Summary
Sebbene impegnativo, l'isolamento delle cellule endoteliali polmonari è essenziale per gli studi sull'infiammazione polmonare. Il presente protocollo descrive una procedura per l'isolamento ad alto rendimento e ad alta purezza delle cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari.
Abstract
La disponibilità di cellule isolate da tessuti e organi sani e malati rappresenta un elemento chiave per approcci di medicina personalizzata. Sebbene le biobanche possano fornire un'ampia collezione di cellule primarie e immortalizzate per la ricerca biomedica, queste non coprono tutte le esigenze sperimentali, in particolare quelle relative a malattie o genotipi specifici. Le cellule endoteliali vascolari (ECs) sono componenti chiave della reazione infiammatoria immunitaria e, quindi, svolgono un ruolo centrale nella patogenesi di una varietà di disturbi. In particolare, le EC di diversi siti mostrano diverse proprietà biochimiche e funzionali, rendendo la disponibilità di specifici tipi di EC (cioè macrovascolari, microvascolari, arteriosi e venosi) essenziale per la progettazione di esperimenti affidabili. Qui, vengono illustrate in dettaglio semplici procedure per ottenere cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari umane ad alto rendimento, praticamente pure, dall'arteria polmonare e dal parenchima polmonare. Questa metodologia può essere facilmente riprodotta ad un costo relativamente basso da qualsiasi laboratorio per ottenere l'indipendenza dalle fonti commerciali e ottenere fenotipi/genotipi EC che non sono ancora disponibili.
Introduction
L'endotelio vascolare riveste la superficie interna dei vasi sanguigni. Svolge un ruolo chiave nella regolazione della coagulazione del sangue, del tono vascolare e delle risposte immuno-infiammatorie 1,2,3,4. Sebbene la coltura di cellule endoteliali (CE) isolate da campioni umani sia essenziale per scopi di ricerca, va osservato che le EC provenienti da diversi vasi sanguigni (arterie, vene, capillari) hanno funzioni specifiche. Questi non possono essere completamente ricapitolati dalle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), che sono facilmente disponibili e ampiamente utilizzate negli studi sulla fisiopatologia dell'endotelio vascolare 5,6. Ad esempio, le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVECs) svolgono un ruolo chiave nell'infiammazione polmonare controllando il reclutamento e l'accumulo di leucociti 4,7. Pertanto, un setting sperimentale volto a riprodurre l'infiammazione polmonare con alta fedeltà dovrebbe includere HLMVECs. D'altra parte, la disfunzione EC può essere osservata in diverse patologie; pertanto, le EC del paziente sono fondamentali per costruire un modello in vitro affidabile della malattia. Ad esempio, l'isolamento di frammenti di EC dall'arteria polmonare (HPAEC), sezionati dai polmoni espiantati di persone affette da fibrosi cistica (FC), ci ha permesso di scoprire meccanismi di disfunzione endoteliale in questa malattia 8,9.
Pertanto, i protocolli volti a ottimizzare l'isolamento delle EC da diverse fonti / organi anche negli stati di malattia sono essenziali per fornire agli investigatori preziosi strumenti di ricerca, in particolare quando questi strumenti non sono disponibili in commercio. I protocolli di isolamento HLMVEC e HPAEC sono stati precedentemente riportati 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In tutti i casi, la digestione enzimatica dei campioni polmonari ha portato a popolazioni cellulari miste, che sono state purificate utilizzando mezzi selettivi ad hoc e sfere magnetiche o selezione cellulare basata su citometria. Ulteriori ottimizzazioni di questi protocolli devono affrontare due problemi principali nell'isolamento della CE: (1) contaminazione cellulare e tissutale, che dovrebbe essere risolta al più presto possibile per ridurre al minimo la senescenza replicativa EC20; e (2) la bassa resa degli isolati EC primari.
Questo studio descrive un nuovo protocollo per l'isolamento ad alto rendimento e purezza di HLMVEC e HPAEC. Questa procedura può essere facilmente applicabile e fornire EC macrovascolari e microvascolari praticamente pure in pochi passaggi.
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Protocol
Questo studio è stato approvato e il protocollo ha seguito le linee guida del comitato etico della ricerca umana dell'Università di Chieti-Pescara (#237_2018bis). La figura 1 illustra l'isolamento delle cellule endoteliali da segmenti (lunghi 1-3 cm) di parenchima polmonare o arteria polmonare da soggetti umani non identificati (con consenso scritto) sottoposti a chirurgia toracica per vari motivi, come pneumotorace o lobectomia. In quest'ultimo caso, i chirurghi hanno anche raccolto un segmento dell'arteria polmonare. In particolare, i chirurghi sono stati accuratamente istruiti a raccogliere campioni privi di cancro. Il protocollo presentato è stato ottimizzato per ottenere la massima resa e purezza possibile.
1. Preparazione sperimentale
- Ricostituzione della collagenasi
- Sciogliere la polvere di collagenasi in soluzione salina tamponata fosfato senza CaCl 2 e MgCl 2 (PBS−−, vedere Tabella dei materiali) ad una concentrazione di2 mg/ml e filtrare la soluzione utilizzando un filtro per pori da 0,22 μm.
- Preparare 5 ml di aliquote e conservarle a -20 °C. Scongelare e preriscaldare le aliquote a 37 °C prima dell'uso.
- Rivestimento della piastra
- Per il rivestimento della piastra, pipettare una soluzione di gelatina all'1,5% o 50 μg/mL di fibronectina (vedere Tabella dei materiali) nella piastra di coltura (500 μL sono sufficienti per coprire la superficie di ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e incubare per 1 ora a 37 °C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere la gelatina in eccesso e lavare i pozzetti con PBS−−. Aspirare il PBS−− e lasciare asciugare la piastra in un cappuccio sterile.
NOTA: Per la ricostituzione della gelatina, sciogliere la polvere in acqua per ottenere una soluzione all'1,5%, quindi sterilizzarla in autoclave e conservare a 4 °C. La gelatina all'1,5% non è liquida a 4 °C; Pertanto, deve essere riscaldato prima del rivestimento della piastra. In alternativa, qualsiasi soluzione commerciale di gelatina adatta alle colture cellulari può essere utilizzata per il rivestimento della piastra.
2. Preparazione del campione
- Parenchima polmonare
- Lavare i campioni raccolti immergendoli in una provetta da 50 ml contenente PBS−−.
- Trasferire i campioni in una capsula di Petri sterile e tritare manualmente il campione con forbici chirurgiche (dimensione ottimale: >2 cm) in piccoli frammenti di circa 3-4 mm ciascuno.
- Segmento(i) arterioso
- Lavare i campioni raccolti immergendoli in una provetta da 50 ml contenente PBS−−.
- Trasferirlo in una capsula di Petri sterile senza tagliare, poiché la frammentazione aumenterà la superficie della sezione trasversale del segmento arterioso, aumentando così la possibilità di isolare le non-CE.
3. Digestione enzimatica
- Lavare il parenchima polmonare tagliato a cubetti o il/i segmento/i dell'arteria polmonare due volte con PBS−−. Questo passaggio rimuoverà gran parte del sangue residuo.
- Porre i campioni in provette da 15 mL e incubare con 5 mL di collagenasi di tipo 2 (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C e 5% CO2. Durante questa incubazione, la degradazione della matrice extracellulare rilascia singole cellule e aggregati cellulari.
4. Recupero delle cellule digerite
- Posizionare un filtro sterile in acciaio/metallo (cioè un colino da tè con una dimensione di maglia ~ 1 mm) sulla parte superiore di un tubo di raccolta da 50 ml.
- Versare l'intero contenuto dal tubo da 15 mL sul colino, massaggiare delicatamente il tessuto digerito con una spatola e sciacquare il campione con PBS−− fino a riempire il tubo di raccolta.
NOTA: Questo passaggio eliminerà grandi frammenti di tessuto su scala millimetrica, garantendo una maggiore efficienza delle successive fasi di filtrazione.
5. Rimozione non CE mediante filtrazione
- Filtrare il deflusso raccolto nel punto 4.2 utilizzando un filtro cellulare con maglie di 70 μm e raccogliere il deflusso in una provetta fresca da 50 ml.
- Quindi, utilizzare un filtro cellulare con una dimensione di maglia di 40 μm e raccogliere il deflusso in un tubo fresco da 50 ml. Etichettare questo tubo come "tubo 1".
NOTA: queste filtrazioni nei passaggi 5.1 e 5.2 rimuoveranno gli aggregati cellulari di grandi dimensioni, che sono spesso composti da popolazioni cellulari miste.
6. Sedimentazione di cluster cellulari e semina cellulare
- Centrifugare i campioni a 30 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per sedimentare i cluster cellulari.
- Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta sterile (non versare) e metterlo in un tubo fresco da 50 ml ("tubo 2").
- Sospendere il pellet nel "tubo 1" e riempire il tubo fino a 50 ml con PBS−−. Riempire "tubo 2" fino a 50 ml con PBS−−.
NOTA: Da questa fase in poi, entrambi i tubi vengono trattati allo stesso modo. - Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Sospendere i pellet con 2 ml di terreno di coltura (vedi Tabella dei materiali) e seminare la sospensione in due pozzetti separati di una piastra pre-rivestita a 6 pozzetti (fase 1.2).
NOTA: Da questa fase, alimentare le cellule ogni 2 giorni con il terreno di crescita fino a raggiungere la confluenza (circa 1 settimana, a seconda della dimensione del campione) al fine di ottenere un numero ragionevole di celle per la selezione.
7. Espansione cellulare
- Lavare le cellule con 2 ml di PBS con CaCl 2 e MgCl2 (PBS++, vedere Tabella dei materiali) per rimuovere le cellule del sangue residue (l'uso di PBS++ è importante per evitare il distacco delle cellule).
- Rimuovere PBS++ e aggiungere nuovi terreni colturali.
- Ripetere i punti 7.1 e 7.2 fino a quando le cellule raggiungono la confluenza (circa 1 settimana, a seconda della dimensione del campione).
8. Ordinamento delle celle
- Staccare le cellule usando 500 μL di tripsina-EDTA (0,05%, vedere Tabella dei materiali), centrifugare e risospendere il pellet con 190 μL di PBS−−.
- Aggiungere 10 μL di un anticorpo fluorescente coniugato anti-umano CD31-FITC (diluizione 1:20, vedere Tabella dei materiali) e incubare la sospensione cellulare a 4 °C per 30 minuti.
- Lavare le celle con 10 ml di PBS−−, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e risospendere il pellet in 300 μL di PBS−−.
- Isolare e raccogliere le cellule CD31 positive (CD31+) mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), utilizzando un ugello da 100 μm, e raccoglierle in un tubo.
- Secondo la strategia di gating, definire prima la morfologia cellulare utilizzando i parametri dell'area di dispersione laterale, SSC-A e FSC-A. Quindi, selezionare singole celle utilizzando un diagramma a punti FSC-Area/FSC-Height o SSC-Area/SSC-Height, definire le celle positive nel campione contrassegnato rispetto al campione di controllo non colorato e dirigere le celle fluorescenti nel tubo di raccolta21.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e sospendere il pellet in 2 ml di terreno di coltura per la semina nei pozzetti pre-rivestiti di una piastra a 6 pozzetti.
9. Espansione post-ordinamento
- Due giorni dopo la selezione cellulare, sostituire il terreno condizionato con terreno di crescita fresco.
- Ripetere il passaggio 7.1 e il passaggio 7.2 ogni 2 giorni per l'espansione cellulare.
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Representative Results
Isolamento HLMEC
Il problema principale durante l'isolamento degli HLMVEC è la presenza di cellule contaminanti poiché i capillari microscopici non possono essere facilmente separati dal tessuto stromale. Pertanto, raggiungere la massima purezza possibile nelle prime fasi del processo di isolamento è fondamentale per ridurre i passaggi di coltura e, quindi, l'invecchiamento cellulare. Allo stesso modo, un protocollo di isolamento ottimale dovrebbe fornire la massima resa possibile di HLMVEC puri. Per raggiungere questi obiettivi, è stata istituita una nuova procedura basata sui protocolli precedentemente descritti 10,11,12,14,15.
Sebbene il parenchima polmonare sia altamente vascolarizzato, rappresentando quindi un'eccellente fonte di HLMVEC, è in gran parte popolato da cellule muscolari lisce (SMC), fibre di collagene e fibroblasti. Queste cellule, in particolare le SMC, possono adattarsi a una varietà di terreni di coltura e, in quasi tutti i casi, replicarsi in vitro molto più velocemente di altre popolazioni cellulari, il che significa che assumono il controllo della coltura cellulare mista. Pertanto, la nostra prima preoccupazione è stata quella di calibrare la digestione enzimatica del parenchima al fine di ridurre il trascinamento di cellule indesiderate. Poiché la collagenasi di tipo 2 stacca rapidamente gruppi di cellule endoteliali dal resto del capillare, abbiamo pensato che il tempo di digestione del campione polmonare potesse essere cruciale per ridurre al minimo la contaminazione cellulare. Pertanto, come primo passo, il tempo di esposizione alla collagenasi del frammento polmonare asportato è stato ridotto a un massimo di 10 minuti invece dei 20 minuti15 suggeriti (Figura 2A). Dopo questo trattamento, è stato osservato che parte degli aggregati cellulari, comprese le SMC e i fibroblasti, erano ancora legati a fibre lunghe (Figura 2B), mentre le SMC rappresentavano la maggior parte dei singoletti non ematici. Sono stati osservati anche piccoli gruppi compatti di cellule, con diametri generalmente non superiori a 10-20 μm, senza elementi attribuibili a frammenti di tessuto stromale (cioè fibre grandi) (Figura 2B). È stato ipotizzato che questi aggregati di piccole cellule potrebbero essere composti principalmente da HLMVECs.
Seguendo questa ipotesi, sono state eseguite fasi di filtrazione seriale per massimizzare il recupero HLMVEC. Per la prima filtrazione, è stato utilizzato un filtro metallico e il campione è stato massaggiato con una pinzetta per facilitare la fuoriuscita di HLMVEC dai capillari (Figura 2C, a destra). Lo scopo di questo passaggio era quello di rimuovere i grandi gruppi di cellule muscolari lisce e fibroblasti ancora legati alla matrice extracellulare. Il deflusso è stato quindi filtrato utilizzando una sequenza di filtri di dimensioni di maglia da 70 μm e 40 μm per rimuovere gli aggregati residui di grandi dimensioni, anche se non visibili all'occhio (Figura 2C, al centro, a sinistra). Per rimuovere i singoletti cellulari, i campioni sono stati centrifugati a 30 x g per 5 minuti, una velocità che sedimenta cellule e aggregati con un diametro >7-10 μm, lasciando così le celle più piccole in sospensione. Questi parametri di centrifugazione sono stati scelti sulla base di quelli riportati da Miron et al. per il pelletting delle cellule del sangue circolanti22. In particolare, dopo questa centrifugazione, il surnatante era di colore rosso (Figura 2D), indicando la presenza di molti globuli rossi (~ 5 μm di diametro). A questo punto, il surnatante è stato accuratamente rimosso e posto in un secondo tubo. Entrambi i tubi contenenti il surnatante e il pellet sono stati riempiti con PBS−− e centrifugati a 300 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, il tubo contenente il surnatante mostrava un pellet rosso arricchito in cellule del sangue, suggerendo che conteneva anche la maggior parte dei singoletti cellulari espiantati (Figura 2E, a destra).
I pellet ottenuti sono stati sospesi con il mezzo di crescita delle cellule endoteliali e seminati separatamente in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti, che sono stati pre-rivestiti con gelatina all'1,5% di pelle suina (Figura 2E, al centro). Dopo 3 giorni, le cellule sono state lavate con PBS ++, alimentate con terreno fresco e visualizzate con immagini. Come mostrato a sinistra della Figura 2E, le isole EC erano più abbondanti nel pozzo contenente le cellule del "tubo 1" (in alto), mentre il pozzo contenente le cellule del "tubo 2" (in basso) era per lo più popolato da cellule singole e non endoteliali.
La stessa procedura è stata applicata al protocollo di isolamento HPAEC meno impegnativo riportato nel nostro lavoro precedente, in cui la separazione HPAEC ha comportato lo sfruttamento del loro tempo di adesione più breve rispetto a quello delle celle contaminanti8. A causa delle loro grandi dimensioni, le arterie possono essere facilmente pulite dai tessuti connettivi e adiposi residui, eliminando così una grande percentuale di non-EC. Tuttavia, una grande percentuale di fibroblasti e fibre della matrice extracellulare era ancora presente nei campioni in questa fase, oltre alle SMC vascolari8. La nuova procedura ha ulteriormente aumentato la purezza EC iniziale durante gli espianti HPAEC (risultati non mostrati).
Purificazione e caratterizzazione fenotipica e funzionale di HLMVEC appena isolati
Al termine del protocollo di isolamento, la purezza degli HLMVEC è stata analizzata mediante la rilevazione citometrica a flusso della membrana cellulare CD31. Per identificare correttamente il compartimento cellulare CD31+, è stato impostato un gate su un dot plot forward-scatter (FSC)/side-scatter (SSC) ed è stata identificata una popolazione morfologicamente omogenea di cellule. Tale popolazione è stata rappresentata su un dot plot FSC-Area/FSC-Height, e singole cellule sono state controllate e analizzate per l'espressione superficiale di CD31 (strategia gerarchica di gating, non mostrata). Nel migliore dei casi, sono state ottenute singole celle HLMVEC pure ~ 70% (Figura 3A, B). Da notare che la resa di HLMVEC è stata significativamente ridotta quando il campione non è stato elaborato immediatamente dopo l'intervento chirurgico o quando il donatore era anziano o fumatore.
Per ottenere preparazioni HLMVEC più pure, le cellule CD31+ sono state selezionate e seminate in piastre di coltura rivestite di gelatina all'1,5%. Le cellule selezionate hanno assunto la caratteristica forma endoteliale (Figura 3C) e, come riportato in Figura 3D, la microscopia confocale ha mostrato che quasi il 100% delle cellule purificate FACS sono risultate positive per gli antigeni EC, vale a dire CD31 e il più specifico fattore di von Willebrand (vWF) 23. Inoltre, quando queste cellule sono state seminate in Matrigel, hanno generato strutture tubulari, così come HUVEC (Figura 3E), confermando così il loro fenotipo endoteliale.
Figura 1: Rappresentazione schematica della procedura. Il diagramma di flusso mostra la procedura per l'isolamento delle cellule endoteliali e la rimozione delle cellule non endoteliali. Ogni passaggio ricapitola gli eventi descritti nei passaggi 2-6 del protocollo sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Illustrazione della procedura ottimizzata di isolamento CE. (A) Immagine rappresentativa di un campione di parenchima polmonare tagliato a cubetti in piccoli frammenti prima della digestione della collagenasi (a sinistra) e incubato in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di collagenasi di tipo 2 (a destra). (B) Rappresentazione schematica (a sinistra) ed effettiva (a destra; ingrandimento: 100x) delle popolazioni cellulari ottenute dopo la digestione della collagenasi. Queste popolazioni includono singoletti di non-EC e ECs, gruppi di ECs e gruppi di non-EC legati a fibre, che vengono rimossi usando filtri. (C) Filtrazioni seriali con filtri a maglia metallica da 70 μm e 40 μm. (D) Immagine del tubo da 50 mL dopo centrifugazione a bassa velocità e prima di separare i surnatanti dai pellet nel "tubo 1" e nel "tubo 2". I cluster di cellule sono contenuti nel pellet, mentre le singole cellule sono per lo più contenute nel surnatante. (E) Immagine che mostra i diversi colori e composizioni del pellet e delle celle isolate dal "tubo 1" (in alto) e dal "tubo 2" (in basso); Ingrandimento: 100x. Abbreviazione: EC = cellule endoteliali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione fenotipica e funzionale di HLMVEC . (A) Una popolazione di cellule miste ottenuta da un espianto di parenchima polmonare. (B) Rilevazione di CD31 mediante citometria a flusso sulla superficie delle cellule alla fine del primo passaggio. La purezza percentuale (70%) si riferisce alla strategia gerarchica di gating utilizzata. (C) HLMVEC puri dopo essere stati selezionati vivi per l'antigene CD31. (D) Immagini microscopiche confocali rappresentative dell'immunofluorescenza della colorazione positiva CD31 (sinistra) e vWF (destra) (barra della scala: 50 μm). (E) Le immagini in campo chiaro sono state catturate 6 ore dopo la semina di HUVEC o HLMVEC su Matrigel.Ingrandimento (A, C, E): 100x. Abbreviazioni: HLMVECs = cellule endoteliali microvascolari polmonari umane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I molteplici ruoli svolti dalle cellule endoteliali vascolari nella fisiopatologia umana rendono queste cellule uno strumento indispensabile per studi patogenetici e farmacologici in vitro . Poiché le EC provenienti da diversi siti/organi vascolari mostrano caratteristiche e funzioni peculiari, la disponibilità di EC sane e malate dall'organo di interesse sarebbe ideale per scopi di ricerca. Ad esempio, gli HLMVEC sono essenziali per gli studi sull'infiammazione polmonare; Pertanto, una metodologia per l'isolamento ad alto rendimento e purezza di queste cellule andrà a beneficio di diversi campi di ricerca.
I metodi per isolare gli HLMVEC sono stati riportati da vari gruppi 10,11,12,14,15,17,18,19. Ogni metodo ha introdotto approcci innovativi, come lo smistamento cellulare con sfere magnetiche 11,12,15,17,18 o la dissociazione meccanica utilizzando una cannula smussata17,18. Il presente protocollo è stato progettato per raccogliere le piccole isole di cellule endoteliali ottenute dopo la digestione della collagenasi e ha utilizzato centrifugazioni seriali basate sul tempo di sedimentazione per aumentare la purezza delle EC nella popolazione iniziale di cellule miste. Questo punto è cruciale poiché un numero più elevato di cellule di partenza significa che è necessario un numero inferiore di espansioni in vitro per raggiungere il numero di cellule necessarie per gli esperimenti, il che, a sua volta, significa che più indagini possono essere completate prima che le EC si verifichino. Questo aspetto è strettamente correlato al grado di purezza degli isolati HLMVEC, che è anche rilevante per ottenere risultati affidabili. Inoltre, se il campione polmonare è di dimensioni molto ridotte e non vi è alcuna possibilità di eseguire la selezione EC immediatamente dopo l'espianto, che era, nella nostra esperienza, lo scenario più frequente, le SMC contaminanti cresceranno più velocemente delle CE, assumendo così il controllo della coltura e riducendo la resa delle EC dopo la selezione cellulare.
In questo studio, abbiamo cercato di affrontare questi punti. Per questo, ciò che è accaduto ai campioni polmonari dopo la digestione della collagenasi è stato inizialmente monitorato e la contaminazione significativa è stata identificata da vari tipi di cellule, in particolare SMC (Figura 2), che crescono rapidamente e possono superare gli HLMVEC in colture miste. Pertanto, è stata impostata una strategia per ridurre al minimo questa contaminazione immediatamente dopo la digestione (Figura 1 e Figura 2). Sorprendentemente, gli HLMVEC con purezza ~ 70% (Figura 3A, B) sono stati costantemente ottenuti nella prima fase di isolamento. Questo eccellente risultato ha facilitato la successiva fase di purificazione da parte di FACS, portando al risultato finale di ottenere HLMVEC virtualmente puri e funzionali (Figura 3C-E). Risultati simili sono stati ottenuti quando i segmenti dell'arteria polmonare sono stati utilizzati come materiale di partenza e gli HPAEC erano le cellule isolate, il che significa che questa metodologia rappresenta un miglioramento della metodologia riportata in precedenza8.
Sebbene semplice e riproducibile, questa procedura ha requisiti chiave. Ad esempio, siamo riusciti nell'isolamento HLMVEC elaborando solo frammenti polmonari ottenuti entro 3-6 ore dall'escissione chirurgica, mentre intervalli più lunghi sono stati associati a risultati scarsi (dati non mostrati). Il tempo di digestione della collagenasi potrebbe anche introdurre variabilità nella resa EC a causa delle variazioni da lotto a lotto nell'attività enzimatica24. Un altro punto critico riguarda la condizione del campione. Il parenchima polmonare derivato da fumatori o donatori anziani ha dato basse rese HLMVEC. Inoltre, il surnatante della centrifugazione a bassa velocità può contenere alcuni aggregati che vengono trasferiti nel "tubo 2". Per questo motivo, si raccomanda di mantenere il contenuto di "tubo 1" e "tubo 2" in coltura, almeno durante la fase iniziale dell'isolamento cellulare. Lo smistamento diretto delle cellule CD31+, come precedentemente descritto nei protocolli di isolamento EC 11,12,15,17,18, può anche rappresentare una buona soluzione per aumentare la purezza fin dall'inizio. Non abbiamo applicato questa fase iniziale di selezione a causa delle piccole dimensioni dei campioni analizzati. Tuttavia, questa possibilità sarà testata in futuro nell'attuazione del protocollo.
Un protocollo di isolamento semplice e affidabile per isolare HLMVEC e HPAEC incoraggerà i ricercatori a utilizzare questa via per ottenere cellule per i loro studi, in particolare quando queste cellule non sono disponibili in commercio. Ad esempio, l'isolamento degli HLMEC dai polmoni CF consentirà la costruzione di una via aerea CF completa su un chip25. Inoltre, la creazione di una propria collezione CE consentirà ai ricercatori di pianificare ed eseguire più esperimenti a un costo inferiore.
In conclusione, questo metodo, che risolve alcuni punti critici che possono verificarsi durante l'isolamento EC da campioni chirurgici, migliora i metodi esistenti, facilitando così la ricerca sulla patobiologia e l'infiammazione CE.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcun rapporto commerciale o finanziario che potesse essere interpretato come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Ministero dell'Università e della Ricerca (ex 60% 2021 e 2022) a R. P. e da sovvenzioni della Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#23/2014) e del Ministero della Salute italiano (L548/93) a M. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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