Summary
على الرغم من التحدي ، فإن عزل الخلايا البطانية الرئوية ضروري للدراسات حول التهاب الرئة. يصف هذا البروتوكول إجراء للعزل عالي الغلة وعالي النقاء للخلايا البطانية الوعائية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة.
Abstract
يمثل توافر الخلايا المعزولة من الأنسجة والأعضاء السليمة والمريضة عنصرا أساسيا لنهج الطب الشخصي. على الرغم من أن البنوك الحيوية يمكن أن توفر مجموعة واسعة من الخلايا الأولية والخالدة للبحوث الطبية الحيوية ، إلا أنها لا تغطي جميع الاحتياجات التجريبية ، لا سيما تلك المتعلقة بأمراض أو أنماط وراثية معينة. الخلايا البطانية الوعائية (ECs) هي المكونات الرئيسية للتفاعل الالتهابي المناعي ، وبالتالي ، تلعب دورا مركزيا في التسبب في مجموعة متنوعة من الاضطرابات. والجدير بالذكر أن ECs من مواقع مختلفة تعرض خصائص كيميائية حيوية ووظيفية مختلفة ، مما يجعل توفر أنواع محددة من EC (أي الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة والشرايين والوريدية) أمرا ضروريا لتصميم تجارب موثوقة. هنا ، يتم توضيح الإجراءات البسيطة للحصول على خلايا بطانة الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة البشرية عالية الغلة والنقية تقريبا من الشريان الرئوي وحمة الرئة بالتفصيل. يمكن إعادة إنتاج هذه المنهجية بسهولة بتكلفة منخفضة نسبيا من قبل أي مختبر لتحقيق الاستقلال عن المصادر التجارية والحصول على الأنماط الظاهرية / الأنماط الجينية EC التي لم تتوفر بعد.
Introduction
تبطن البطانة الوعائية السطح الداخلي للأوعية الدموية. يلعب أدوارا رئيسية في تنظيم تخثر الدم ، ونغمة الأوعية الدموية ، والاستجابات المناعيةالالتهابية 1،2،3،4. على الرغم من أن ثقافة الخلايا البطانية (ECs) المعزولة من العينات البشرية ضرورية لأغراض البحث ، إلا أنه يجب ملاحظة أن ECs من الأوعية الدموية المختلفة (الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية) لها وظائف محددة. لا يمكن تلخيصها بالكامل بواسطة الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) ، والتي تتوفر بسهولة وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية للبطانة الوعائية 5,6. على سبيل المثال ، تلعب الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية (HLMVECs) أدوارا رئيسية في التهاب الرئة من خلال التحكم في تجنيد الكريات البيض وتراكمها 4,7. وبالتالي ، يجب أن يشمل الإعداد التجريبي الذي يهدف إلى إعادة إنتاج التهاب الرئة بدقة عالية HLMVECs. من ناحية أخرى ، يمكن ملاحظة خلل EC في العديد من الأمراض. لذلك ، تعتبر ECs من المريض أساسية لبناء نموذج موثوق به في المختبر للمرض. على سبيل المثال ، مكننا عزل شظايا ECs من الشريان الرئوي (HPAECs) ، التي تم تشريحها من الرئتين المزروعتين للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) ، من الكشف عن آليات الخلل البطاني في هذا المرض 8,9.
وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تهدف إلى تحسين عزل ECs من مصادر / أجهزة مختلفة أيضا في حالات المرض ضرورية لتزويد الباحثين بأدوات بحث قيمة ، خاصة عندما لا تكون هذه الأدوات متاحة تجاريا. تم الإبلاغ سابقا عن بروتوكولات عزل HLMVEC و HPAEC 10،11،12،13،14،15،16،17،18،19. في جميع الحالات ، أدى الهضم الأنزيمي لعينات الرئة إلى مجموعات خلايا مختلطة ، والتي تم تنقيتها باستخدام وسائط انتقائية مخصصة وفرز الخلايا القائمة على الخرز المغناطيسي أو الخلايا الخلوية. يجب أن تعالج التحسينات الإضافية لهذه البروتوكولات مسألتين رئيسيتين في عزل EC: (1) تلوث الخلايا والأنسجة ، والتي يجب حلها في أقرب ممرات استزراع ممكنة لتقليل الشيخوخة المتماثلة EC20 ؛ و (2) العائد المنخفض لعزلات EC الأولية.
تصف هذه الدراسة بروتوكولا جديدا للعزل عالي الغلة وعالي النقاء ل HLMVECs و HPAECs. يمكن تطبيق هذا الإجراء بسهولة وإعطاء ECs الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة النقية تقريبا في بضع خطوات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة ، واتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة كييتي بيسكارا (#237_2018bis). يوضح الشكل 1 عزل الخلايا البطانية من أجزاء (طولها 1-3 سم) من الحمة الرئوية أو الشريان الرئوي من الأشخاص غير المحددين (بموافقة كتابية) الذين يخضعون لجراحة الصدر لأسباب مختلفة ، مثل استرواح الصدر أو استئصال الفص. في هذه الحالة الأخيرة ، جمع الجراحون أيضا جزءا من الشريان الرئوي. والجدير بالذكر أنه تم توجيه الجراحين بدقة لجمع عينات خالية من السرطان. تم تحسين البروتوكول المقدم للحصول على أكبر قدر ممكن من العائد والنقاء.
1. التحضير التجريبي
- إعادة تكوين كولاجيناز
- قم بإذابة مسحوق الكولاجيناز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون CaCl 2 و MgCl 2 (PBS−− ، انظر جدول المواد) بتركيز2 مجم / مل ، وقم بتصفية المحلول باستخدام مرشح مسام 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 5 مل من القسامة، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإذابة وتسخين الحصص إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- طلاء لوحة
- لطلاء الألواح ، ماصة 1.5٪ محلول جيلاتين أو 50 ميكروغرام / مل فيبرونيكتين (انظر جدول المواد) في لوحة الاستزراع (500 ميكرولتر كافية لتغطية سطح كل بئر من صفيحة 6 آبار) ، واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة ، قم بإزالة الجيلاتين الزائد ، واغسل الآبار باستخدام PBS−−. نضح PBS−− ، واترك اللوحة تجف في غطاء معقم.
ملاحظة: لإعادة تكوين الجيلاتين ، قم بإذابة المسحوق في الماء لعمل محلول 1.5٪ ، ثم قم بتعقيمه ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. الجيلاتين عند 1.5٪ ليس سائلا عند 4 درجات مئوية ؛ لذلك ، يجب تسخينه قبل طلاء اللوحة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أي محلول جيلاتيني تجاري مناسب لمزارع الخلايا لطلاء الألواح.
2. إعداد عينة
- حمة الرئة
- اغسل العينات التي تم جمعها عن طريق غمرها في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على PBS−−.
- انقل العينات إلى طبق بتري معقم ، وقم بتقطيع العينة يدويا باستخدام مقص جراحي (الحجم الأمثل: >2 سم) إلى شظايا صغيرة يبلغ حجم كل منها حوالي 3-4 مم.
- جزء (أجزاء) الشريان
- اغسل العينات التي تم جمعها عن طريق غمرها في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على PBS−−.
- قم بنقله إلى طبق بتري معقم دون تقطيع ، لأن التجزئة ستزيد من مساحة سطح المقطع العرضي لجزء الشريان ، مما يزيد من إمكانية عزل غير ECs.
3. الهضم الأنزيمي
- اغسل مكعبات الرئة الحمة أو جزء / أجزاء الشريان الرئوي مرتين باستخدام PBS−−. هذه الخطوة ستزيل جزءا كبيرا من الدم المتبقي.
- ضع العينات في أنابيب سعة 15 مل ، واحتضانها ب 5 مل من كولاجيناز النوع 2 (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. خلال هذه الحضانة ، يؤدي تدهور المصفوفة خارج الخلية إلى إطلاق خلايا مفردة ومجاميع خلوية.
4. استعادة الخلايا المهضومة
- ضع مصفاة معقمة من الصلب / المعدن (أي مصفاة شاي بحجم شبكة ~ 1 مم) أعلى أنبوب تجميع سعة 50 مل.
- صب المحتويات بالكامل من أنبوب 15 مل على المصفاة ، وقم بتدليك الأنسجة المهضومة برفق باستخدام ملعقة ، واشطف العينة باستخدام PBS−− حتى يتم ملء أنبوب التجميع.
ملاحظة: ستقضي هذه الخطوة على شظايا الأنسجة الكبيرة على مقياس المليمتر ، مما يضمن كفاءة أكبر لخطوات الترشيح اللاحقة.
5. إزالة غير EC عن طريق الترشيح
- قم بتصفية التدفق الخارجي الذي تم جمعه في الخطوة 4.2 باستخدام مصفاة خلوية بحجم شبكة 70 ميكرومتر ، واجمع التدفق الخارجي في أنبوب جديد سعة 50 مل.
- بعد ذلك ، استخدم مصفاة خلية بحجم شبكة 40 ميكرومتر ، واجمع التدفق الخارجي في أنبوب جديد سعة 50 مل. قم بتسمية هذا الأنبوب باسم "الأنبوب 1".
ملاحظة: ستؤدي عمليات الترشيح هذه في الخطوة 5.1 والخطوة 5.2 إلى إزالة مجاميع الخلايا الكبيرة ، والتي تتكون غالبا من مجموعات خلايا مختلطة.
6. ترسيب مجموعات الخلايا وبذر الخلايا
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 30 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسب مجموعات الخلايا.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة معقمة (لا تصب) ، وضعها في أنبوب جديد سعة 50 مل ("الأنبوب 2").
- الحبيبات في "الأنبوب 1" ، واملأ الأنبوب حتى 50 مل ب PBS−−. املأ "الأنبوب 2" حتى 50 مل باستخدام PBS−−.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يتم التعامل مع كلا الأنبوبين بنفس الطريقة. - أجهزة الطرد المركزي العينات في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الكريات ب 2 مل من وسط النمو (انظر جدول المواد) ، وقم بزرع المعلق في بئرين منفصلين من صفيحة 6 آبار مطلية مسبقا (الخطوة 1.2).
ملاحظة: من هذه الخطوة ، قم بتغذية الخلايا كل 2 أيام بوسط النمو حتى تصل إلى نقطة التقاء (حوالي 1 أسبوع ، اعتمادا على حجم العينة) من أجل الحصول على عدد معقول من الخلايا للفرز.
7. توسيع الخلية
- اغسل الخلايا ب 2 مل من PBS مع CaCl 2 و MgCl2 (PBS ++ ، انظر جدول المواد) لإزالة خلايا الدم المتبقية (استخدام PBS ++ مهم لتجنب انفصال الخلايا).
- قم بإزالة PBS ++ ، وأضف وسيطا ثقافيا جديدا.
- كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 حتى تصل الخلايا إلى نقطة التقاء (أسبوع واحد تقريبا ، حسب حجم العينة).
8. فرز الخلايا
- افصل الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA (0.05٪ ، انظر جدول المواد) ، وأجهزة الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات ب 190 ميكرولتر من PBS−−.
- أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد CD31-FITC المترافق الفلوري المضاد للإنسان (تخفيف 1:20 ، انظر جدول المواد) ، واحتضان معلق الخلية عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- اغسل الخلايا باستخدام 10 مل من PBS−− ، جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS−−.
- عزل وجمع الخلايا الإيجابية CD31 (CD31 +) عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ، باستخدام فوهة 100 ميكرومتر ، وجمعها في أنبوب.
- وفقا لاستراتيجية البوابة ، حدد أولا مورفولوجيا الخلية باستخدام معلمات منطقة التشتت الجانبية ، SSC-A و FSC-A. بعد ذلك ، حدد الخلايا المفردة باستخدام مخطط نقطة FSC-Area / FSC-Height أو SSC-Area / SSC-Height ، وحدد الخلايا الموجبة في العينة المحددة مقابل عينة التحكم غير الملوثة ، وقم بتوجيه الخلايا الفلورية إلى أنبوب التجميع21.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتعليق الحبيبات في 2 مل من وسط النمو للبذر في الآبار المطلية مسبقا للوحة 6 آبار.
9. توسيع ما بعد الفرز
- بعد يومين من فرز الخلايا ، استبدل الوسط المشروط بوسط نمو جديد.
- كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 كل يومين لتوسيع الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزل HLMEC
المشكلة الرئيسية أثناء عزل HLMVECs هي وجود خلايا ملوثة لأن الشعيرات الدموية المجهرية لا يمكن فصلها بسهولة عن الأنسجة اللحمية. لذلك ، فإن تحقيق أعلى نقاء ممكن في المراحل المبكرة من عملية العزل أمر بالغ الأهمية من أجل تقليل ممرات الثقافة ، وبالتالي شيخوخة الخلايا. وبالمثل ، يجب أن يعطي بروتوكول العزل الأمثل أعلى عائد ممكن من HLMVECs النقية. لتحقيق هذه الأهداف ، تم إعداد إجراء جديد بناء على البروتوكولات الموصوفة سابقا10،11،12،14،15.
على الرغم من أن حمة الرئة شديدة الأوعية الدموية ، وبالتالي تمثل مصدرا ممتازا ل HLMVECs ، إلا أنها مأهولة إلى حد كبير بخلايا العضلات الملساء (SMCs) وألياف الكولاجين والخلايا الليفية. يمكن لهذه الخلايا ، وخاصة SMCs ، أن تتكيف مع مجموعة متنوعة من وسائط الاستزراع ، وفي جميع الحالات تقريبا ، تتكاثر في المختبر بشكل أسرع بكثير من مجموعات الخلايا الأخرى ، مما يعني أنها تتولى ثقافة الخلايا المختلطة. ومن ثم، كان شاغلنا الأول هو معايرة الهضم الأنزيمي للبرنشيمة لتقليل ترحيل الخلايا غير المرغوب فيها. نظرا لأن كولاجيناز النوع 2 يفصل بسرعة مجموعات الخلايا البطانية عن بقية الشعيرات الدموية ، فقد استنتجنا أن وقت هضم عينة الرئة يمكن أن يكون حاسما لتقليل تلوث الخلايا. لذلك ، كخطوة أولى ، تم تقليل وقت التعرض للكولاجيناز لجزء الرئة المستأصل إلى 10 دقائق كحد أقصى بدلا من 20 دقيقة15 المقترحة (الشكل 2 أ). بعد هذا العلاج ، لوحظ أن جزءا من مجاميع الخلايا ، بما في ذلك SMCs والخلايا الليفية ، لا يزال مرتبطا بألياف طويلة (الشكل 2B) ، بينما تمثل SMCs غالبية مفردات الخلايا غير الدموية. كما لوحظت مجموعات صغيرة ومضغوطة من الخلايا ، بأقطار لا تتجاوز عموما 10-20 ميكرومتر ، بدون عناصر تعزى إلى شظايا الأنسجة اللحمية (أي الألياف الكبيرة) (الشكل 2 ب). تم افتراض أن مجاميع الخلايا الصغيرة هذه يمكن أن تتكون أساسا من HLMVECs.
بعد هذه الفرضية ، تم تنفيذ خطوات الترشيح التسلسلي لتحقيق أقصى قدر من استرداد HLMVEC. بالنسبة للترشيح الأول ، تم استخدام مصفاة معدنية ، وتم تدليك العينة بملاقط لتسهيل هروب HLMVECs من الشعيرات الدموية (الشكل 2C ، يمين). كان الهدف من هذه الخطوة هو إزالة المجموعات الكبيرة من خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية التي لا تزال مرتبطة بالمصفوفة خارج الخلية. ثم تمت تصفية التدفق الخارجي باستخدام سلسلة من مصافي بحجم شبكة 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر لإزالة الركام الكبير المتبقي ، وإن لم يكن مرئيا للعين (الشكل 2C ، الوسط ، اليسار). لإزالة مفردات الخلية ، تم طرد العينات بالطرد المركزي عند 30 × جم لمدة 5 دقائق ، وهي سرعة ترسب الخلايا والركام بقطر >7-10 ميكرومتر ، وبالتالي ترك الخلايا الأصغر معلقة. تم اختيار معلمات الطرد المركزي هذه بناء على تلك التي أبلغ عنها Miron et al. لتكوير خلايا الدم المتداولة22. والجدير بالذكر أنه بعد هذا الطرد المركزي ، كان الطافع أحمر اللون (الشكل 2D) ، مما يشير إلى وجود العديد من خلايا الدم الحمراء (~ 5 ميكرومتر في القطر). عند هذه النقطة ، تمت إزالة المادة الطافية بعناية ووضعها في أنبوب ثان. تم ملء كلا الأنبوبين اللذين يحتويان على المادة الطافية والحبيبات ب PBS−− والطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أظهر الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية كرية حمراء غنية بخلايا الدم ، مما يشير إلى أنها تحتوي أيضا على معظم مفردات الخلايا المزروعة (الشكل 2E ، يمين).
تم تعليق الكريات التي تم الحصول عليها بوسط نمو الخلايا البطانية وزرعها بشكل منفصل في بئرين من صفيحة 6 آبار ، والتي كانت مغلفة مسبقا ب 1.5٪ جيلاتين من جلد الخنزير (الشكل 2E ، وسط). بعد 3 أيام ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS ++ ، وتغذيتها بوسط جديد ، وتصويرها. كما هو موضح على يسار الشكل 2E ، كانت جزر EC أكثر وفرة في البئر التي تحتوي على الخلايا من "الأنبوب 1" (أعلى) ، في حين أن البئر التي تحتوي على الخلايا من "الأنبوب 2" (أسفل) كانت مأهولة في الغالب بخلايا مفردة وغير شبيهة بالبطانة.
تم تطبيق نفس الإجراء على بروتوكول عزل HPAEC الأقل تحديا والذي تم الإبلاغ عنه في عملنا السابق ، حيث تضمن فصل HPAEC استغلال وقت الالتصاق الأقصر مقارنة بوقت الخلايا الملوثة8. نظرا لحجمها الكبير ، يمكن تنظيف الشرايين بسهولة من الأنسجة الضامة والدهنية المتبقية ، وبالتالي القضاء على نسبة كبيرة من غير ECs. ومع ذلك ، كانت نسبة كبيرة من الخلايا الليفية وألياف المصفوفة خارج الخلية لا تزال موجودة في العينات في هذه المرحلة ، بالإضافة إلى SMCs الوعائية8. زاد الإجراء الجديد من نقاء EC الأولي خلال مصانع HPAEC (النتائج غير معروضة).
التنقية والتوصيف الظاهري والوظيفي ل HLMVECs المعزولة حديثا
في نهاية بروتوكول العزل ، تم تحليل نقاء HLMVECs من خلال الكشف الخلوي عن التدفق لغشاء الخلية CD31. لتحديد حجرة الخلية CD31 + بشكل صحيح ، تم تعيين بوابة على مخطط نقطي مبعثر أمامي (FSC) / مبعثر جانبي (SSC) ، وتم تحديد مجموعة متجانسة من الخلايا شكليا. تم تمثيل مثل هذه المجموعة السكانية على مخطط نقطة FSC-Area / FSC-Height ، وتم إغلاق الخلايا المفردة وتحليلها للتعبير السطحي ل CD31 (استراتيجية البوابة الهرمية ، غير معروضة). في أفضل السيناريوهات ، تم الحصول على ~ 70٪ خلايا مفردة HLMVEC نقية (الشكل 3A ، B). وتجدر الإشارة إلى أن محصول HLMVEC انخفض بشكل كبير عندما لم تتم معالجة العينة مباشرة بعد الجراحة أو عندما كان المتبرع مسنا أو مدخنا.
للحصول على مستحضرات HLMVEC أنقى ، تم فرز خلايا CD31 + وبذرها في ألواح استزراع مغلفة بالجيلاتين بنسبة 1.5٪. افترضت الخلايا المصنفة الشكل المميز الشبيه بالبطانة (الشكل 3C) ، وكما ورد في الشكل 3D ، أظهر الفحص المجهري متحد البؤر أن ما يقرب من 100٪ من الخلايا المنقاة من FACS ملطخة إيجابية لمستضدات EC ، وهي CD31 وعامل فون ويلبراند الأكثر تحديدا (vWF) 23. علاوة على ذلك ، عندما تم زرع هذه الخلايا في Matrigel ، فإنها تولد هياكل أنبوبية ، وكذلك HUVECs (الشكل 3E) ، مما يؤكد نمطها الظاهري البطاني.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للإجراء. يوضح المخطط الانسيابي إجراء عزل الخلايا البطانية وإزالة الخلايا غير البطانية. تلخص كل خطوة الأحداث الموضحة في الخطوات 2-6 من البروتوكول التجريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم توضيحي لإجراء عزل EC الأمثل. (أ) صورة تمثيلية لعينة من حمة الرئة مقطعة إلى أجزاء صغيرة قبل هضم الكولاجيناز (يسار) ومحتضنة في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من كولاجيناز النوع 2 (يمين). (ب) التمثيل التخطيطي (على اليسار) والتمثيل الفعلي (على اليمين؛ التكبير: 100x) لتجمعات الخلايا التي تم الحصول عليها بعد هضم الكولاجيناز. تشمل هذه المجموعات الفردية من غير ECs و ECs ، ومجموعات من ECs ، ومجموعات من غير ECs المرتبطة بالألياف ، والتي تتم إزالتها باستخدام المصافي. (ج) الترشيحات التسلسلية باستخدام مصافي شبكية معدنية 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر. (د) صورة للأنبوب سعة 50 مل بعد الطرد المركزي منخفض السرعة وقبل فصل المواد الطافية عن الكريات في "الأنبوب 1" و "الأنبوب 2". توجد مجموعات الخلايا في الحبيبات ، بينما توجد الخلايا المفردة في الغالب في المادة الطافية. (ه) صورة تبين الألوان والتركيبات المختلفة للحبيبات والخلايا المعزولة من "الأنبوب 1" (أعلى) و "أنبوب 2" (أسفل)؛ التكبير: 100x. اختصار: EC = الخلايا البطانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التوصيف الظاهري والوظيفي ل HLMVEC. أ: تجمع خلايا مختلطة تم الحصول عليه من نبات برنشيمي رئوي. ب: الكشف عن CD31 عن طريق قياس السريان الخلوي على سطح الخلايا في نهاية المقطع الأول. تشير نسبة النقاء (70٪) إلى استراتيجية البوابات الهرمية المستخدمة. ج: HLMVECs النقية بعد فرزها حيا بحثا عن مولد الضد CD31. (د) صور مجهرية متحدة البؤر للتألق المناعي التمثيلي ل CD31 (يسار) و vWF (يمين) تلطيخ إيجابي (شريط المقياس: 50 ميكرومتر). (ه) تم التقاط صور برايتفيلد بعد 6 ساعات من بذر HUVECs أو HLMVECs على Matrigel.التكبير (A ، C ، E): 100x. الاختصارات: HLMVECs = الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأدوار المتعددة التي تلعبها الخلايا البطانية الوعائية في الفيزيولوجيا المرضية البشرية تجعل هذه الخلايا أداة لا غنى عنها للدراسات المرضية والدوائية في المختبر . نظرا لأن ECs من مواقع / أعضاء الأوعية الدموية المختلفة تعرض ميزات ووظائف غريبة ، فإن توفر ECs صحية ومريضة من الجهاز محل الاهتمام سيكون مثاليا لأغراض البحث. على سبيل المثال ، HLMVECs ضرورية للدراسات حول التهاب الرئة. لذلك ، فإن منهجية العزل عالي الغلة وعالية النقاء لهذه الخلايا ستفيد مجالات البحث المختلفة.
تم الإبلاغ عن طرق عزل HLMVECs من قبل مجموعات مختلفة 10،11،12،14،15،17،18،19. أدخلت كل طريقة أساليب مبتكرة ، مثل فرز الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي11،12،15،17،18 أو التفكك الميكانيكي باستخدام قنية حادة 17،18. تم تصميم البروتوكول الحالي لجمع الجزر الصغيرة من الخلايا البطانية التي تم الحصول عليها بعد هضم الكولاجين واستخدم الطرد المركزي التسلسلي القائم على وقت الترسيب لزيادة نقاء ECs في مجموعة الخلايا المختلطة الأولية. هذه النقطة حاسمة لأن ارتفاع أعداد خلايا البداية يعني أن هناك حاجة إلى أعداد أقل من التوسعات في المختبر للوصول إلى عدد الخلايا المطلوبة للتجارب ، مما يعني بدوره أنه يمكن إكمال المزيد من التحقيقات قبل شيخوخة ECs. يرتبط هذا الجانب ارتباطا وثيقا بدرجة نقاء عزلات HLMVEC ، وهو أمر مهم أيضا للحصول على نتائج موثوقة. علاوة على ذلك ، إذا كانت عينة الرئة صغيرة جدا في الحجم ولا توجد إمكانية لإجراء فرز EC مباشرة بعد الزرع ، والذي كان ، في تجربتنا ، السيناريو الأكثر شيوعا ، فإن SMCs الملوثة ستنمو بشكل أسرع من ECs ، وبالتالي الاستيلاء على الثقافة وتقليل إنتاجية ECs بعد فرز الخلايا.
في هذه الدراسة ، حاولنا معالجة هذه النقاط. لهذا ، تم رصد ما حدث لعينات الرئة بعد هضم الكولاجيناز في البداية ، وتم تحديد تلوث كبير من خلال أنواع مختلفة من الخلايا ، وخاصة SMCs (الشكل 2) ، والتي تنمو بسرعة ويمكن أن تتفوق على HLMVECs في الثقافات المختلطة. لذلك ، تم وضع استراتيجية لتقليل هذا التلوث بشكل فوري بعد الهضم (الشكل 1 والشكل 2). بشكل ملحوظ ، تم الحصول على HLMVECs بنقاوة ~ 70٪ (الشكل 3A ، B) باستمرار في مرحلة العزل الأولى. سهلت هذه النتيجة الممتازة خطوة التنقية اللاحقة من قبل FACS ، مما أدى إلى النتيجة النهائية للحصول على HLMVECs نقية وعملية تقريبا (الشكل 3C-E). تم الحصول على نتائج مماثلة عندما تم استخدام شرائح الشريان الرئوي كمادة أولية وكانت HPAECs هي الخلايا المعزولة ، مما يعني أن هذه المنهجية تمثل تحسينا للمنهجية التي تم الإبلاغ عنها سابقا8.
على الرغم من أن هذا الإجراء بسيط وقابل للتكرار ، إلا أن له متطلبات رئيسية. على سبيل المثال ، نجحنا في عزل HLMVEC من خلال معالجة شظايا الرئة التي تم الحصول عليها في غضون 3-6 ساعات من الاستئصال الجراحي فقط ، في حين ارتبطت الفترات الأطول بنتائج سيئة (البيانات غير معروضة). يمكن أن يؤدي وقت هضم الكولاجيناز أيضا إلى حدوث تباين في محصول EC بسبب الاختلافات من الكثير إلى الدفعة في النشاط الأنزيمي24. نقطة حرجة أخرى تتعلق بحالة العينة. أعطى حمة الرئة المشتقة من المدخنين أو المتبرعين المسنين غلة منخفضة HLMVEC. علاوة على ذلك ، قد يحتوي طاف الطرد المركزي منخفض السرعة على بعض الركام الذي يتم نقله إلى "الأنبوب 2". لهذا السبب ، يوصى بالاحتفاظ بمحتويات "الأنبوب 1" و "الأنبوب 2" في الثقافة ، على الأقل خلال المرحلة المبكرة من عزل الخلية. يمكن أن يمثل الفرز المباشر لخلايا CD31 + ، كما هو موضح سابقا في بروتوكولات عزل EC11،12،15،17،18 ، حلا جيدا لزيادة النقاء من البداية. لم نطبق مرحلة الفرز المبكرة هذه بسبب صغر حجم العينات التي تم تحليلها. ومع ذلك ، سيتم اختبار هذه الإمكانية في المستقبل في تنفيذ البروتوكول.
سيشجع بروتوكول عزل بسيط وموثوق لعزل HLMVECs و HPAECs الباحثين على استخدام هذا الطريق للحصول على خلايا لدراساتهم ، خاصة عندما لا تكون هذه الخلايا متاحة تجاريا. على سبيل المثال ، سيسمح عزل HLMECs من رئتي التليف الكيسي ببناء مجرى هوائي كامل للتليف الكيسي على شريحة25. علاوة على ذلك ، فإن إنشاء مجموعة EC الخاصة بهم سيمكن الباحثين من تخطيط وإجراء المزيد من التجارب بتكلفة أقل.
في الختام ، تعمل هذه الطريقة ، التي تحل بعض النقاط الحرجة التي قد تحدث أثناء عزل EC عن العينات الجراحية ، على تحسين الطرق الحالية ، وبالتالي تسهيل البحث في علم الأمراض والالتهاب EC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري دون أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بأموال من وزارة الجامعة والبحوث الإيطالية (60٪ سابقا 2021 و 2022) إلى R. P. وبمنح من مؤسسة التليف الكيسي الإيطالية (FFC # 23/2014) ومن وزارة الصحة الإيطالية (L548/93) إلى M. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A.
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G.
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D.
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
