave las células con 2 ml de PBS con CaCl 2 y MgCl2 (PBS++, ver Tabla de materiales) para eliminar las células sanguíneas residuales (el uso de PBS++ es importante para evitar el desprendimiento celular).
  2. Elimine el PBS++ y agregue un medio de cultivo fresco.
  3. Repita los pasos 7.1 y 7.2 hasta que las células alcancen la confluencia (aproximadamente 1 semana, dependiendo del tamaño de la muestra).

8. Clasificación celular

  1. Separar las células utilizando 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%, ver Tabla de materiales), centrifugar y resuspender el pellet con 190 μL de PBS−−.
  2. Añadir 10 μL de un anticuerpo anti-FITC antihumano conjugado fluorescente (dilución 1:20, ver Tabla de materiales) e incubar la suspensión celular a 4 °C durante 30 min.
  3. Lave las células con 10 ml de PBS−−, centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y resuspender el pellet en 300 μL de PBS−−.
  4. Aislar y recolectar células CD31 positivas (CD31+) mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), utilizando una boquilla de 100 μm, y recogerlas en un tubo.
    1. Según la estrategia de compuerta, primero defina la morfología celular utilizando los parámetros del área de dispersión lateral, SSC-A y FSC-A. Luego, seleccione celdas individuales usando un diagrama de puntos FSC-Area/FSC-Height o SSC-Area/SSC-Height, defina las celdas positivas en la muestra marcada frente a la muestra de control no teñida y dirija las células fluorescentes al tubo de recolección21.
  5. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, y suspender el pellet en 2 ml de medio de crecimiento para sembrar en los pocillos pre-recubiertos de una placa de 6 pocillos.

9. Expansión posterior a la clasificación

  1. Dos días después de la clasificación celular, reemplace el medio acondicionado con un medio de crecimiento fresco.
  2. Repita los pasos 7.1 y 7.2 cada 2 días para la expansión celular.

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Representative Results

Aislamiento HLMEC
El principal problema durante el aislamiento de HLMVEC es la presencia de células contaminantes, ya que los capilares microscópicos no se pueden separar fácilmente del tejido estromal. Por lo tanto, lograr la mayor pureza posible en las primeras etapas del proceso de aislamiento es crucial para reducir los pasajes de cultivo y, por lo tanto, el envejecimiento celular. Del mismo modo, un protocolo de aislamiento óptimo debe proporcionar el mayor rendimiento posible de HLMVEC puros. Para lograr estos objetivos, se estableció un nuevo procedimiento basado en los protocolos descritos anteriormente 10,11,12,14,15.

Aunque el parénquima pulmonar está altamente vascularizado, lo que representa una excelente fuente de HLMVEC, está poblado en gran medida por células musculares lisas (SMC), fibras de colágeno y fibroblastos. Estas células, especialmente las SMC, pueden adaptarse a una variedad de medios de cultivo y, en casi todos los casos, replicarse in vitro mucho más rápido que otras poblaciones celulares, lo que significa que se hacen cargo del cultivo celular mixto. Por lo tanto, nuestra primera preocupación fue calibrar la digestión enzimática del parénquima para reducir el arrastre de células no deseadas. Dado que la colagenasa tipo 2 separa rápidamente grupos de células endoteliales del resto del capilar, razonamos que el tiempo de digestión de la muestra de pulmón podría ser crucial para minimizar la contaminación celular. Por lo tanto, como primer paso, el tiempo de exposición a la colagenasa del fragmento pulmonar extirpado se redujo a un máximo de 10 min en lugar de los 20 min15 sugeridos (Figura 2A). Después de este tratamiento, se observó que parte de los agregados celulares, incluidos los SMC y los fibroblastos, todavía estaban unidos a fibras largas (Figura 2B), mientras que los SMC representaban la mayoría de los singletes de células no sanguíneas. También se observaron grupos pequeños y compactos de células, con diámetros que generalmente no exceden los 10-20 μm, sin elementos atribuibles a fragmentos de tejido estromal (es decir, fibras grandes) (Figura 2B). Se planteó la hipótesis de que estos agregados de células pequeñas podrían estar compuestos principalmente de HLMVEC.

Siguiendo esta hipótesis, se llevaron a cabo pasos de filtración en serie para maximizar la recuperación del HLMVEC. Para la primera filtración, se utilizó un colador de metal y se masajeó la muestra con pinzas para facilitar el escape de HLMVEC de los capilares (Figura 2C, derecha). El objetivo de este paso era eliminar los grandes grupos de células musculares lisas y fibroblastos que aún están unidos a la matriz extracelular. Luego, el flujo de salida se filtró utilizando una secuencia de filtros de tamaño de malla de 70 μm y 40 μm para eliminar los agregados grandes residuales, aunque no visibles a los ojos (Figura 2C, centro, izquierda). Para eliminar los singletes celulares, las muestras se centrifugaron a 30 x g durante 5 min, una velocidad que sedimenta células y agregados con un diámetro >7-10 μm, dejando así las celdas más pequeñas en suspensión. Estos parámetros de centrifugación fueron elegidos con base en los reportados por Miron et al. para la peletización de células sanguíneas circulantes22. En particular, después de esta centrifugación, el sobrenadante era de color rojo (Figura 2D), lo que indica la presencia de muchos glóbulos rojos (~ 5 μm de diámetro). En este punto, el sobrenadante se retiró cuidadosamente y se colocó en un segundo tubo. Ambos tubos que contenían el sobrenadante y el pellet se llenaron con PBS−− y se centrifugaron a 300 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, el tubo que contenía el sobrenadante mostró un pellet rojo enriquecido en células sanguíneas, lo que sugiere que también contenía la mayoría de los singletes celulares explantados (Figura 2E, derecha).

Los pellets obtenidos se suspendieron con el medio de crecimiento de células endoteliales y se sembraron por separado en dos pocillos de una placa de 6 pocillos, que se recubrieron previamente con gelatina al 1,5% de piel porcina (Figura 2E, centro). Después de 3 días, las células se lavaron con PBS ++, se alimentaron con medio fresco y se obtuvieron imágenes. Como se muestra a la izquierda de la Figura 2E, las islas EC fueron más abundantes en el pozo que contenía las células del "tubo 1" (arriba), mientras que el pozo que contenía las células del "tubo 2" (abajo) estaba poblado principalmente por células individuales y no endoteliales.

El mismo procedimiento se aplicó al protocolo de aislamiento HPAEC menos desafiante que se informó en nuestro trabajo anterior, en el que la separación HPAEC implicó explotar su menor tiempo de adhesión en comparación con el de las células contaminantes8. Debido a su gran tamaño, las arterias se pueden limpiar fácilmente de los tejidos conectivos y grasos residuales, eliminando así una gran proporción de no CE. Sin embargo, una gran proporción de fibroblastos y fibras de matriz extracelular todavía estaba presente en las muestras en esta etapa, además de las SMC vasculares8. El nuevo procedimiento aumentó aún más la pureza EC inicial durante los explantes HPAEC (resultados no mostrados).

Purificación y caracterización fenotípica y funcional de HLMVEC recién aislados
Al final del protocolo de aislamiento, se analizó la pureza de los HLMVEC mediante la detección por citometría de flujo de la membrana celular CD31. Para identificar correctamente el compartimiento celular CD31+, se estableció una puerta en un diagrama de puntos de dispersión directa (FSC)/dispersión lateral (SSC), y se identificó una población morfológicamente homogénea de células. Dicha población se representó en un diagrama de puntos FSC-Area/FSC-Height, y las células individuales fueron cerradas y analizadas para la expresión superficial de CD31 (estrategia jerárquica de compuerta, no mostrada). En el mejor de los casos, se obtuvieron ~ 70% de células individuales HLMVEC puras (Figura 3A, B). Cabe destacar que el rendimiento de HLMVEC se redujo significativamente cuando la muestra no se procesó inmediatamente después de la cirugía o cuando el donante era anciano o fumador.

Para obtener preparaciones HLMVEC más puras, las células CD31+ se clasificaron y sembraron en placas de cultivo recubiertas de gelatina al 1,5%. Las células clasificadas asumieron la forma endotelial característica (Figura 3C), y como se informa en la Figura 3D, la microscopía confocal mostró que casi el 100% de las células purificadas con FACS se tiñeron positivas para antígenos CE, a saber, CD31 y el factor de von Willebrand (vWF) más específico23. Además, cuando estas células fueron sembradas en Matrigel, generaron estructuras tubulares, así como HUVECs (Figura 3E), confirmando así su fenotipo endotelial.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del procedimiento. El diagrama de flujo muestra el procedimiento para el aislamiento de células endoteliales y la eliminación de células no endoteliales. Cada paso recapitula los eventos descritos en los pasos 2-6 del protocolo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración del procedimiento optimizado de aislamiento CE. (A) Imagen representativa de una muestra de parénquima pulmonar cortada en pequeños fragmentos antes de la digestión de la colagenasa (izquierda) e incubada en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de colagenasa tipo 2 (derecha). (B) Representación esquemática (izquierda) y real (derecha; aumento: 100x) de las poblaciones celulares obtenidas después de la digestión de la colagenasa. Estas poblaciones incluyen singletes de no CE y CE, grupos de CE y grupos de no CE unidos a fibras, que se eliminan utilizando filtros. (C) Filtraciones en serie utilizando filtros de malla metálicos de 70 μm y 40 μm. (D) Imagen del tubo de 50 ml después de la centrifugación a baja velocidad y antes de separar los sobrenadantes de los pellets en el "tubo 1" y el "tubo 2". Los grupos de células están contenidos en el pellet, mientras que las células individuales están contenidas principalmente en el sobrenadante. (E) Imagen que muestra los diferentes colores y composiciones del pellet y las celdas aisladas del "tubo 1" (arriba) y el "tubo 2" (abajo); Aumento: 100x. Abreviatura: EC = células endoteliales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Caracterización fenotípica y funcional del HLMVEC . (A) Una población celular mixta obtenida de un explante de parénquima pulmonar. (B) Detección de CD31 por citometría de flujo en la superficie de las células al final del primer paso. El porcentaje de pureza (70%) se refiere a la estrategia de cierre jerárquico utilizada. (C) HLMVEC puros después de ser clasificados en vivo para el antígeno CD31. (D) Imágenes microscópicas confocales representativas de inmunofluorescencia de tinción positiva CD31 (izquierda) y vWF (derecha) (barra de escala: 50 μm). (E) Las imágenes de campo claro se capturaron 6 h después de sembrar HUVECs o HLMVECs en Matrigel.Ampliación (A, C, E): 100x. Abreviaturas: HLMVECs = células endoteliales microvasculares pulmonares humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las múltiples funciones desempeñadas por las células endoteliales vasculares en la fisiopatología humana hacen de estas células una herramienta indispensable para los estudios patogénicos y farmacológicos in vitro . Dado que las CE de diferentes sitios vasculares / órganos muestran características y funciones peculiares, la disponibilidad de CE sanas y enfermas del órgano de interés sería ideal para fines de investigación. Por ejemplo, los HLMVEC son esenciales para los estudios sobre la inflamación pulmonar; Por lo tanto, una metodología para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de estas células beneficiará a diversos campos de investigación.

Los métodos para aislar HLMVEC han sido reportados por varios grupos 10,11,12,14,15,17,18,19. Cada método ha introducido enfoques innovadores, como la clasificación celular con perlas magnéticas 11,12,15,17,18 o la disociación mecánica utilizando una cánula roma17,18. El presente protocolo fue diseñado para recolectar los pequeños islotes de células endoteliales obtenidos después de la digestión de la colagenasa y utilizó centrifugaciones en serie basadas en el tiempo de sedimentación para aumentar la pureza de las CE en la población inicial de células mixtas. Este punto es crucial ya que un mayor número de células iniciales significa que se necesita un menor número de expansiones in vitro para alcanzar el número de células requeridas para los experimentos, lo que, a su vez, significa que se pueden completar más investigaciones antes de la senescencia de la CE. Este aspecto está estrictamente relacionado con el grado de pureza de los aislados HLMVEC, que también es relevante para obtener resultados confiables. Además, si la muestra de pulmón es muy pequeña en tamaño y no hay posibilidad de realizar la clasificación EC inmediatamente después del explante, que era, en nuestra experiencia, el escenario más frecuente, los SMC contaminantes crecerán más rápido que los CE, asumiendo así el cultivo y reduciendo el rendimiento de los EC después de la clasificación celular.

En este estudio, tratamos de abordar estos puntos. Para esto, lo que sucedió con las muestras de pulmón después de la digestión de la colagenasa se monitoreó inicialmente, y se identificó una contaminación significativa por diferentes tipos de células, particularmente SMC (Figura 2), que crecen rápidamente y pueden superar a HLMVEC en cultivos mixtos. Por lo tanto, se estableció una estrategia para minimizar esta contaminación inmediatamente después de la digestión (Figura 1 y Figura 2). Sorprendentemente, los HLMVEC con ~ 70% de pureza (Figura 3A, B) se obtuvieron consistentemente en la primera fase de aislamiento. Este excelente resultado facilitó el paso posterior de purificación por el FACS, lo que llevó al resultado final de obtener HLMVEC virtualmente puros y funcionales (Figura 3C-E). Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizaron segmentos de la arteria pulmonar como material de partida y las HPAEC fueron las células aisladas, lo que significa que esta metodología representa una mejora de la metodología reportada anteriormente8.

Aunque simple y reproducible, este procedimiento tiene requisitos clave. Por ejemplo, tuvimos éxito en el aislamiento del HLMVEC al procesar sólo los fragmentos pulmonares obtenidos dentro de las 3-6 h de la escisión quirúrgica, mientras que los intervalos más largos se asociaron con resultados deficientes (datos no mostrados). El tiempo de digestión de la colagenasa también podría introducir variabilidad en el rendimiento de la CE debido a las variaciones de lote a lote en la actividad enzimática24. Otro punto crítico se relaciona con la condición de la muestra. El parénquima pulmonar derivado de fumadores o donantes ancianos dio rendimientos bajos de HLMVEC. Además, el sobrenadante de la centrifugación a baja velocidad puede contener algunos agregados que se transfieren al "tubo 2". Por esta razón, se recomienda mantener el contenido de "tubo 1" y "tubo 2" en cultivo, al menos durante la etapa temprana del aislamiento celular. La clasificación directa de las células CD31+, como se describió anteriormente en los protocolos de aislamiento CE 11,12,15,17,18, también puede representar una buena solución para aumentar la pureza desde el principio. No aplicamos esta etapa temprana de clasificación debido al pequeño tamaño de las muestras analizadas. Sin embargo, esta posibilidad se probará en el futuro en la implementación del protocolo.

Un protocolo de aislamiento simple y confiable para aislar HLMVEC y HPAEC alentará a los investigadores a utilizar esta ruta para obtener células para sus estudios, particularmente cuando estas células no están disponibles comercialmente. Por ejemplo, aislar los HLMEC de los pulmones de FQ permitirá la construcción de una vía aérea completa de FQ en un chip25. Además, hacer su propia colección de EC permitirá a los investigadores planificar y ejecutar más experimentos a un costo menor.

En conclusión, este método, que resuelve algunos puntos críticos que pueden ocurrir durante el aislamiento de CE de muestras quirúrgicas, mejora los métodos existentes, facilitando así la investigación sobre patobiología e inflamación de la CE.

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Disclosures

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo sin ninguna relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos del Ministerio italiano de Universidad e Investigación (ex 60% 2021 y 2022) a R. P. y por subvenciones de la Fundación Italiana de Fibrosis Quística (FFC # 23 / 2014) y del Ministerio de Salud italiano (L548/93) a M. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X GIBCO 25300-054 Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59 Dako M0823 Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody Thermo Fisher Scientific MA5-14029 Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors Any Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm Corning 431750 Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm Corning 431751 Using during the first filtration
Collagenase, Type 2 Worthington LS004177 Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody BD Biosciences 555445 Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8537 Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell C-22020 HLMVEC growth medium
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895 Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A Sigma-Aldrich G2500 Used for plate coating
Type A gelatin Sigma-Aldrich g-2500 Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
  3. Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
  4. Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
  5. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
  6. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
  7. Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
  8. Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
  9. Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
  10. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
  11. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
  12. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  13. Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
  14. Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
  15. Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
  16. Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
  17. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
  18. Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
  19. Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
  20. Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  22. Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
  23. Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
  24. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  25. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).

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Este mes en JoVE Número 192 Células endoteliales explante endotelio pulmones aislamiento celular inflamación
Aislamiento y purificación de células endoteliales microvasculares y macrovasculares a partir de muestras derivadas de pulmón
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Plebani, R., D'Alessandro, A., Lanuti, P., Simeone, P., Cinalli, M., Righi, I., Palleschi, A., Mucci, M., Marchisio, M., Cappabianca, F., Camera, M., Mucilli, F., Romano, M. Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples. J. Vis. Exp. (192), e64885, doi:10.3791/64885 (2023).

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