Summary
挑戦的ですが、肺内皮細胞の単離は肺炎症の研究に不可欠です。本プロトコルは、大血管内皮細胞および微小血管内皮細胞の高収率、高純度単離のための手順を記載する。
Abstract
健康な組織や病気の組織や臓器から分離された細胞の入手可能性は、個別化医療アプローチの重要な要素を表しています。バイオバンクは、生物医学研究のために初代細胞と不死化細胞の幅広いコレクションを提供できますが、これらはすべての実験ニーズ、特に特定の疾患や遺伝子型に関連するニーズをカバーするわけではありません。血管内皮細胞(EC)は免疫炎症反応の重要な構成要素であり、したがって、さまざまな障害の病因において中心的な役割を果たします。特に、異なる部位のECは異なる生化学的および機能的特性を示すため、信頼性の高い実験を設計するには、特定のECタイプ(すなわち、大血管、微小血管、動脈、および静脈)の利用可能性が不可欠です。ここでは、肺動脈および肺実質から高収率で事実上純粋なヒト大血管および微小血管内皮細胞を得るための簡単な手順が詳細に示されている。この方法論は、商業的供給源からの独立性を達成し、まだ利用できないEC表現型/遺伝子型を得るために、どの研究室でも比較的低コストで容易に再現することができる。
Introduction
血管内皮は血管の内面を裏打ちします。血液凝固、血管緊張、および免疫炎症反応の調節に重要な役割を果たします1,2,3,4。ヒト検体から分離した内皮細胞(EC)の培養は研究目的に不可欠ですが、異なる血管(動脈、静脈、毛細血管)からのECには特定の機能があることに留意する必要があります。これらは、血管内皮の病態生理学の研究で容易に入手でき、広く使用されているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)では完全に再現できません5,6。たとえば、ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)は、白血球の動員と蓄積を制御することにより、肺の炎症に重要な役割を果たします4,7。したがって、肺の炎症を忠実度の高い状態で再現することを目的とした実験設定には、HLMVECを含める必要があります。一方、EC機能障害はいくつかの病状で観察できます。したがって、患者からのECは、疾患の信頼性の高いin vitroモデルを構築するための基本です。たとえば、嚢胞性線維症(CF)に冒された人々の外植肺から解剖された肺動脈(HPAEC)からのECの断片の分離により、この病気の内皮機能障害のメカニズムを明らかにすることができました8,9。
したがって、疾患状態にあるさまざまなソース/臓器からのECの分離を最適化することを目的としたプロトコルは、特にこれらのツールが市販されていない場合に、研究者に貴重な研究ツールを提供するために不可欠です。HLMVECおよびHPAEC単離プロトコルは、以前に報告されている10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。すべての場合において、肺検体の酵素消化により混合細胞集団が得られ、アドホック選択培地および磁気ビーズまたはサイトメトリーベースの細胞選別を使用して精製されました。これらのプロトコルのさらなる最適化は、EC分離における2つの主要な問題に対処する必要があります:(1)細胞および組織の汚染、EC複製老化を最小限に抑えるために可能な限り早い培養継代で解決する必要があります20;(2)一次EC分離株の収率が低い。
この研究では、HLMVECおよびHPAECの高収率、高純度単離のための新しいプロトコルについて説明します。この手順は簡単に適用でき、数ステップで実質的に純粋な大血管および微小血管ECが得られます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究は承認され、プロトコルはキエティペスカーラ大学の人間の研究倫理委員会のガイドラインに従いました(#237_2018bis)。 図 1は、気胸や葉切除術などのさまざまな理由で胸部手術を受けている非同定されたヒト被験者(書面による同意付き)からの肺実質または肺動脈のセグメント(長さ1〜3 cm)からの内皮細胞の分離を示しています。この後者の場合、外科医は肺動脈セグメントも収集した。特に、外科医は癌のないサンプルを収集するように正確に指示されました。提示されたプロトコルは、可能な限り最大の収率と純度が得られるように最適化されました。
1. 実験準備
- コラゲナーゼの再構成
- コラゲナーゼ粉末をCaCl2およびMgCl2を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS−−、材料表を参照)に2 mg/mL濃度で溶解し、0.22 μmの細孔フィルターを使用して溶液をろ過します。
- 5 mLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。 使用前にアリコートを解凍して37°Cに予熱してください。
- プレートコーティング
- プレートコーティングの場合は、1.5%ゼラチン溶液または50 μg/mLフィブロネクチン( 材料表を参照)を培養プレートにピペットで入れ(6ウェルプレートの各ウェルの表面を覆うには500 μLで十分です)、37°Cで1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、余分なゼラチンを取り除き、ウェルをPBS−−で洗浄します。PBS--を吸引し、プレートを滅菌フードで乾燥させます。
注:ゼラチンを再構成するには、粉末を水に溶かして1.5%溶液を作り、オートクレーブして4°Cで保存します。 1.5%のゼラチンは4°Cでは液体ではありません。したがって、プレートコーティングの前にウォームアップする必要があります。あるいは、細胞培養に適した任意の市販のゼラチン溶液をプレートコーティングに使用することができる。
2. サンプル調製
- 肺実質
- 採取したサンプルをPBS−−の入った50 mLチューブに浸して洗浄します。
- サンプルを滅菌ペトリ皿に移し、外科用ハサミ(最適サイズ:>2 cm)を使用してサンプルをそれぞれ約3〜4 mmの小さな断片に手動で切り刻みます。
- 動脈セグメント
- 採取したサンプルをPBS−−の入った50 mLチューブに浸して洗浄します。
- 断片化は動脈セグメントの断面の表面積を増加させ、したがって非ECを単離する可能性を増加させるので、それを粉砕せずに滅菌ペトリ皿に移す。
3.酵素消化
- さいの目に切った肺実質または肺動脈セグメントをPBSで2回洗浄します--。このステップにより、残留血液の大部分が除去されます。
- サンプルを15 mLチューブに入れ、5 mLの2型コラゲナーゼ( 材料の表を参照)とともに37°Cおよび5%CO2で10分間インキュベートします。このインキュベーションの間、細胞外マトリックスの分解は、単一細胞および細胞凝集体を放出する。
4.消化された細胞の回収
- 滅菌済みのスチール/金属ストレーナー(つまり、メッシュサイズが~1 mmの茶ストレーナー)を50 mLの収集チューブの上部に置きます。
- 15 mLチューブの内容物全体をストレーナーに注ぎ、消化した組織をスパチュラで優しくマッサージし、収集チューブが満たされるまでサンプルをPBS−−ですすいでください。
注:このステップにより、ミリメートルスケールの大きな組織片が除去され、後続のろ過ステップの効率が向上します。
5.ろ過による非EC除去
- ステップ4.2で採取した流出液をメッシュサイズ70 μmのセルストレーナーでろ過し、新しい50 mLチューブに流出液を採取します。
- 次に、メッシュサイズ40μmのセルストレーナーを使用し、流出液を新しい50 mLチューブに回収します。このチューブに「チューブ1」というラベルを付けます。
注:ステップ5.1およびステップ5.2のこれらのろ過は、混合細胞集団で構成されることが多い大きな細胞凝集体を除去します。
6. 細胞クラスターの沈降と細胞播種
- サンプルを30 x g で室温で5分間遠心分離し、細胞クラスターを沈降させます。
- 滅菌ピペット(注がないでください)を使用して上清を慎重に取り除き、新しい50 mLチューブ(「チューブ2」)に入れます。
- ペレットを「チューブ1」に懸濁し、チューブを最大50 mLのPBS−−で満たします。「チューブ2」を最大50 mLにPBS−−で充填します。
注意: このステップ以降、両方のチューブは同じ方法で処理されます。 - サンプルを300 x g で室温で5分間遠心分離します。
- ペレットを2 mLの増殖培地で懸濁し( 材料の表を参照)、プレコートされた6ウェルプレートの2つの別々のウェルに懸濁液を播種します(ステップ1.2)。
注:このステップから、ソーティング用の妥当な数の細胞を得るために、コンフルエントに達するまで(サンプルサイズに応じて約1週間)2日ごとに細胞に増殖培地を供給します。
7.細胞の拡大
- CaCl2およびMgCl 2を含む2 mLのPBS(PBS ++、材料表を参照)で細胞を洗浄して、残留血球を除去します(細胞の剥離を避けるためにPBS ++を使用することが重要です)。
- PBS++を取り出し、新鮮な培地を加えます。
- 細胞がコンフルエンシーに達するまで、ステップ7.1とステップ7.2を繰り返します(サンプルサイズに応じて約1週間)。
8.セルソーティング
- 500 μLのトリプシン-EDTA(0.05%、 材料の表を参照)を使用して細胞を剥離し、遠心分離し、ペレットを190 μLのPBS--で再懸濁します。
- 蛍光コンジュゲート抗ヒトCD31-FITC抗体(1:20希釈、 材料表を参照)を10 μL加え、細胞懸濁液を4°Cで30分間インキュベートします。
- 10 mLのPBS--を使用して細胞を洗浄し、室温で300 x g で5分間遠心分離し、ペレットを300 μLのPBS--に再懸濁します。
- 100 μmノズルを使用した蛍光活性化セルソーティング(FACS)によりCD31陽性(CD31+)細胞を単離・回収し、チューブに回収します。
- ゲーティング戦略に従って、最初に側方散乱領域パラメータSSC-AおよびFSC-Aを使用して細胞形態を定義します。次に、FSC−面積/FSC−高さまたはSSC−面積/SSC−高さドットプロットを用いて単一細胞を選択し、染色されていない対照サンプルに対してマークされたサンプル中の陽性細胞を定義し、蛍光細胞を収集チューブ21に向ける。
- 細胞懸濁液を室温で300 x g で5分間遠心分離し、6ウェルプレートのプレコートウェルに播種するための2 mL増殖培地にペレットを懸濁します。
9.ソート後の拡張
- 細胞選別の2日後に、馴化培地を新鮮な増殖培地と交換します。
- 細胞増殖のために、ステップ7.1とステップ7.2を2日ごとに繰り返します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HLMEC 分離
HLMVECの単離中の主な問題は、微細な毛細血管を間質組織から容易に分離することができないため、汚染細胞の存在である。したがって、単離プロセスの初期段階で可能な限り最高の純度を達成することは、培養継代、ひいては細胞の老化を減らすために重要です。同様に、最適な分離プロトコルは、純粋なHLMVECの可能な限り高い収率を提供する必要があります。これらの目標を達成するために、前述のプロトコル10、11、12、14、15に基づいて新しい手順が設定された。
肺実質は高度に血管新生しているため、HLMVECの優れた供給源を表していますが、主に平滑筋細胞(SMC)、コラーゲン線維、および線維芽細胞が生息しています。これらの細胞、特にSMCは、さまざまな培養培地に適応でき、ほとんどすべての場合、他の細胞集団よりもはるかに速く in vitro で複製するため、混合細胞培養を引き継ぎます。したがって、私たちの最初の関心事は、不要な細胞のキャリーオーバーを減らすために実質の酵素消化を調整することでした。2型コラゲナーゼは内皮細胞のグループを毛細血管の残りの部分から急速に分離するため、肺サンプルの消化時間が細胞汚染を最小限に抑えるために重要である可能性があると推論しました。したがって、第1ステップとして、摘出された肺断片のコラゲナーゼへの曝露時間は、示唆された20分ではなく最大10分に減少した15 (図2A)。この処理後、SMCおよび線維芽細胞を含む細胞凝集体の一部は依然として長繊維に結合していることが観察されたが(図2B)、SMCは非血球一重項の大部分を表していた。直径が一般に10〜20μmを超えない小さくてコンパクトな細胞のクラスターも、間質組織の断片(すなわち、大きな繊維)に起因する要素なしで観察されました(図2B)。これらの小細胞凝集体は、主にHLMVECで構成されている可能性があるという仮説が立てられました。
この仮説に従って、HLMVEC回収率を最大化するために連続ろ過ステップが実行されました。最初のろ過では、金属ストレーナーを使用し、毛細血管からのHLMVECの脱出を容易にするためにサンプルをピンセットでマッサージしました(図2C、右)。このステップの目的は、細胞外マトリックスにまだ結合している平滑筋細胞と線維芽細胞の大きなクラスターを除去することでした。次に、70 μmおよび40 μmのメッシュサイズのストレーナーのシーケンスを使用して流出をフィルタリングし、目に見えないが残留の大きな凝集体を除去しました(図2C、中央、左)。細胞シングレットを除去するために、サンプルを30 x g で5分間遠心分離し、細胞を沈降させ、直径>7〜10 μmで凝集させ、より小さな細胞を懸濁液のままにします。これらの遠心分離パラメータは、循環血球22のペレット化についてMironらによって報告されたものに基づいて選択された。特に、この遠心分離後、上清は赤色であり(図2D)、多くの赤血球(直径~5μm)の存在を示しています。この時点で、上清を注意深く除去し、第2のチューブに入れた。上清とペレットを含む両方のチューブにPBS-- を充填し、300 x g で5分間遠心分離しました。遠心分離後、上清を含むチューブは血球に富む赤いペレットを示し、外植細胞シングレットのほとんども含んでいることを示唆しています(図2E、右)。
得られたペレットを内皮細胞増殖培地と共に懸濁し、ブタ皮膚由来の1.5%ゼラチンでプレコートした6ウェルプレートの2つのウェルに別々に播種した(図2E、中央)。3日後、細胞をPBS++で洗浄し、新鮮な培地を与え、画像化した。 図2Eの左に示すように、「チューブ1」(上)の細胞を含むウェルではECアイランドがより多く、「チューブ2」(下)の細胞を含むウェルには単一および非内皮様細胞がほとんど存在していました。
同じ手順が、以前の研究で報告されたそれほど難しくないHPAEC分離プロトコルにも適用され、HPAEC分離では、汚染物質細胞と比較して接着時間が短くなりました8。それらの大きいサイズのために、動脈は残留結合組織および脂肪組織から容易に洗浄することができ、したがって非ECの大部分を排除する。しかし、この段階では、血管SMCに加えて、線維芽細胞および細胞外マトリックス繊維の大部分がサンプルにまだ存在していました8。新しい手順は、HPAEC外植片中の初期EC純度をさらに増加させた(結果は示さず)。
新たに単離されたHLMVECの精製、表現型および機能特性評価
単離プロトコルの最後に、HLMVECの純度を細胞膜CD31のフローサイトメトリー検出によって分析した。CD31+細胞コンパートメントを正しく識別するために、前方散乱(FSC)/側方散乱(SSC)ドットプロット上にゲートを設定し、形態学的に均一な細胞集団を特定しました。このような集団をFSC-Area/FSC-Heightドットプロット上に表し、単一細胞をゲーティングし、CD31の表面発現について分析した(階層的ゲーティング戦略、図示せず)。最良のシナリオでは、~70%の純度のHLMVEC単一細胞(図3A、B)が得られた。注目すべきことに、HLMVEC収量は、サンプルが手術直後に処理されなかった場合、またはドナーが高齢者または喫煙者である場合に有意に減少した。
より純粋なHLMVEC調製物を得るために、CD31+細胞を選別し、1.5%ゼラチンコーティング培養プレートに播種した。選別された細胞は特徴的な内皮様形状を呈し(図3C)、 図3Dで報告されているように、共焦点顕微鏡検査では、FACS精製細胞のほぼ100%がEC抗原、すなわちCD31およびより特異的なフォンビルブランド因子(vWF)23に対して陽性に染色されたことが示されました。さらに、これらの細胞をマトリゲルに播種すると、管状構造とHUVECが生成され(図3E)、内皮表現型が確認されました。
図1:手順の概略図。フローチャートは、内皮細胞単離および非内皮細胞除去の手順を示す。各ステップは、実験プロトコルのステップ2〜6で説明されているイベントを要約します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:最適化されたEC分離手順の図。 (A)コラゲナーゼ消化前に小さな断片にダイシングし(左)、5 mLの2型コラゲナーゼを含む15 mLチューブでインキュベートした肺実質標本の代表的な画像(右)。(B)コラゲナーゼ消化後に得られた細胞集団の模式図(左)と実際の表現(右、倍率:100倍)。これらの集団には、非ECとECのシングレット、ECのグループ、およびファイバーに結合した非ECのグループが含まれ、これらはストレーナーを使用して除去されます。(C)金属70μmおよび40μmメッシュストレーナーを使用した連続ろ過。(D)低速遠心分離後およびペレットから上清を分離する前の50mLチューブの画像は、「チューブ1」および「チューブ2」。細胞クラスターはペレットに含まれ、単一細胞は主に上清に含まれています。(e)「チューブ1」(上)および「チューブ2」(下)から単離されたペレットおよび単離された細胞の異なる色および組成を示す画像;倍率:100倍。略語:EC =内皮細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HLMVECの表現型と機能特性。 (A)肺実質外植片から得られた混合細胞集団。(b)最初の継代の終了時の細胞表面上のフローサイトメトリーによるCD31検出。純度の割合(70%)は、使用される階層ゲーティング戦略を指します。(C)CD31抗原について生態学的選別された後の純粋なHLMVEC。(D)CD31(左)およびvWF(右)陽性染色の代表的な免疫蛍光共焦点顕微鏡像(スケールバー:50μm)。(E)明視野画像は、HUVECまたはHLMVECをマトリゲルに播種してから6時間後にキャプチャされました.倍率(A、 C、 E):100倍。略語:HLMVECs=ヒト肺微小血管内皮細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒトの病態生理学において血管内皮細胞が果たす複数の役割により、これらの細胞は in vitro の病態学的および薬理学的研究に不可欠なツールとなっています。異なる血管部位/臓器由来のECは独特の特徴と機能を示すため、目的の臓器からの健康なECと疾患のECの利用可能性は、研究目的にとって理想的です。たとえば、HLMVECは肺の炎症に関する研究に不可欠です。したがって、これらの細胞の高収率、高純度単離のための方法論は、さまざまな研究分野に利益をもたらします。
HLMVECを単離する方法は、様々なグループによって報告されている10、11、12、14、15、17、18、19。各方法は、磁気ビーズ11、12、15、17、18を用いた細胞選別、または鈍いカニューレ17、18を用いた機械的解離などの革新的なアプローチを導入している。本プロトコルは、コラゲナーゼ消化後に得られた内皮細胞の小さな膵島を収集するように設計され、沈降時間ベースの連続遠心分離を使用して、初期の混合細胞集団におけるECの純度を高めました。開始細胞数が多いほど、実験に必要な細胞数に達するために必要なin vitro増殖の数が少なくなり、ECが老化する前により多くの調査を完了できるため、この点は非常に重要です。この側面はHLMVEC分離物の純度に厳密に関連しており、これは信頼できる結果を得るためにも関連している。さらに、肺サンプルのサイズが非常に小さく、外植片の直後にEC選別を行う可能性がない場合(これは、私たちの経験では、最も頻繁なシナリオでした)、汚染されたSMCはECよりも速く増殖するため、培養が引き継がれ、細胞選別後のECの収量が低下します。
本研究では、これらの点に対処しようとしました。このため、コラゲナーゼ消化後に肺検体に何が起こったかを最初に監視し、さまざまな細胞タイプ、特に混合培養で急速に成長し、HLMVECを追い抜く可能性のあるSMC(図2)によって重大な汚染が特定されました。したがって、消化後にこの汚染を即座に最小限に抑えるための戦略が設定されました(図1および図2)。驚くべきことに、~70%の純度のHLMVECs(図3A、B)は、最初の単離段階で一貫して得られました。この優れた結果は、FACSによるその後の精製ステップを容易にし、事実上純粋で機能的なHLMVECを得るという最終結果につながりました(図3C-E)。肺動脈セグメントを出発物質として使用し、HPAECを単離した細胞として使用した場合にも同様の結果が得られたため、この方法論は以前に報告された方法論の改善を表しています8。
シンプルで再現性がありますが、この手順には重要な要件があります。例えば、外科的切除から3〜6時間以内に得られた肺断片のみを処理することでHLMVECの分離に成功しましたが、間隔が長いほど転帰が悪かった(データ未掲載)。コラゲナーゼ消化時間は、酵素活性のロット間の変動により、EC収率に変動をもたらす可能性もあります24。別の重要な点は、サンプルの状態に関連しています。喫煙者または高齢ドナーに由来する肺実質は、低いHLMVEC収量を示しました。また、低速遠心分離の上清は、「チューブ2」に移されるいくつかの凝集体を含んでもよい。このため、「チューブ1」と「チューブ2」の内容物は、少なくとも細胞単離の初期段階では培養中に保つことをお勧めします。CD31+細胞の直接選別は、EC単離プロトコル11、12、15、17、18で前述したように、最初から純度を高めるための優れたソリューションを表すこともできます。分析された標本のサイズが小さいため、この初期の選別段階を適用しませんでした。ただし、この可能性は、プロトコルの実装で将来テストされます。
HLMVECおよびHPAECを単離するためのシンプルで信頼性の高い分離プロトコルは、特にこれらの細胞が市販されていない場合に、研究者がこの経路を利用して研究用の細胞を取得することを奨励します。例えば、CF肺からHLMECを単離すると、チップ25上に完全なCF気道を構築することができます。さらに、独自のECコレクションを作成することで、研究者はより多くの実験を低コストで計画および実行できるようになります。
結論として、この方法は、手術標本からのEC分離中に発生する可能性のあるいくつかの重要なポイントを解決し、既存の方法を改良し、ECの病態生物学と炎症の研究を容易にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係なしに実施されたと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、イタリア大学研究省(ex60%2021および2022)からR.P.への資金提供と、イタリア嚢胞性線維症財団(FFC#23/2014)およびイタリア保健省(L548/93)からM.R.への助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A.
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G.
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D.
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
