Summary
Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.
Abstract
Sağlıklı ve hastalıklı doku ve organlardan izole edilen hücrelerin mevcudiyeti, kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için kilit bir unsurdur. Biyobankalar, biyomedikal araştırmalar için geniş bir birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre koleksiyonu sağlayabilse de, bunlar tüm deneysel ihtiyaçları, özellikle de belirli hastalıklar veya genotiplerle ilgili olanları kapsamaz. Vasküler endotel hücreleri (ECs), immün inflamatuar reaksiyonun anahtar bileşenleridir ve bu nedenle çeşitli hastalıkların patogenezinde merkezi bir rol oynamaktadır. Özellikle, farklı bölgelerden gelen EC'ler farklı biyokimyasal ve fonksiyonel özellikler göstererek, güvenilir deneyler tasarlamak için spesifik EC tiplerinin (yani makrovasküler, mikrovasküler, arteriyel ve venöz) kullanılabilirliğini gerekli kılar. Burada, pulmoner arter ve akciğer parankiminden yüksek verimli, neredeyse saf insan makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücreleri elde etmek için basit prosedürler ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bu metodoloji, ticari kaynaklardan bağımsızlık elde etmek ve henüz mevcut olmayan EC fenotiplerini / genotiplerini elde etmek için herhangi bir laboratuvar tarafından nispeten düşük bir maliyetle kolayca çoğaltılabilir.
Introduction
Vasküler endotel, kan damarlarının iç yüzeyini kaplar. Kan pıhtılaşmasının, vasküler tonusun ve immün-inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde anahtar rol oynar 1,2,3,4. İnsan örneklerinden izole edilen endotel hücrelerinin (ECs) kültürü araştırma amaçları için gerekli olmasına rağmen, farklı kan damarlarından (arterler, damarlar, kılcal damarlar) gelen EC'lerin spesifik işlevleri olduğu belirtilmelidir. Bunlar, vasküler endotel patofizyolojisi ile ilgili çalışmalarda kolayca bulunabilen ve yaygın olarak kullanılan insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) tarafından tam olarak özetlenemez 5,6. Örneğin, insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (HLMVEC'ler), lökosit alımını ve birikimini kontrol ederek akciğer iltihabında anahtar rol oynamaktadır 4,7. Bu nedenle, akciğer iltihabını yüksek doğrulukla çoğaltmayı amaçlayan deneysel bir ortam, HLMVEC'leri içermelidir. Öte yandan, EC disfonksiyonu çeşitli patolojilerde görülebilir; Bu nedenle, hastadan alınan ECs, hastalığın güvenilir bir in vitro modelini oluşturmak için esastır. Örneğin, kistik fibrozdan (KF) etkilenen kişilerin eksplante akciğerlerinden diseke edilen ECs fragmanlarının pulmoner arterden (HPAEC'ler) izole edilmesi, bu hastalıkta endotel disfonksiyonunun mekanizmalarını ortaya çıkarmamızı sağlamıştır 8,9.
Bu nedenle, hastalık durumlarında da EC'lerin farklı kaynaklardan / organlardan izolasyonunu optimize etmeyi amaçlayan protokoller, araştırmacılara, özellikle bu araçlar ticari olarak mevcut olmadığında, değerli araştırma araçları sağlamak için gereklidir. HLMVEC ve HPAEC izolasyon protokolleri daha önce 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 olarak bildirilmiştir. Her durumda, akciğer örneklerinin enzimatik sindirimi, geçici seçici ortam ve manyetik boncuklar veya sitometrik tabanlı hücre sıralama kullanılarak saflaştırılan karışık hücre popülasyonları ile sonuçlandı. Bu protokollerin daha fazla optimizasyonu, EC izolasyonundaki iki ana konuyu ele almalıdır: (1) EC replikatif yaşlanmasını en aza indirmek için mümkün olan en erken kültür pasajlarında çözülmesi gereken hücre ve doku kontaminasyonu20; ve (2) birincil EC izolatlarının düşük verimi.
Bu çalışma, HLMVEC'lerin ve HPAEC'lerin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için yeni bir protokolü açıklamaktadır. Bu prosedür kolayca uygulanabilir ve birkaç adımda neredeyse saf makrovasküler ve mikrovasküler ECs verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma onaylandı ve protokol, Chieti-Pescara Üniversitesi (#237_2018bis) insan araştırma etik komitesinin yönergelerini izledi. Şekil 1, endotel hücrelerinin pulmoner parankim veya pulmoner arter segmentlerinden (1-3 cm uzunluğunda) pnömotoraks veya lobektomi gibi çeşitli nedenlerle göğüs cerrahisi geçiren tanımlanmamış insan deneklerden (yazılı rıza ile) izolasyonunu göstermektedir. Bu son durumda, cerrahlar ayrıca bir pulmoner arter segmenti topladılar. Özellikle, cerrahlara kansersiz örnekler toplamaları için doğru bir şekilde talimat verildi. Sunulan protokol, mümkün olan en yüksek verimi ve saflığı elde etmek için optimize edilmiştir.
1. Deneysel hazırlık
- Kollajenaz sulandırma
- Kollajenaz tozunu CaCl 2 ve MgCl2 (PBS−−, bakınız Malzeme Tablosu) olmadan fosfat tamponlu salin içinde2 mg/mL konsantrasyonda çözün ve çözeltiyi 0,22 μm gözenek filtresi kullanarak filtreleyin.
- 5 mL alikot hazırlayın ve bunları -20 ° C'de saklayın. Alikotları kullanımdan önce çözün ve 37 ° C'ye ısıtın.
- Plaka kaplama
- Plaka kaplama için, kültür plakasına pipet% 1.5 jelatin çözeltisi veya 50 μg / mL fibronektin (bakınız Malzeme Tablosu) (6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunun yüzeyini kaplamak için 500 μL yeterlidir) ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, fazla jelatini çıkarın ve kuyucukları PBS−− ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve plakanın steril bir başlıkta kurumasını bekleyin.
NOT: Jelatinin sulandırılması için,% 1.5'lik bir çözelti oluşturmak için tozu suda çözün, daha sonra otoklavlayın ve 4 ° C'de saklayın. % 1.5'teki jelatin, 4 ° C'de sıvı değildir; Bu nedenle, plaka kaplamadan önce ısıtılmalıdır. Alternatif olarak, hücre kültürleri için uygun herhangi bir ticari jelatin çözeltisi plaka kaplaması için kullanılabilir.
2. Numune hazırlama
- Akciğer parankimleri
- Toplanan numuneleri PBS−− içeren 50 mL'lik bir tüpe batırarak yıkayın.
- Numuneleri steril bir Petri kabına aktarın ve cerrahi makas (optimum boyut: >2 cm) kullanarak numuneyi her biri yaklaşık 3-4 mm'lik küçük parçalar halinde manuel olarak doğrayın.
- Arter segmenti/segmentleri
- Toplanan numuneleri PBS−− içeren 50 mL'lik bir tüpe batırarak yıkayın.
- Doğrama yapmadan steril bir Petri kabına aktarın, çünkü parçalanma arter segmentinin enine kesitinin yüzey alanını artıracak ve böylece EC olmayanları izole etme olasılığını artıracaktır.
3. Enzimatik sindirim
- Doğranmış akciğer parankimini veya pulmoner arter segmentini / s'yi PBS−− ile iki kez yıkayın. Bu adım, kalan kanın büyük bir bölümünü çıkaracaktır.
- Numuneleri 15 mL'lik tüplere yerleştirin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 5 mL tip 2 kollajenaz ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 5 CO2 ile inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, hücre dışı matrisin bozulması tek hücreleri ve hücre agregalarını serbest bırakır.
4. Sindirilmiş hücrelerin geri kazanılması
- 50 mL'lik bir toplama tüpünün üstüne steril bir çelik/metal süzgeç (yani, ~ 1 mm ağ boyutunda bir çay süzgeci) yerleştirin.
- Tüm içeriği 15 mL tüpten süzgecin üzerine dökün, sindirilmiş dokuya bir spatula ile hafifçe masaj yapın ve toplama tüpü dolana kadar numuneyi PBS ile durulayın.
NOT: Bu adım, milimetre ölçeğinde büyük doku parçalarını ortadan kaldıracak ve sonraki filtreleme adımlarının daha fazla verimliliğini sağlayacaktır.
5. Filtreleme ile EC olmayan giderim
- Adım 4.2'de toplanan çıkışı 70 μm ağ boyutunda bir hücre süzgeci kullanarak filtreleyin ve çıkışı yeni bir 50 mL tüpte toplayın.
- Ardından, 40 μm ağ boyutuna sahip bir hücre süzgeci kullanın ve çıkışı taze bir 50 mL tüpte toplayın. Bu tüpü "tüp 1" olarak etiketleyin.
NOT: Adım 5.1 ve adım 5.2'deki bu filtrelemeler, genellikle karışık hücre popülasyonlarından oluşan büyük hücre agregalarını kaldıracaktır.
6. Hücre kümelerinin çökelmesi ve hücre tohumlaması
- Hücre kümelerini çökeltmek için numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 30 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı steril bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın (dökmeyin) ve taze bir 50 mL tüpe ("tüp 2") yerleştirin.
- Peletleri "tüp 1" de askıya alın ve tüpü PBS−− ile 50 mL'ye kadar doldurun. 50 mL'ye kadar "tüp 2" yi PBS−− ile doldurun.
NOT: Bu adımdan itibaren, her iki tüp de aynı şekilde tedavi edilir. - Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
- Peletleri 2 mL büyüme ortamı ile askıya alın (bakınız Malzeme Tablosu) ve süspansiyonu önceden kaplanmış 6 delikli bir plakanın iki ayrı kuyucuğuna tohumlayın (adım 1.2).
NOT: Bu adımdan itibaren, sıralama için makul sayıda hücre elde etmek için hücreleri her 2 günde bir büyüme ortamıyla (numune büyüklüğüne bağlı olarak yaklaşık 1 hafta) birleşime ulaşana kadar besleyin.
7. Hücre genişlemesi
- Artık kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri CaCl 2 ve MgCl 2 (PBS ++, Malzeme Tablosuna bakınız) ile2 mL PBS ile yıkayın (PBS ++ kullanmak hücre ayrılmasını önlemek için önemlidir).
- PBS++'ı çıkarın ve taze kültür ortamı ekleyin.
- Hücreler akıcılığa ulaşana kadar adım 7.1 ve adım 7.2'yi tekrarlayın (örnek boyutuna bağlı olarak yaklaşık 1 hafta).
8. Hücre sıralama
- 500 μL tripsin-EDTA (% 0.05, bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak hücreleri ayırın, santrifüj yapın ve peleti 190 μL PBS−− ile yeniden askıya alın.
- 10 μL floresan konjuge anti-insan CD31-FITC antikoru ekleyin (1:20 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücreleri 10 mL PBS−− kullanarak yıkayın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve peletleri 300 μL PBS−− içinde tekrar askıya alın.
- CD31 pozitif (CD31+) hücreleri, 100 μm'lik bir nozul kullanarak floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile izole edin ve toplayın ve bunları bir tüpte toplayın.
- Geçit stratejisine göre, önce yan saçılma alanı parametreleri olan SSC-A ve FSC-A'yı kullanarak hücre morfolojisini tanımlayın. Ardından, FSC-Alan/FSC-Yükseklik veya SSC-Alan/SSC-Yükseklik nokta grafiğini kullanarak tek hücreleri seçin, işaretli numunedeki pozitif hücreleri lekesiz kontrol örneğine karşı tanımlayın ve floresan hücreleri toplama tüpü21'e yönlendirin.
- Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve peleti 6 delikli bir plakanın önceden kaplanmış kuyucuklarında tohumlamak için 2 mL büyüme ortamında askıya alın.
9. Sıralama sonrası genişletme
- Hücre sıralamasından iki gün sonra, şartlandırılmış ortamı taze büyüme ortamı ile değiştirin.
- Hücre genişlemesi için adım 7.1 ve adım 7.2'yi her 2 günde bir yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HLMEC izolasyonu
HLMVEC'lerin izolasyonu sırasındaki asıl sorun, mikroskobik kılcal damarlar stromal dokudan kolayca ayrılamadığı için kirletici hücrelerin varlığıdır. Bu nedenle, izolasyon sürecinin en erken aşamalarında mümkün olan en yüksek saflığa ulaşmak, kültür geçişlerini ve dolayısıyla hücre yaşlanmasını azaltmak için çok önemlidir. Benzer şekilde, optimal bir izolasyon protokolü, saf HLMVEC'lerin mümkün olan en yüksek verimini vermelidir. Bu hedeflere ulaşmak için, daha önce açıklanan 10,11,12,14,15 protokollerine dayanan yeni bir prosedür oluşturulmuştur.
Akciğer parankiminin yüksek oranda vaskülarize olmasına rağmen, bu nedenle mükemmel bir HLMVEC kaynağını temsil etmesine rağmen, büyük ölçüde düz kas hücreleri (SMC'ler), kollajen lifleri ve fibroblastlar tarafından doldurulur. Bu hücreler, özellikle SMC'ler, çeşitli kültür ortamlarına adapte olabilirler ve hemen hemen her durumda, in vitro olarak diğer hücre popülasyonlarından çok daha hızlı çoğalırlar, böylece karışık hücre kültürünü devralırlar. Bu nedenle, ilk endişemiz, istenmeyen hücrelerin taşınmasını azaltmak için parankimin enzimatik sindirimini kalibre etmekti. Tip 2 kollajenaz, endotel hücre gruplarını kılcal damarın geri kalanından hızla ayırdığından, akciğer örneğinin sindirim süresinin hücre kontaminasyonunu en aza indirmek için çok önemli olabileceğini düşündük. Bu nedenle, ilk adım olarak, eksize edilen akciğer fragmanının kollajenaza maruz kalma süresi, önerilen 20 dakika15 yerine maksimum 10 dakikaya düşürülmüştür (Şekil 2A). Bu tedaviden sonra, SMC'ler ve fibroblastlar da dahil olmak üzere hücre agregalarının bir kısmının hala uzun liflere bağlı olduğu gözlendi (Şekil 2B), SMC'ler ise kan hücresi dışı singletların çoğunluğunu temsil ediyordu. Çapları genellikle 10-20 μm'yi geçmeyen küçük, kompakt hücre kümeleri, stromal doku parçalarına (yani büyük liflere) atfedilebilecek elementler olmadan da gözlenmiştir (Şekil 2B). Bu küçük hücre agregalarının esas olarak HLMVEC'lerden oluşabileceği varsayılmıştır.
Bu hipotezi takiben, HLMVEC geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için seri filtrasyon adımları gerçekleştirilmiştir. İlk filtreleme için metal bir süzgeç kullanıldı ve numune, HLMVEC'lerin kılcal damarlardan kaçışını kolaylaştırmak için cımbızla masaj yapıldı (Şekil 2C, sağda). Bu adımın amacı, hala hücre dışı matrikse bağlı olan büyük düz kas hücresi ve fibroblast kümelerini çıkarmaktı. Çıkış daha sonra 70 μm ve 40 μm ağ boyutunda süzgeçlerden oluşan bir dizi kullanılarak filtrelenerek gözle görülmeyen büyük agregaları çıkarmak için kalıntı büyük agregalar çıkarıldı (Şekil 2C, orta, sol). Hücre tekellerini çıkarmak için, numuneler 5 dakika boyunca 30 x g'de santrifüj edildi, bu da hücreleri ve agregaları >7-10 μm çapında çökelten ve böylece daha küçük hücreleri süspansiyonda bırakan bir hız. Bu santrifüjleme parametreleri, dolaşımdaki kan hücrelerinin peletlenmesi için Miron ve ark. tarafından bildirilenlere dayanarak seçildi22. Özellikle, bu santrifüjlemeden sonra, süpernatant kırmızı renkliydi (Şekil 2D), birçok kırmızı kan hücresinin (~ 5 μm çapında) varlığını gösteriyordu. Bu noktada, süpernatant dikkatlice çıkarıldı ve ikinci bir tüpe yerleştirildi. Süpernatant ve pelet içeren her iki tüp de PBS−− ile dolduruldu ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edildi. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı içeren tüp, kan hücrelerinde zenginleştirilmiş kırmızı bir pelet gösterdi, bu da ekilen hücre teklilerinin çoğunu içerdiğini düşündürmektedir (Şekil 2E, sağda).
Elde edilen peletler endotel hücre büyüme ortamı ile askıya alındı ve domuz derisinden% 1.5 jelatin ile önceden kaplanmış 6 delikli bir plakanın iki kuyucuğunda ayrı ayrı tohumlandı (Şekil 2E, orta). 3 gün sonra, hücreler PBS++ ile yıkandı, taze ortamla beslendi ve görüntülendi. Şekil 2E'nin solunda gösterildiği gibi, EC adaları "tüp 1" den (üstte) hücreleri içeren kuyuda daha bol bulunurken, "tüp 2" den (altta) hücreleri içeren kuyu çoğunlukla tek ve endotel benzeri olmayan hücreler tarafından doldurulmuştur.
Aynı prosedür, önceki çalışmamızda bildirilen daha az zorlu HPAEC izolasyon protokolüne de uygulandı; burada HPAEC ayrımı, kirletici hücrelerinkine kıyasla daha kısa yapışma sürelerinden yararlanmayı içeriyordu8. Büyük boyutlarından dolayı, arterler artık bağ ve yağ dokularından kolayca temizlenebilir, böylece EC olmayanların büyük bir kısmı ortadan kaldırılır. Bununla birlikte, vasküler SMC'lere ek olarak, bu aşamada örneklerde fibroblastların ve hücre dışı matriks liflerinin büyük bir kısmı hala mevcuttu8. Yeni prosedür, HPAEC eksplantları sırasında başlangıçtaki EC saflığını daha da arttırdı (sonuçlar gösterilmedi).
Yeni izole edilmiş HLMVEC'lerin saflaştırılması ve fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu
İzolasyon protokolünün sonunda, HLMVEC'lerin saflığı, hücre zarı CD31'in akış sitometrik tespiti ile analiz edildi. CD31+ hücre bölmesini doğru bir şekilde tanımlamak için, ileri saçılma (FSC) / yan saçılma (SSC) nokta grafiği üzerine bir kapı yerleştirildi ve morfolojik olarak homojen bir hücre popülasyonu tanımlandı. Böyle bir popülasyon bir FSC-Alanı / FSC-Yüksekliği nokta grafiğinde temsil edildi ve tek hücreler CD31'in yüzey ekspresyonu için kapılandı ve analiz edildi (hiyerarşik geçit stratejisi, gösterilmedi). En iyi senaryoda, ~% 70 saf HLMVEC tek hücreler (Şekil 3A, B) elde edildi. Not olarak, numune ameliyattan hemen sonra işlenmediğinde veya donör yaşlı veya sigara içen olduğunda HLMVEC verimi önemli ölçüde azalmıştır.
Daha saf HLMVEC preparatları elde etmek için, CD31+ hücreleri sıralandı ve% 1.5 jelatin kaplı kültür plakalarında tohumlandı. Sıralanan hücreler karakteristik endotel benzeri şekli aldı (Şekil 3C) ve Şekil 3D'de bildirildiği gibi, konfokal mikroskopi, FACS saflaştırılmış hücrelerin neredeyse% 100'ünün EC antijenleri, yani CD31 ve daha spesifik von Willebrand faktörü (vWF) 23 için pozitif boyandığını gösterdi. Dahası, bu hücreler Matrigel'de tohumlandığında, HUVEC'lerin yanı sıra boru şeklindeki yapılar ürettiler (Şekil 3E), böylece endotel fenotiplerini doğruladılar.
Şekil 1: Prosedürün şematik gösterimi. Akış şeması, endotel hücre izolasyonu ve endotel dışı hücre çıkarılması prosedürünü göstermektedir. Her adım, deneysel protokolün 2-6. adımlarında açıklanan olayları özetler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Optimize edilmiş EC izolasyon prosedürünün gösterimi. (A) Kollajenaz sindiriminden önce küçük parçalar halinde doğranmış (solda) ve 5 mL tip 2 kollajenaz içeren 15 mL'lik bir tüpte inkübe edilmiş bir akciğer parankim örneğinin temsili görüntüsü (sağda). (B) Kollajenaz sindiriminden sonra elde edilen hücre popülasyonlarının şematik (solda) ve gerçek (sağ; büyütme: 100x) gösterimi. Bu popülasyonlar, ECs ve ECs olmayan teklileri, ECs gruplarını ve süzgeçler kullanılarak çıkarılan liflere bağlı EC olmayan grupları içerir. (C) Metal 70 μm ve 40 μm örgü süzgeçlerin kullanıldığı seri filtrasyonlar. (D) Düşük hızlı santrifüjlemeden sonra ve süpernatantları "tüp 1" ve "tüp 2"deki peletlerden ayırmadan önce 50 mL'lik tüpün görüntüsü. Hücre kümeleri pelet içinde bulunurken, tek hücreler çoğunlukla süpernatantta bulunur. (E) Peletin ve izole edilmiş hücrelerin "tüp 1" (üstte) ve "tüp 2"den (altta) farklı renklerini ve bileşimlerini gösteren görüntü; büyütme: 100x. Kısaltma: EC = endotel hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: HLMVEC fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu . (A) Akciğer parankiminin eksplantından elde edilen karışık hücre popülasyonu. (B) İlk geçişin sonunda hücrelerin yüzeyinde akış sitometrisi ile CD31 tespiti. Saflık yüzdesi (%70), kullanılan hiyerarşik geçit stratejisini ifade eder. (C) CD31 antijeni için canlı olarak sıralandıktan sonra saf HLMVEC'ler. (D) CD31 (solda) ve vWF (sağda) pozitif boyamanın temsili immünofloresan konfokal mikroskobik görüntüleri (ölçek çubuğu: 50 μm). (E) Parlak alan görüntüleri, MATRIGEL.Magnification (A, C, E): 100x üzerinde HUVEC'lerin veya HLMVEC'lerin tohumlanmasından 6 saat sonra yakalandı. Kısaltmalar: HLMVEC'ler = insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vasküler endotel hücrelerinin insan patofizyolojisinde oynadığı çoklu roller, bu hücreleri in vitro patogenetik ve farmakolojik çalışmalar için vazgeçilmez bir araç haline getirmektedir. Farklı vasküler bölgelerden/organlardan gelen EC'ler kendine özgü özellikler ve işlevler gösterdiğinden, ilgili organdan sağlıklı ve hastalıklı ECs'lerin mevcudiyeti araştırma amaçları için ideal olacaktır. Örneğin, HLMVEC'ler akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir; Bu nedenle, bu hücrelerin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir metodoloji, çeşitli araştırma alanlarına fayda sağlayacaktır.
HLMVEC'leri izole etme yöntemleri çeşitli gruplar tarafından bildirilmiştir 10,11,12,14,15,17,18,19. Her yöntem, manyetik boncuklar 11,12,15,17,18 ile hücre sıralama veya künt bir kanül 17,18 kullanarak mekanik ayrışma gibi yenilikçi yaklaşımlar getirmiştir. Mevcut protokol, kollajenaz sindiriminden sonra elde edilen endotel hücrelerinin küçük adacıklarını toplamak için tasarlanmış ve ilk karışık hücre popülasyonunda EC'lerin saflığını arttırmak için sedimantasyon zamanına dayalı seri santrifüjler kullanılmıştır. Bu nokta çok önemlidir, çünkü daha yüksek başlangıç hücresi sayıları, deneyler için gerekli hücre sayısına ulaşmak için daha düşük sayıda in vitro genişlemeye ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir, bu da ECs yaşlanmadan önce daha fazla araştırmanın tamamlanabileceği anlamına gelir. Bu yön, güvenilir sonuçlar elde etmek için de geçerli olan HLMVEC izolatlarının saflık derecesi ile kesinlikle ilgilidir. Dahası, akciğer numunesinin boyutu çok küçükse ve eksplanttan hemen sonra EC ayıklaması yapma imkanı yoksa, ki bu bizim deneyimlerimize göre en sık görülen senaryoydu, kirletici SMC'ler EC'lerden daha hızlı büyüyecek, böylece kültürü devralacak ve hücre sıralamadan sonra EC'lerin verimini azaltacaktır.
Bu çalışmada bu noktalara değinmeye çalıştık. Bunun için, kollajenaz sindiriminden sonra akciğer örneklerine ne olduğu başlangıçta izlendi ve değişen hücre tipleri, özellikle de hızlı büyüyen ve karışık kültürlerde HLMVEC'leri geçebilen SMC'ler (Şekil 2) tarafından önemli kontaminasyon tespit edildi. Bu nedenle, bu kontaminasyonu sindirimden sonra derhal en aza indirmek için bir strateji belirlenmiştir (Şekil 1 ve Şekil 2). Dikkat çekici bir şekilde, ~% 70 saflığa sahip HLMVEC'ler (Şekil 3A, B) ilk izolasyon aşamasında tutarlı bir şekilde elde edilmiştir. Bu mükemmel sonuç, FACS tarafından sonraki saflaştırma adımını kolaylaştırdı ve neredeyse saf, fonksiyonel HLMVEC'lerin elde edilmesinin nihai sonucuna yol açtı (Şekil 3C-E). Başlangıç materyali olarak pulmoner arter segmentleri kullanıldığında ve HPAEC'ler izole edilmiş hücreler olduğunda benzer sonuçlar elde edilmiştir, bu nedenle bu metodoloji daha önce bildirilen metodolojinin bir gelişimini temsil eder8.
Basit ve tekrarlanabilir olmasına rağmen, bu prosedürün temel gereksinimleri vardır. Örneğin, HLMVEC izolasyonunda sadece cerrahi eksizyondan 3-6 saat içinde elde edilen akciğer fragmanlarını işleyerek başarılı olduk, oysa daha uzun aralıklar kötü sonuçlarla ilişkiliydi (veriler gösterilmedi). Kollajenaz sindirim süresi, enzimatik aktivitedeki partiden partiye varyasyonlar nedeniyle EC veriminde değişkenlik de yaratabilir24. Bir diğer kritik nokta numune durumuyla ilgilidir. Sigara içenlerden veya yaşlı donörlerden elde edilen akciğer parankimleri düşük HLMVEC verimi vermiştir. Ayrıca, düşük hızlı santrifüjlemenin süpernatantı "tüp 2" ye aktarılan bazı agregalar içerebilir. Bu nedenle, "tüp 1" ve "tüp 2" içeriğinin, en azından hücre izolasyonunun erken aşamasında, kültürde tutulması önerilir. CD31+ hücrelerinin doğrudan sıralanması, daha önce EC izolasyon protokolleri 11,12,15,17,18'de açıklandığı gibi, saflığı en baştan arttırmak için iyi bir çözüm olabilir. Analiz edilen numunelerin küçük boyutlarından dolayı bu erken ayıklama aşamasını uygulamadık. Ancak, bu olasılık gelecekte protokolün uygulanmasında test edilecektir.
HLMVEC'leri ve HPAEC'leri izole etmek için basit ve güvenilir bir izolasyon protokolü, araştırmacıları, özellikle bu hücreler ticari olarak mevcut olmadığında, çalışmaları için hücre elde etmek için bu yolu kullanmaya teşvik edecektir. Örneğin, HLMEC'leri CF akciğerlerinden izole etmek, bir çip25 üzerinde tam bir CF hava yolunun inşasına izin verecektir. Ayrıca, kendi EC koleksiyonlarını yapmak, araştırmacıların daha düşük bir maliyetle daha fazla deney planlamalarını ve yürütmelerini sağlayacaktır.
Sonuç olarak, cerrahi örneklerden AT izolasyonu sırasında oluşabilecek bazı kritik noktaları çözen bu yöntem, mevcut yöntemleri geliştirerek AT patobiyolojisi ve inflamasyonu üzerine araştırmalara kolaylık sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmadan yürütüldüğünü beyan etmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı'ndan (eski% 60 2021 ve 2022) R. P.'ye ve İtalyan Kistik Fibroz Vakfı'ndan (FFC # 23 / 2014) ve İtalya Sağlık Bakanlığı'ndan (L548 / 93) MR'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A.
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G.
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D.
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
