Summary
Apesar de desafiador, o isolamento das células endoteliais pulmonares é essencial para estudos sobre inflamação pulmonar. O presente protocolo descreve um procedimento para o isolamento de alto rendimento e pureza de células endoteliais macrovasculares e microvasculares.
Abstract
A disponibilidade de células isoladas de tecidos e órgãos saudáveis e doentes representa um elemento-chave para abordagens de medicina personalizada. Embora os biobancos possam fornecer uma ampla coleção de células primárias e imortalizadas para pesquisa biomédica, estes não cobrem todas as necessidades experimentais, particularmente aquelas relacionadas a doenças ou genótipos específicos. As células endoteliais vasculares (CEs) são componentes-chave da reação inflamatória imune e, portanto, desempenham um papel central na patogênese de uma variedade de doenças. Notavelmente, CE de diferentes sítios exibem diferentes propriedades bioquímicas e funcionais, tornando a disponibilidade de tipos específicos de CE (isto é, macrovascular, microvascular, arterial e venosa) essencial para o planejamento de experimentos confiáveis. Aqui, procedimentos simples para a obtenção de células endoteliais macrovasculares e microvasculares humanas de alto rendimento, virtualmente puras, da artéria pulmonar e do parênquima pulmonar são ilustrados em detalhes. Esta metodologia pode ser facilmente reproduzida a um custo relativamente baixo por qualquer laboratório para alcançar independência de fontes comerciais e obter fenótipos/genótipos CE que ainda não estão disponíveis.
Introduction
O endotélio vascular reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos. Desempenha papéis fundamentais na regulação da coagulação sanguínea, do tônus vascular e da resposta imune-inflamatória 1,2,3,4. Embora a cultura de células endoteliais (CEs) isoladas de espécimes humanos seja essencial para fins de pesquisa, deve-se ressaltar que as CE de diferentes vasos sanguíneos (artérias, veias, capilares) têm funções específicas. Estas não podem ser totalmente recapituladas pelas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), que são facilmente disponíveis e amplamente utilizadas em estudos sobre a fisiopatologia do endotéliovascular5,6. Por exemplo, as células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HLMVECs) desempenham papéis fundamentais na inflamação pulmonar, controlando o recrutamento e o acúmulo de leucócitos 4,7. Assim, um cenário experimental que vise reproduzir a inflamação pulmonar com alta fidelidade deve incluir os HLMVECs. Por outro lado, a disfunção do CE pode ser observada em diversas patologias; portanto, as CE do paciente são fundamentais para a construção de um modelo in vitro confiável da doença. Por exemplo, o isolamento de fragmentos de CE da artéria pulmonar (CEAP), dissecados dos pulmões explantados de pessoas acometidas pela fibrose cística (FC), permitiu desvendar mecanismos de disfunção endotelial nessa doença 8,9.
Assim, protocolos que visem otimizar o isolamento de CEs de diferentes fontes/órgãos também em estados patológicos são essenciais para fornecer aos investigadores ferramentas valiosas de pesquisa, particularmente quando essas ferramentas não estão disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento de HLMVEC e HPAEC foram previamente relatados 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Em todos os casos, a digestão enzimática dos espécimes pulmonares resultou em populações de células mistas, que foram purificadas usando meios seletivos ad hoc e classificação celular baseada em esferas magnéticas ou citométricas. Otimizações adicionais desses protocolos devem abordar duas questões principais no isolamento da CE: (1) contaminação celular e tecidual, que deve ser resolvida o mais cedo possível para minimizar a senescência replicativa da CE20; e (2) o baixo rendimento de isolados primários de CE.
Este estudo descreve um novo protocolo para o isolamento de alto rendimento e alta pureza de HLMVECs e HPAECs. Este procedimento pode ser facilmente aplicável e fornecer CE macrovascular e microvascular virtualmente puras em poucos passos.
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Protocol
Este estudo foi aprovado e o protocolo seguiu as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da Universidade de Chieti-Pescara (#237_2018bis). A Figura 1 ilustra o isolamento de células endoteliais de segmentos (1-3 cm de comprimento) de parênquima pulmonar ou artéria pulmonar de indivíduos humanos não identificados (com consentimento por escrito) submetidos à cirurgia torácica por vários motivos, como pneumotórax ou lobectomia. Neste último caso, os cirurgiões também coletaram um segmento de artéria pulmonar. Notavelmente, os cirurgiões foram instruídos com precisão para coletar amostras livres de câncer. O protocolo apresentado foi otimizado para obter o maior rendimento e pureza possíveis.
1. Preparação experimental
- Reconstituição da colagenase
- Dissolver a colagenase em pó em solução salina tamponada com fosfato sem CaCl 2 e MgCl 2 (PBS−−, ver Tabela de Materiais) na concentração de2 mg/mL e filtrar a solução usando um filtro de poros de 0,22 μm.
- Preparar alíquotas de 5 ml e armazená-las a -20 °C. Descongelar e pré-aquecer as alíquotas a 37 °C antes da utilização.
- Revestimento de chapas
- Para revestimento de placas, pipetar solução de gelatina a 1,5% ou fibronectina de 50 μg/mL (ver Tabela de Materiais) para a placa de cultura (500 μL é suficiente para cobrir a superfície de cada poço de uma placa de 6 poços) e incubar por 1 h a 37 °C.
- Após a incubação, retire o excesso de gelatina e lave os poços com PBS−−. Aspirar o PBS−− e deixar a placa secar em uma capa estéril.
NOTA: Para a reconstituição da gelatina, dissolver o pó em água para fazer uma solução a 1,5%, depois autoclavá-lo e armazenar a 4 °C. A gelatina a 1,5% não é líquida a 4 °C; portanto, deve ser aquecido antes do revestimento da placa. Alternativamente, qualquer solução de gelatina comercial adequada para culturas de células pode ser usada para o revestimento da placa.
2. Preparo da amostra
- Parênquima pulmonar
- Lave as amostras coletadas imergindo-as em um tubo de 50 mL contendo PBS−−.
- Transfira as amostras para uma placa de Petri estéril e pique manualmente a amostra com uma tesoura cirúrgica (tamanho ideal: >2 cm) em pequenos fragmentos de cerca de 3-4 mm cada.
- Segmento(s) arterial(is)
- Lave as amostras coletadas imergindo-as em um tubo de 50 mL contendo PBS−−.
- Transfira para uma placa de Petri estéril sem picar, pois a fragmentação aumentará a área de superfície do corte transversal do segmento arterial, aumentando a possibilidade de isolamento de não-CE.
3. Digestão enzimática
- Lave o parênquima pulmonar cortado em cubos ou o(s) segmento(s) da artéria pulmonar duas vezes com PBS−−. Esta etapa removerá uma grande parte do sangue residual.
- Colocar as amostras em tubos de 15 ml e incubar com 5 ml de colagenase tipo 2 (ver Tabela de Materiais) durante 10 minutos a 37 °C e 5% de CO2. Durante essa incubação, a degradação da matriz extracelular libera células únicas e agregados celulares.
4. Recuperação das células digeridas
- Coloque um filtro estéril de aço/metal (ou seja, um filtro de chá com um tamanho de malha de ~1 mm) na parte superior de um tubo de coleta de 50 mL.
- Despeje todo o conteúdo do tubo de 15 mL no filtro, massageie suavemente o tecido digerido com uma espátula e lave a amostra com PBS−− até que o tubo de coleta esteja cheio.
NOTA: Esta etapa eliminará grandes fragmentos de tecido na escala milimétrica, garantindo maior eficiência das etapas subsequentes de filtração.
5. Remoção não-CE por filtração
- Filtrar o fluxo de saída coletado na etapa 4.2 usando um filtro de células com malha de 70 μm e coletar o fluxo de saída em um tubo fresco de 50 mL.
- Em seguida, use um filtro celular com malha de 40 μm e colete a saída em um tubo fresco de 50 mL. Rotule este tubo como "tubo 1".
NOTA: Essas filtrações na etapa 5.1 e na etapa 5.2 removerão grandes agregados celulares, que geralmente são compostos por populações de células mistas.
6. Sedimentação de aglomerados celulares e semeadura celular
- Centrifugar as amostras a 30 x g durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar os aglomerados celulares.
- Retire cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta estéril (não despeje) e coloque-o em um tubo fresco de 50 mL ("tubo 2").
- Suspender o pellet no "tubo 1" e encher o tubo até 50 mL com PBS−−. Encher o "tubo 2" até 50 mL com PBS−−.
NOTA: A partir desta etapa, ambos os tubos são tratados da mesma forma. - Centrifugar as amostras a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Suspender os pellets com 2 ml de meio de crescimento (ver Tabela de Materiais) e semear a suspensão em dois poços separados de uma placa pré-revestida de 6 poços (passo 1.2).
NOTA: A partir desta etapa, alimentar as células a cada 2 dias com o meio de crescimento até que atinjam a confluência (aproximadamente 1 semana, dependendo do tamanho da amostra), a fim de obter um número razoável de células para triagem.
7. Expansão celular
- Lave as células com 2 mL de PBS com CaCl 2 e MgCl2 (PBS++, ver Tabela de Materiais) para remover as células sanguíneas residuais (o uso de PBS++ é importante para evitar o descolamento celular).
- Remova o PBS++ e adicione o meio de cultura fresco.
- Repetir as etapas 7.1 e 7.2 até que as células atinjam a confluência (aproximadamente 1 semana, dependendo do tamanho da amostra).
8. Classificação de células
- Separar as células usando 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%, ver Tabela de Materiais), centrifugar e ressuspender o pellet com 190 μL de PBS−−.
- Adicionar 10 μL de um anticorpo anti-humano CD31-FITC conjugado fluorescente (diluição 1:20, ver Tabela de Materiais) e incubar a suspensão celular a 4 °C durante 30 minutos.
- Lavar as células usando 10 mL de PBS−−, centrifugar a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e ressuspender o pellet em 300 μL de PBS−−.
- Isolar e coletar células CD31 positivas (CD31+) por triagem celular ativada por fluorescência (FACS), usando um bico de 100 μm, e coletá-las em um tubo.
- De acordo com a estratégia de gating, primeiro defina a morfologia celular usando os parâmetros de área de espalhamento lateral, SSC-A e FSC-A. Em seguida, selecione células únicas usando um gráfico de pontos FSC-Área/FSC-Altura ou SSC-Área/SSC-Altura, defina as células positivas na amostra marcada versus a amostra controle não corada e direcione as células fluorescentes para o tubo de coleta21.
- Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e suspender o pellet em 2 mL de meio de cultura para semeadura nos poços pré-revestidos de placa de 6 poços.
9. Expansão pós-triagem
- Dois dias após a triagem celular, substituir o meio condicionado por meio de crescimento fresco.
- Repita as etapas 7.1 e 7.2 a cada 2 dias para expansão celular.
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Representative Results
Isolamento HLMEC
O principal problema durante o isolamento dos HLMVECs é a presença de células contaminantes, uma vez que os capilares microscópicos não podem ser facilmente separados do tecido estromal. Portanto, alcançar a maior pureza possível nos estágios iniciais do processo de isolamento é crucial para reduzir as passagens de cultura e, assim, o envelhecimento celular. Da mesma forma, um protocolo de isolamento ótimo deve fornecer o maior rendimento possível de HLMVECs puros. Para atingir esses objetivos, um novo procedimento foi instituído com base em protocolos previamente descritos 10,11,12,14,15.
Embora o parênquima pulmonar seja altamente vascularizado, representando uma excelente fonte de HLMVECs, é amplamente povoado por células musculares lisas (CMLs), fibras colágenas e fibroblastos. Essas células, especialmente as SMCs, podem se adaptar a uma variedade de meios de cultura e, em quase todos os casos, replicar-se in vitro muito mais rápido do que outras populações celulares, o que significa que elas assumem a cultura de células mistas. Portanto, nossa primeira preocupação foi calibrar a digestão enzimática do parênquima para reduzir o carryover de células indesejadas. Como a colagenase tipo 2 rapidamente desprende grupos de células endoteliais do restante do capilar, pensamos que o tempo de digestão da amostra pulmonar poderia ser crucial para minimizar a contaminação celular. Portanto, como primeiro passo, o tempo de exposição à colagenase do fragmento pulmonar excisado foi reduzido para no máximo 10 min, em vez dos 20 min sugeridos15 (Figura 2A). Após esse tratamento, observou-se que parte dos agregados celulares, incluindo as CMS e fibroblastos, ainda estavam ligadas às fibras longas (Figura 2B), enquanto as CMS representavam a maioria dos singletes não sanguíneos. Pequenos aglomerados compactos de células, com diâmetros geralmente não superiores a 10-20 μm, também foram observados sem elementos atribuíveis a fragmentos de tecido estromal (isto é, fibras grandes) (Figura 2B). Foi levantada a hipótese de que esses agregados de pequenas células poderiam ser compostos principalmente por HLMVECs.
Seguindo essa hipótese, etapas seriadas de filtração foram realizadas para maximizar a recuperação do HLMVEC. Para a primeira filtração, foi utilizado um filtro metálico e a amostra foi massageada com pinça para facilitar o escape dos HLMVECs dos capilares (Figura 2C, à direita). O objetivo desta etapa foi remover os grandes aglomerados de células musculares lisas e fibroblastos ainda ligados à matriz extracelular. A vazão foi então filtrada usando uma sequência de filtros de malha de 70 μm e 40 μm para remover os agregados residuais grandes, embora não visíveis aos olhos (Figura 2C, meio, esquerda). Para a remoção dos singletes celulares, as amostras foram centrifugadas a 30 x g por 5 min, velocidade que sedimenta as células e agregados com diâmetro >7-10 μm, deixando as células menores em suspensão. Esses parâmetros de centrifugação foram escolhidos com base nos relatados por Miron e col. para peletização de células sanguíneas circulantes22. Notadamente, após essa centrifugação, o sobrenadante ficou de cor vermelha (Figura 2D), indicando a presença de muitas hemácias (~5 μm de diâmetro). Nesse momento, o sobrenadante foi cuidadosamente retirado e colocado em um segundo tubo. Ambos os tubos contendo o sobrenadante e o pellet foram preenchidos com PBS−− e centrifugados a 300 x g por 5 min. Após a centrifugação, o tubo contendo o sobrenadante mostrou uma pastilha vermelha enriquecida em células sanguíneas, sugerindo que também continha a maioria dos singlets celulares explantados (Figura 2E, à direita).
Os pellets obtidos foram suspensos com o meio de crescimento de células endoteliais e semeados separadamente em dois poços de uma placa de 6 poços, os quais foram pré-revestidos com gelatina a 1,5% de pele suína (Figura 2E, meio). Após 3 dias, as células foram lavadas com PBS++, alimentadas com meio fresco e imageadas. Como mostrado à esquerda da Figura 2E, as ilhas CE foram mais abundantes no poço contendo as células do "tubo 1" (acima), enquanto o poço contendo as células do "tubo 2" (abaixo) foi povoado principalmente por células únicas e não endoteliais.
O mesmo procedimento foi aplicado ao protocolo de isolamento de HPAEC menos desafiador que foi relatado em nosso trabalho anterior, no qual a separação HPAEC envolveu explorar seu menor tempo de adesão em comparação com o de células contaminantes8. Devido ao seu grande tamanho, as artérias podem ser facilmente limpas dos tecidos conjuntivo e adiposo residual, eliminando assim uma grande proporção de não-CE. Entretanto, uma grande proporção de fibroblastos e fibras da matriz extracelular ainda estava presente nas amostras nessa fase, além das CMLs vasculares8. O novo procedimento aumentou ainda mais a pureza CE inicial durante os explantes de HPAEC (resultados não mostrados).
Purificação e caracterização fenotípica e funcional de HLMVECs recém-isolados
Ao final do protocolo de isolamento, a pureza dos HLMVECs foi analisada por citometria de fluxo da membrana celular CD31. Para identificar corretamente o compartimento celular CD31+, uma porta foi estabelecida em um gráfico de pontos de dispersão direta (FSC)/dispersão lateral (SSC), e uma população morfologicamente homogênea de células foi identificada. Tal população foi representada em um dot plot FSC-Área/FSC-Altura, e células isoladas foram fechadas e analisadas quanto à expressão superficial de CD31 (estratégia de gating hierárquico, não mostrada). Na melhor das hipóteses, ~70% de células isoladas puras do HLMVEC (Figura 3A,B) foram obtidas. Vale ressaltar que o rendimento do HLMVEC foi significativamente reduzido quando a amostra não foi processada imediatamente após a cirurgia ou quando o doador era idoso ou fumante.
Para obter preparações HLMVEC mais puras, as células CD31+ foram separadas e semeadas em placas de cultura revestidas com gelatina a 1,5%. As células selecionadas assumiram a forma endotelial característica (Figura 3C) e, como relatado na Figura 3D, a microscopia confocal mostrou que quase 100% das células purificadas pelo FACS foram positivas para antígenos CE, ou seja, CD31 e o fator de von Willebrand mais específico (FvW)23. Além disso, quando essas células foram semeadas em Matrigel, geraram estruturas tubulares, assim como HUVECs (Figura 3E), confirmando seu fenótipo endotelial.
Figura 1: Representação esquemática do procedimento. O fluxograma mostra o procedimento para isolamento das células endoteliais e remoção das células não endoteliais. Cada etapa recapitula os eventos descritos nas etapas 2 a 6 do protocolo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração do procedimento otimizado de isolamento da CE. (A) Imagem representativa de um espécime de parênquima pulmonar cortado em pequenos fragmentos antes da digestão da colagenase (esquerda) e incubado em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de colagenase tipo 2 (direita). (B) Representação esquemática (esquerda) e real (direita; aumento: 100x) das populações celulares obtidas após a digestão da colagenase. Essas populações incluem singlets de não-CE e CEs, grupos de CEs e grupos de não-CE ligadas a fibras, que são removidas usando filtros. (C) Filtrações seriadas utilizando filtros de malha metálica de 70 μm e 40 μm. (D) Imagem do tubo de 50 mL após centrifugação em baixa velocidade e antes de separar os sobrenadantes dos pellets no "tubo 1" e no "tubo 2". Os aglomerados celulares estão contidos na pelota, enquanto as células individuais estão principalmente contidas no sobrenadante. (E) Imagem mostrando as diferentes cores e composições do pellet e das células isoladas do "tubo 1" (superior) e do "tubo 2" (inferior); Ampliação: 100x. Abreviação: EC = células endoteliais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização fenotípica e funcional do HLMVEC . (A) População celular mista obtida de um explante de parênquima pulmonar. (B) detecção de CD31 por citometria de fluxo na superfície das células no final da primeira passagem. O percentual de pureza (70%) refere-se à estratégia de gating hierárquico utilizada. (C) HLMVECs puros após triagem ao vivo para o antígeno CD31. (D) Imagens microscópicas confocais representativas de imunofluorescência de coloração positiva para CD31 (esquerda) e FvW (direita) (barra de escala: 50 μm). (E) Imagens de campo claro foram capturadas 6 h após a semeadura de HUVECs ou HLMVECs em Matrigel.Ampliação (A, C, E): 100x. Abreviações: HLMVECs = human lung microvascular endothelial cells. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os múltiplos papéis desempenhados pelas células endoteliais vasculares na fisiopatologia humana fazem dessas células uma ferramenta indispensável para estudos patogênicos e farmacológicos in vitro . Uma vez que CEs de diferentes sítios/órgãos vasculares apresentam características e funções peculiares, a disponibilidade de CE saudáveis e doentes do órgão de interesse seria ideal para fins de pesquisa. Por exemplo, os HLMVECs são essenciais para estudos sobre inflamação pulmonar; Portanto, uma metodologia para o isolamento de alto rendimento e alta pureza dessas células beneficiará diferentes campos de pesquisa.
Métodos para isolar HLMVECs têm sido relatados por vários grupos 10,11,12,14,15,17,18,19. Cada método introduziu abordagens inovadoras, como a triagem celular com esferas magnéticas 11,12,15,17,18 ou dissociação mecânica usando cânula romba17,18. O presente protocolo foi projetado para coletar as pequenas ilhotas de células endoteliais obtidas após digestão da colagenase e usou centrifugações seriadas baseadas no tempo de sedimentação para aumentar a pureza das CEs na população inicial de células mistas. Esse ponto é crucial, uma vez que um número maior de células iniciais significa que um número menor de expansões in vitro é necessário para atingir o número de células necessárias para os experimentos, o que, por sua vez, significa que mais investigações podem ser concluídas antes da senescência da CE. Esse aspecto está estritamente relacionado ao grau de pureza dos isolados de HLMVEC, o que também é relevante para a obtenção de resultados confiáveis. Além disso, se a amostra de pulmão for muito pequena e não houver possibilidade de realizar a triagem CE imediatamente após o explante, que foi, em nossa experiência, o cenário mais frequente, as CEs contaminantes crescerão mais rapidamente do que as CEs, assumindo assim a cultura e reduzindo o rendimento das CEs após a triagem celular.
Neste estudo, procurou-se abordar esses pontos. Para isso, o que aconteceu com os espécimes pulmonares após a digestão da colagenase foi inicialmente monitorado, e contaminação significativa foi identificada por diferentes tipos celulares, particularmente SMCs (Figura 2), que crescem rapidamente e podem ultrapassar os HLMVECs em culturas mistas. Portanto, uma estratégia foi definida para minimizar essa contaminação de forma imediata após a digestão (Figura 1 e Figura 2). Notavelmente, HLMVECs com ~70% de pureza (Figura 3A,B) foram consistentemente obtidos na primeira fase de isolamento. Esse excelente resultado facilitou a etapa subsequente de purificação pelo FACS, levando ao resultado final da obtenção de HLMVECs praticamente puros e funcionais (Figura 3C-E). Resultados semelhantes foram obtidos quando segmentos de artéria pulmonar foram usados como material de partida e HPAEC foram as células isoladas, significando que essa metodologia representa um aprimoramento da metodologia relatada anteriormente8.
Apesar de simples e reprodutível, esse procedimento possui requisitos fundamentais. Por exemplo, obtivemos sucesso no isolamento do HLMVEC processando apenas fragmentos pulmonares obtidos dentro de 3-6 h da excisão cirúrgica, enquanto intervalos mais longos foram associados a resultados ruins (dados não mostrados). O tempo de digestão da colagenase também pode introduzir variabilidade no rendimento de CE devido às variações lote a lote na atividade enzimática24. Outro ponto crítico diz respeito à condição da amostra. O parênquima pulmonar derivado de fumantes ou doadores idosos apresentou baixos rendimentos de HLMVEC. Além disso, o sobrenadante da centrifugação de baixa rotação pode conter alguns agregados que são transferidos para o "tubo 2". Por esta razão, recomenda-se manter o conteúdo do "tubo 1" e do "tubo 2" em cultura, pelo menos durante a fase inicial do isolamento celular. A triagem direta de células CD31+, como descrito anteriormente em protocolos de isolamento de CE11,12,15,17,18, também pode representar uma boa solução para aumentar a pureza desde o início. Não aplicamos esta etapa inicial de triagem devido ao pequeno tamanho dos espécimes analisados. No entanto, essa possibilidade será testada no futuro na implementação do protocolo.
Um protocolo de isolamento simples e confiável para isolar HLMVECs e HPAECs encorajará os investigadores a utilizar essa rota para obter células para seus estudos, particularmente quando essas células não estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, o isolamento dos HLMECs dos pulmões da FC permitirá a construção de uma via aérea completa da FC em um chip25. Além disso, a criação da sua própria colecção CE permitirá aos investigadores planear e executar mais experiências a um custo mais baixo.
Em conclusão, este método, que resolve alguns pontos críticos que podem ocorrer durante o isolamento da CEC das peças cirúrgicas, melhora os métodos existentes, facilitando a pesquisa sobre a patobiologia e inflamação da CE.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida sem quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos do Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa (ex 60% 2021 e 2022) para R. P. e por subsídios da Fundação Italiana de Fibrose Cística (FFC#23/2014) e do Ministério da Saúde italiano (L548/93) para M. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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