Summary
어렵지만 폐 내피 세포의 분리는 폐 염증 연구에 필수적입니다. 본 프로토콜은 대혈관 및 미세혈관 내피 세포의 고수율, 고순도 단리를 위한 절차를 설명한다.
Abstract
건강하고 병든 조직 및 기관에서 분리된 세포의 가용성은 개인화된 의학 접근의 핵심 요소입니다. 바이오뱅크는 생물의학 연구를 위한 광범위한 1차 및 불멸화 세포 컬렉션을 제공할 수 있지만, 이러한 것들이 모든 실험 요구, 특히 특정 질병이나 유전자형과 관련된 것들을 충족시키지는 못합니다. 혈관 내피 세포(EC)는 면역 염증 반응의 핵심 구성 요소이므로 다양한 장애의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 특히, 서로 다른 부위의 EC는 서로 다른 생화학적 및 기능적 특성을 나타내므로 신뢰할 수 있는 실험을 설계하는 데 특정 EC 유형(즉, 대혈관, 미세혈관, 동맥 및 정맥)의 가용성이 필수적입니다. 여기에서는 폐동맥 및 폐 실질로부터 고수율, 사실상 순수한 인간 대혈관 및 미세혈관 내피 세포를 얻기 위한 간단한 절차가 상세히 설명된다. 이 방법론은 상업적 출처로부터 독립성을 달성하고 아직 사용할 수 없는 EC 표현형/유전자형을 얻기 위해 모든 실험실에서 비교적 저렴한 비용으로 쉽게 재현할 수 있습니다.
Introduction
혈관 내피는 혈관의 내부 표면을 따라 늘어서 있습니다. 혈액 응고, 혈관 긴장도 및 면역 염증 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4. 인간 표본에서 분리된 내피 세포(EC)의 배양은 연구 목적에 필수적이지만 다른 혈관(동맥, 정맥, 모세혈관)의 EC는 특정 기능을 가지고 있다는 점에 유의해야 합니다. 이들은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에 의해 완전히 요약 될 수 없으며, 이는 혈관 내피 병태 생리학 5,6에 대한 연구에서 쉽게 이용 가능하고 널리 사용된다. 예를 들어, 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)는 백혈구 모집 및 축적을 조절하여 폐 염증에 중요한 역할을 합니다 4,7. 따라서 높은 충실도로 폐 염증을 재현하는 것을 목표로 하는 실험 환경에는 HLMVEC가 포함되어야 합니다. 반면에 EC 기능 장애는 여러 병리에서 관찰 될 수 있습니다. 따라서 환자의 EC는 질병의 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 구축하는 데 기본이 됩니다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)에 걸린 사람들의 이식된 폐에서 해부된 폐동맥(HPAEC)에서 EC 조각을 분리함으로써 이 질병에서 내피 기능 장애의 메커니즘을 밝힐 수 있었습니다 8,9.
따라서 질병 상태에서도 다양한 소스/기관으로부터 EC의 분리를 최적화하는 것을 목표로 하는 프로토콜은 특히 이러한 도구가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 연구자에게 귀중한 연구 도구를 제공하는 데 필수적입니다. HLMVEC 및 HPAEC 격리 프로토콜은 이전에 보고되었습니다 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 모든 경우에, 폐 표본의 효소적 소화는 혼합 세포 집단을 초래했으며, 이는 임시 선택적 배지 및 자기 비드 또는 세포 분석 기반 세포 분류를 사용하여 정제되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 최적화는 EC 분리의 두 가지 주요 문제를 해결해야 합니다: (1) EC 복제 노화를 최소화하기 위해 가능한 한 빠른 배양 통로에서 해결되어야 하는 세포 및 조직 오염20; (2) 1차 EC 분리주의 낮은 수율.
이 연구는 HLMVEC 및 HPAEC의 고수율, 고순도 분리를 위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 쉽게 적용할 수 있으며 몇 단계로 거의 순수한 대혈관 및 미세혈관 EC를 제공할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 승인되었으며 프로토콜은 키에티-페스카라 대학교(#237_2018bis)의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따랐습니다. 그림 1은 기흉 또는 폐엽 절제술과 같은 다양한 이유로 흉부 수술을 받는 비식별화된 인간 피험자(서면 동의 하에)로부터 폐 실질 또는 폐동맥의 세그먼트(1-3cm 길이)에서 내피 세포를 분리하는 것을 보여줍니다. 이 후자의 경우 외과의는 폐동맥 부분도 수집했습니다. 특히, 외과의는 암이 없는 샘플을 수집하도록 정확하게 지시받았습니다. 제시된 프로토콜은 가능한 최고의 수율과 순도를 얻기 위해 최적화되었습니다.
1. 실험 준비
- 콜라게나제 재구성
- 콜라게나제 분말을 CaCl 2 및 MgCl2(PBS--, 재료 표 참조)가 없는 인산염 완충 식염수에 2mg/mL 농도로 용해하고 0.22μm 공극 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
- 5mL 분취량을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 사용하기 전에 분취량을 해동하고 37°C로 예열합니다.
- 플레이트 코팅
- 플레이트 코팅의 경우 1.5% 젤라틴 용액 또는 50μg/mL 피브로넥틴( 재료 표 참조)을 배양 플레이트(500μL는 6웰 플레이트의 각 웰 표면을 덮기에 충분함)에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 배양 후, 과량의 젤라틴을 제거하고, PBS로 웰을 세척한다. PBS를 흡인하고 멸균 후드에서 플레이트를 건조시킵니다.
참고: 젤라틴 재구성을 위해 분말을 물에 용해시켜 1.5% 용액을 만든 다음 오토클레이브하고 4°C에서 보관합니다. 1.5 %의 젤라틴은 4 °C에서 액체가 아닙니다. 따라서 플레이트 코팅 전에 예열해야 합니다. 대안적으로, 세포 배양에 적합한 임의의 상업적 젤라틴 용액을 플레이트 코팅에 사용할 수 있다.
2. 시료 전처리
- 폐 실질
- 수집된 샘플을 PBS가 들어 있는 50mL 튜브에 담가 세척합니다.- - .
- 샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 수술 용 가위 (최적 크기 : >2cm)를 사용하여 샘플을 각각 약 3-4mm의 작은 조각으로 수동으로 자릅니다.
- 동맥 세그먼트
- 수집된 샘플을 PBS가 들어 있는 50mL 튜브에 담가 세척합니다.- - .
- 단편화는 동맥 분절의 단면의 표면적을 증가시켜 비 EC를 분리 할 가능성을 증가시키기 때문에 자르지 않고 멸균 된 페트리 접시로 옮깁니다.
3. 효소 소화
- 깍둑썰기한 폐 실질 또는 폐동맥 분절을 PBS--로 두 번 세척합니다. 이 단계는 잔류 혈액의 많은 부분을 제거합니다.
- 샘플을 15 mL 튜브에 넣고, 37°C 및 5%CO2에서 10분 동안 5 mL의 타입 2 콜라게나제(재료 표 참조)와 함께 인큐베이션한다. 이 배양 동안, 세포 외 기질의 분해는 단일 세포 및 세포 응집체를 방출한다.
4. 소화된 세포의 회복
- 멸균 강철/금속 여과기(즉, ~1mm 메쉬 크기의 차 여과기)를 50mL 수집 튜브 상단에 놓습니다.
- 15mL 튜브의 전체 내용물을 여과기에 붓고 주걱으로 소화된 조직을 부드럽게 마사지한 다음 수집 튜브가 채워질 때까지 PBS-로 샘플을 헹굽니다.
참고: 이 단계는 밀리미터 단위의 큰 조직 조각을 제거하여 후속 여과 단계의 효율성을 높입니다.
5. 여과에 의한 Non-EC 제거
- 4.2 단계에서 수집된 유출물을 70 μm 메쉬 크기의 셀 스트레이너를 이용하여 여과하고, 유출물을 새로운 50 mL 튜브에 수집하였다.
- 그런 다음 메쉬 크기가 40μm인 셀 스트레이너를 사용하여 유출물을 새 50mL 튜브에 수집합니다. 이 튜브에 "튜브 1"이라는 레이블을 붙입니다.
참고: 5.1단계와 5.2단계의 이러한 여과는 종종 혼합 세포 집단으로 구성된 큰 세포 응집체를 제거합니다.
6. 세포 클러스터의 침전 및 세포 파종
- 실온에서 5분 동안 30 x g 에서 샘플을 원심분리하여 세포 클러스터를 침전시킵니다.
- 멸균 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고(붓지 마십시오) 새 50mL 튜브("튜브 2")에 넣습니다.
- 펠릿을 "튜브 1"에 현탁하고 PBS--로 최대 50mL까지 튜브를 채웁니다. "튜브 2"를 PBS--로 최대 50mL까지 채웁니다.
알림: 이 단계부터 두 튜브는 동일한 방식으로 처리됩니다. - 샘플을 실온에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
- 펠릿을 2mL의 성장 배지로 현탁하고( 재료 표 참조), 미리 코팅된 6웰 플레이트의 두 개의 별도 웰에 현탁액을 시딩합니다(단계 1.2).
참고: 이 단계부터 정렬을 위한 합리적인 수의 세포를 얻기 위해 밀도에 도달할 때까지(샘플 크기에 따라 약 1주) 성장 배지를 2일마다 세포에 공급합니다.
7. 세포 확장
- CaCl2 및MgCl2(PBS++, 재료 표 참조)가 포함된 PBS 2mL로 세포를 세척하여 잔류 혈액 세포를 제거합니다(PBS++를 사용하는 것은 세포 분리를 방지하는 데 중요합니다).
- PBS++를 제거하고 새로운 배양 배지를 추가합니다.
- 세포가 밀도에 도달할 때까지 7.1단계와 7.2단계를 반복합니다(샘플 크기에 따라 약 1주).
8. 세포 분류
- 500 μL의 트립신-EDTA(0.05%, 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 분리하고, 원심분리하고, 190 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.
- 형광 접합체 항-인간 CD31-FITC 항체 10μL(1:20 희석, 표 참조)를 추가하고 세포 현탁액을 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 10mL의 PBS-를 사용하여 세포를 세척하고, 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 300μL의 PBS-에 펠릿을 재현탁합니다.
- 100μm 노즐을 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 CD31 양성(CD31+) 세포를 분리 및 수집하고 튜브에 수집합니다.
- 게이팅 전략에 따라 먼저 측면 산란 영역 매개변수인 SSC-A 및 FSC-A를 사용하여 세포 형태를 정의합니다. 그런 다음 FSC-Area/FSC-Height 또는 SSC-Area/SSC-Height 도트 플롯을 사용하여 단일 세포를 선택하고, 표시된 샘플의 양성 세포를 염색되지 않은 대조군 샘플과 비교하여 정의하고, 형광 세포를 수집 튜브(21)로 향하게 합니다.
- 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 펠릿을 6-웰 플레이트의 사전 코팅된 웰에 파종하기 위해 성장 배지 2 mL에 현탁시켰다.
9. 사후 분류 확장
- 세포 분류 2일 후, 조절된 배지를 신선한 성장 배지로 교체한다.
- 세포 확장을 위해 7.1 단계와 7.2 단계를 2 일마다 반복하십시오.
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Representative Results
HLMEC 격리
HLMVEC를 분리하는 동안 가장 큰 문제는 미세한 모세 혈관이 간질 조직에서 쉽게 분리 될 수 없기 때문에 오염 된 세포의 존재입니다. 따라서 분리 공정의 초기 단계에서 가능한 가장 높은 순도를 달성하는 것은 배양 계대 및 세포 노화를 줄이기 위해 중요합니다. 마찬가지로, 최적의 격리 프로토콜은 순수 HLMVEC의 가능한 가장 높은 수율을 제공해야 합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 이전에 설명된 프로토콜10,11,12,14,15에 따라 새로운 절차가 설정되었습니다.
폐 실질은 혈관이 심하여 HLMVEC의 훌륭한 공급원을 나타내지만 주로 평활근 세포(SMC), 콜라겐 섬유 및 섬유아세포로 채워져 있습니다. 이러한 세포, 특히 SMC는 다양한 배양 배지에 적응할 수 있으며 거의 모든 경우에 다른 세포 집단보다 훨씬 빠르게 시험관 내에서 복제되므로 혼합 세포 배양을 대신합니다. 따라서 우리의 첫 번째 관심사는 원치 않는 세포의 이월을 줄이기 위해 실질의 효소 소화를 보정하는 것이 었습니다. 제 2 형 콜라게나제는 나머지 모세 혈관에서 내피 세포 그룹을 빠르게 분리하기 때문에 폐 샘플의 소화 시간이 세포 오염을 최소화하는 데 중요 할 수 있다고 추론했습니다. 따라서, 첫 번째 단계로서, 절제된 폐 단편의 콜라게나제에 노출되는 시간은 제안된 20분 15분 대신 최대10 분으로 감소되었다(도 2A). 이 처리 후, SMC 및 섬유아세포를 포함한 세포 응집체의 일부는 여전히 장섬유에 결합되어 있는 반면(그림 2B), SMC는 비혈액 세포 단일항의 대부분을 나타내는 것으로 관찰되었습니다. 직경이 일반적으로 10-20 μm를 초과하지 않는 작고 조밀한 세포 클러스터도 기질 조직 단편(즉, 큰 섬유)에 기인하는 요소 없이 관찰되었습니다(그림 2B). 이러한 작은 세포 응집체는 주로 HLMVEC로 구성될 수 있다는 가설이 세워졌습니다.
이 가설에 따라 HLMVEC 회수율을 최대화하기 위해 연속 여과 단계를 수행했습니다. 첫 번째 여과를 위해 금속 스트레이너를 사용하고 모세관에서 HLMVEC가 빠져나갈 수 있도록 샘플을 핀셋으로 마사지했습니다(그림 2C, 오른쪽). 이 단계의 목적은 여전히 세포외 기질에 결합된 평활근 세포와 섬유아세포의 큰 클러스터를 제거하는 것이었습니다. 그런 다음 유출을 70μm 및 40μm 메쉬 크기 스트레이너의 시퀀스를 사용하여 여과하여 눈에 보이지는 않지만 잔류하는 큰 응집체를 제거했습니다(그림 2C, 가운데, 왼쪽). 세포 단일체를 제거하기 위해, 샘플을 30 x g 에서 5분 동안 원심분리하였는데, 이는 직경 >7-10 μm의 세포 및 응집체를 침전시키는 속도로, 더 작은 세포를 현탁액에 남겨둔다. 이러한 원심분리 매개변수는 순환 혈액 세포를 펠릿화하기 위해 Miron et al.에 의해 보고된 매개변수에 기초하여 선택되었다22. 특히, 이 원심분리 후, 상청액은 붉은 색을 띠었고(그림 2D), 많은 적혈구(직경 ~5μm)의 존재를 나타냅니다. 이 시점에서, 상청액을 조심스럽게 제거하고 제2 튜브에 넣었다. 상청액과 펠릿을 함유하는 두 튜브를 모두 PBS- 로 채우고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 함유한 튜브는 혈액 세포가 풍부한 적색 펠릿을 보였으며, 이는 또한 대부분의 이식된 세포 싱글렛을 포함하고 있음을 시사한다(그림 2E, 오른쪽).
수득한 펠릿을 내피 세포 성장 배지에 현탁시키고, 돼지 피부로부터 1.5% 젤라틴으로 미리 코팅된 6-웰 플레이트의 2개의 웰에 별도로 시딩하였다(도 2E, 중간). 3일 후, 세포를 PBS++로 세척하고, 새로운 배지를 공급하고, 이미지화하였다. 도 2E의 좌측에 나타낸 바와 같이, EC 섬은 "튜브 1"(위)로부터의 세포를 함유하는 웰에서 더 풍부하게 나타났으며, 반면에 "튜브 2"(아래)로부터의 세포를 함유하는 웰은 대부분 단일 및 비-내피 유사 세포에 의해 채워졌다.
이전 연구에서 보고된 덜 까다로운 HPAEC 분리 프로토콜에도 동일한 절차가 적용되었는데, HPAEC 분리는 오염 물질 셀에 비해 더 짧은 접착 시간을 이용하는 것과 관련이 있었다8. 크기가 크기 때문에 동맥은 잔류 결합 및 지방 조직에서 쉽게 청소할 수 있으므로 많은 비율의 비 EC를 제거할 수 있습니다. 그러나, 이 단계의 샘플에는 혈관 SMC 외에 많은 비율의 섬유아세포와 세포외 기질 섬유가 여전히 존재했다8. 새로운 절차는 HPAEC 외식편 동안 초기 EC 순도를 더욱 증가시켰습니다(결과는 표시되지 않음).
새로 분리된 HLMVEC의 정제 및 표현형 및 기능적 특성 분석
분리 프로토콜의 끝에서, HLMVECs의 순도를 세포막 CD31의 유세포 검출에 의해 분석하였다. CD31+ 세포 구획을 정확하게 식별하기 위해 전방 산란(FSC)/측면 산란(SSC) 도트 플롯에 게이트를 설정하고 형태학적으로 균질한 세포 집단을 식별했습니다. 이러한 집단을 FSC-면적/FSC-높이 도트 플롯에 표시하고, 단일 세포를 게이팅하고, CD31의 표면 발현에 대해 분석하였다(계층적 게이팅 전략, 도시되지 않음). 최상의 시나리오에서 ~70% 순수 HLMVEC 단일 세포(그림 3A,B)가 얻어졌습니다. 주목할 점은 수술 직후 샘플을 처리하지 않았거나 기증자가 노인이거나 흡연자일 때 HLMVEC 수율이 크게 감소했다는 것입니다.
보다 순수한 HLMVEC 제제를 얻기 위해 CD31+ 세포를 분류하고 1.5% 젤라틴 코팅된 배양 플레이트에 시딩했습니다. 분류된 세포는 특징적인 내피와 유사한 모양을 가정했으며(그림 3C), 그림 3D에 보고된 바와 같이 컨포칼 현미경은 FACS 정제 세포의 거의 100%가 EC 항원, 즉 CD31 및 보다 특이적인 von Willebrand 인자(vWF)23에 대해 양성으로 염색되었음을 보여주었습니다. 또한, 이들 세포가 Matrigel에 파종되었을 때, 그들은 HUVEC뿐만 아니라 관형 구조를 생성하여(그림 3E), 따라서 내피 표현형을 확인했습니다.
그림 1: 절차의 개략도. 순서도는 내피 세포 분리 및 비내피 세포 제거 절차를 보여줍니다. 각 단계는 실험 프로토콜의 2-6 단계에 설명된 이벤트를 요약합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 최적화된 EC 분리 절차의 그림. (A) 콜라게나제 소화 전에 작은 조각으로 깍둑썰기하고 5mL의 유형 2 콜라게나제가 들어 있는 15mL 튜브에서 배양한 폐 실질 표본의 대표 이미지(오른쪽). (B) 콜라게나제 소화 후 얻은 세포 집단의 개략도(왼쪽) 및 실제(오른쪽; 배율: 100x) 표현. 이러한 모집단에는 비-EC와 EC의 단일체, EC의 그룹, 그리고 스트레이너를 사용하여 제거되는 섬유에 결합된 비-EC의 그룹이 포함됩니다. (C) 금속 70 μm 및 40 μm 메쉬 스트레이너를 사용한 연속 여과. (D) 저속 원심분리 후 "튜브 1" 및 "튜브 2"의 펠릿에서 상층액을 분리하기 전의 50mL 튜브 이미지. 세포 클러스터는 펠릿에 포함되어 있는 반면 단일 세포는 대부분 상청액에 포함되어 있습니다. (e) 펠릿 및 "튜브 1"(상부) 및 "튜브 2"(하부)로부터 분리된 세포의 상이한 색상 및 조성을 나타내는 이미지; 배율 : 100x. 약어: EC = 내피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HLMVEC 표현형 및 기능적 특성화 . (A) 폐 실질 외식편으로부터 얻은 혼합 세포 집단. (b) CD31 검출은 제1 계대 말단의 세포 표면에서 유세포 분석에 의한 검출. 백분율 순도(70%)는 사용된 계층적 게이팅 전략을 나타냅니다. (C) CD31 항원에 대해 생분류된 후의 순수한 HLMVEC. (D) CD31(왼쪽) 및 vWF(오른쪽) 양성 염색의 대표적인 면역형광 공초점 현미경 이미지(스케일 막대: 50μm). (E) 명시야 이미지는 Matrigel에서 HUVEC 또는 HLMVEC를 시딩한 후 6시간 후에 캡처되었습니다.배율(A, C, E): 100x. 약어: HLMVECs = 인간 폐 미세혈관 내피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 병태생리학에서 혈관 내피 세포가 수행하는 다양한 역할은 이러한 세포를 체외 병인 및 약리학 연구에 없어서는 안될 도구로 만듭니다. 다른 혈관 부위/기관의 EC는 독특한 특징과 기능을 나타내기 때문에 관심 기관에서 건강하고 병든 EC를 사용할 수 있는 것이 연구 목적에 이상적입니다. 예를 들어, HLMVEC는 폐 염증에 대한 연구에 필수적입니다. 따라서 이러한 세포의 고수율, 고순도 분리를 위한 방법론은 다양한 연구 분야에 도움이 될 것입니다.
HLMVEC를 분리하는 방법은 다양한 그룹 10,11,12,14,15,17,18,19에 의해 보고되었다. 각 방법은 자성 비드(11,12,15,17,18)를 사용한 세포 분류 또는 뭉툭한 캐뉼라(17,18)를 사용한 기계적 해리와 같은 혁신적인 접근법을 도입하였다. 본 프로토콜은 콜라게나제 소화 후 얻은 내피 세포의 작은 섬을 수집하도록 설계되었으며 침강 시간 기반 연속 원심분리를 사용하여 초기 혼합 세포 집단에서 EC의 순도를 높였습니다. 시작 세포 수가 높을수록 실험에 필요한 세포 수에 도달하기 위해 더 적은 수의 시험관 내 확장이 필요하기 때문에 이 점은 매우 중요하며, 이는 EC가 노화되기 전에 더 많은 조사를 완료할 수 있음을 의미합니다. 이 측면은 HLMVEC 분리 물의 순도와 밀접한 관련이 있으며, 이는 신뢰할 수있는 결과를 얻는 데에도 관련이 있습니다. 더욱이, 폐 샘플의 크기가 매우 작고 우리의 경험상 가장 빈번한 시나리오였던 체외이식편 직후 EC 분류를 수행할 가능성이 없는 경우, 오염된 SMC가 EC보다 빠르게 성장하여 배양을 인수하고 세포 분류 후 EC의 수율을 감소시킵니다.
이 연구에서 우리는 이러한 점을 해결하려고 노력했습니다. 이를 위해 콜라게나제 소화 후 폐 표본에 어떤 일이 일어났는지 초기에 모니터링했으며, 다양한 세포 유형, 특히 빠르게 성장하고 혼합 배양에서 HLMVEC를 추월할 수 있는 SMC(그림 2)에 의해 상당한 오염이 확인되었습니다. 따라서 소화 후 이러한 오염을 즉시 최소화하기 위한 전략을 설정했습니다(그림 1 및 그림 2). 놀랍게도, ~70% 순도의 HLMVEC(그림 3A,B)는 첫 번째 분리 단계에서 일관되게 얻어졌습니다. 이 우수한 결과는 FACS에 의한 후속 정제 단계를 용이하게 하여 사실상 순수하고 기능적인 HLMVEC를 얻는 최종 결과로 이어졌습니다(그림 3C-E). 폐동맥 분절이 출발 물질로 사용되고 HPAEC가 분리된 세포였을 때도 유사한 결과가 얻어졌는데, 이는 이 방법론이 이전에 보고된 방법론의 개선을 나타낸다는것을 의미한다 8.
이 절차에는 간단하고 재현 가능하지만 주요 요구 사항이 있습니다. 예를 들어, 외과적 절제로부터 3-6시간 이내에 얻은 폐 조각만 처리하여 HLMVEC 분리에 성공한 반면, 더 긴 간격은 좋지 않은 결과와 관련이 있었습니다(데이터는 표시되지 않음). 콜라게나제 소화 시간은 또한 효소 활성의 로트 간 변화로 인해 EC 수율의 변동성을 유발할 수 있다24. 또 다른 중요한 점은 샘플 상태와 관련이 있습니다. 흡연자 또는 노인 기증자로부터 유래 된 폐 실질은 낮은 HLMVEC 수율을 나타냈다. 또한, 저속 원심 분리의 상청액은 "튜브 2"로 옮겨지는 일부 응집체를 포함 할 수있다. 이러한 이유로 "튜브 1"과 "튜브 2"의 내용물을 적어도 세포 분리 초기 단계에서 배양 물에 보관하는 것이 좋습니다. EC 분리 프로토콜 11,12,15,17,18에서 앞서 설명한 바와 같이 CD31+ 세포의 직접 분류는 또한 처음부터 순도를 증가시키기 위한 좋은 솔루션을 나타낼 수 있습니다. 분석된 시편의 크기가 작기 때문에 이 초기 분류 단계를 적용하지 않았습니다. 그러나 이러한 가능성은 향후 프로토콜 구현에서 테스트될 것입니다.
HLMVEC 및 HPAEC를 분리하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 분리 프로토콜은 특히 이러한 세포가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 연구자가 이 경로를 활용하여 연구를 위한 세포를 얻도록 권장합니다. 예를 들어, CF 폐로부터 HLMEC를 단리하는 것은 칩(25) 상에 완전한 CF 기도의 구축을 허용할 것이다. 또한 자체 EC 컬렉션을 만들면 연구원이 더 낮은 비용으로 더 많은 실험을 계획하고 실행할 수 있습니다.
결론적으로, 수술 표본에서 EC를 분리하는 동안 발생할 수 있는 몇 가지 중요한 사항을 해결하는 이 방법은 기존 방법을 개선하여 EC 병리학 및 염증에 대한 연구를 용이하게 합니다.
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Disclosures
저자는 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 이탈리아 대학 연구부(ex 60% 2021 및 2022)에서 RP에 대한 자금과 이탈리아 낭포성 섬유증 재단(FFC#23/2014) 및 이탈리아 보건부(L548/93)에서 MR에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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