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Biology

फेफड़े-व्युत्पन्न नमूनों से माइक्रोवस्कुलर और मैक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल सेल अलगाव और शुद्धिकरण

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64885
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 2,3, 1, 4, 4,5, 1,2, 2,3, 1, 6,7, 1, 1,2
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

हालांकि चुनौतीपूर्ण, फुफ्फुसीय एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव फेफड़ों की सूजन पर अध्ययन के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल मैक्रोवास्कुलर और माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के उच्च उपज, उच्च शुद्धता अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों और अंगों से पृथक कोशिकाओं की उपलब्धता व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व का प्रतिनिधित्व करती है। यद्यपि बायोबैंक बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए प्राथमिक और अमर कोशिकाओं का एक विस्तृत संग्रह प्रदान कर सकते हैं, ये सभी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को कवर नहीं करते हैं, विशेष रूप से विशिष्ट बीमारियों या जीनोटाइप से संबंधित। संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) प्रतिरक्षा भड़काऊ प्रतिक्रिया के प्रमुख घटक हैं और इस प्रकार, विभिन्न प्रकार के विकारों के रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। विशेष रूप से, विभिन्न साइटों के ईसीएस विभिन्न जैव रासायनिक और कार्यात्मक गुणों को प्रदर्शित करते हैं, जिससे विश्वसनीय प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए विशिष्ट ईसी प्रकारों (यानी, मैक्रोवास्कुलर, माइक्रोवास्कुलर, धमनी और शिरापरक) की उपलब्धता आवश्यक हो जाती है। यहां, फुफ्फुसीय धमनी और फेफड़ों के पैरेन्काइमा से उच्च उपज, लगभग शुद्ध मानव मैक्रोवास्कुलर और माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सरल प्रक्रियाओं को विस्तार से चित्रित किया गया है। वाणिज्यिक स्रोतों से स्वतंत्रता प्राप्त करने और ईसी फेनोटाइप/ जीनोटाइप प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपेक्षाकृत कम लागत पर इस पद्धति को आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है जो अभी तक उपलब्ध नहीं हैं।

Introduction

संवहनी एंडोथेलियम रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सतह को रेखाबद्ध करता है। यह रक्त जमावट, संवहनी टोन और प्रतिरक्षा-भड़काऊ प्रतिक्रियाओंको विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1,2,3,4. यद्यपि मानव नमूनों से अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) की संस्कृति अनुसंधान उद्देश्यों के लिए आवश्यक है, यह टिप्पणी की जानी चाहिए कि विभिन्न रक्त वाहिकाओं (धमनियों, नसों, केशिकाओं) से ईसी के विशिष्ट कार्य हैं। इन्हें मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) द्वारा पूरी तरह से पुन: प्राप्त नहीं किया जा सकता है, जो संवहनी एंडोथेलियम पैथोफिज़ियोलॉजी 5,6 पर अध्ययन में आसानी से उपलब्ध और व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, मानव फेफड़े के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचएलएमवीईसी) ल्यूकोसाइट भर्ती और संचय 4,7 को नियंत्रित करके फेफड़ों की सूजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इस प्रकार, उच्च निष्ठा के साथ फेफड़ों की सूजन को पुन: उत्पन्न करने के उद्देश्य से एक प्रयोगात्मक सेटिंग में एचएलएमवीईसी शामिल होना चाहिए। दूसरी ओर, ईसी शिथिलता को कई विकृतियों में देखा जा सकता है; इसलिए, रोगी से ईसी रोग के एक विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल के निर्माण के लिए मौलिक हैं। उदाहरण के लिए, फुफ्फुसीय धमनी (एचपीएईसी) से ईसी के टुकड़ों के अलगाव, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) से प्रभावित लोगों के खोजे गए फेफड़ों से विच्छेदित, ने हमेंइस बीमारी में एंडोथेलियल डिसफंक्शन के तंत्र को उजागर करने में सक्षम बनाया है।

इस प्रकार, रोग राज्यों में भी विभिन्न स्रोतों / अंगों से ईसी के अलगाव को अनुकूलित करने के उद्देश्य से प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को मूल्यवान अनुसंधान उपकरण प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं, खासकर जब ये उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। एचएलएमवीईसी और एचपीएईसी आइसोलेशन प्रोटोकॉल को पहले 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 बताया गया है। सभी मामलों में, फेफड़ों के नमूनों के एंजाइमेटिक पाचन के परिणामस्वरूप मिश्रित कोशिका आबादी हुई, जिन्हें तदर्थ चयनात्मक मीडिया और चुंबकीय मोती- या साइटोमेट्रिक-आधारित सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। इन प्रोटोकॉल के आगे के अनुकूलन को ईसी अलगाव में दो मुख्य मुद्दों को संबोधित करना चाहिए: (1) सेल और ऊतक संदूषण, जिसे ईसी प्रतिकृति शिथिलताको कम करने के लिए जल्द से जल्द संभव संस्कृति मार्ग पर हल किया जाना चाहिए; और (2) प्राथमिक ईसी आइसोलेट्स की कम उपज।

यह अध्ययन एचएलएमवीईसी और एचपीएईसी के उच्च उपज, उच्च शुद्धता अलगाव के लिए एक नए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया आसानी से लागू हो सकती है और कुछ चरणों में लगभग शुद्ध मैक्रोवास्कुलर और माइक्रोवैस्कुलर ईसी दे सकती है।

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Protocol

इस अध्ययन को मंजूरी दे दी गई थी, और प्रोटोकॉल ने चिएती-पेसकारा विश्वविद्यालय (# 237_2018bis) की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन किया। चित्रा 1 फुफ्फुसीय पैरेन्काइमा या फुफ्फुसीय धमनी के खंडों (1-3 सेमी लंबी) से एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव को दर्शाता है, जो विभिन्न कारणों से वक्ष सर्जरी से गुजर रहे हैं (लिखित सहमति के साथ) जैसे कि न्यूमोथोरैक्स या लोबैक्टोमी। इस बाद के मामले में, सर्जनों ने एक फुफ्फुसीय धमनी खंड भी एकत्र किया। विशेष रूप से, सर्जनों को कैंसर मुक्त नमूने एकत्र करने के लिए सटीक निर्देश दिया गया था। प्रस्तुत प्रोटोकॉल को सबसे बड़ी संभव उपज और शुद्धता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. कोलेजनेस पुनर्गठन।
    1. 2 मिलीग्राम/एमएल सांद्रता पर फॉस्फेट-बफर्ड खारा में कोलेजनेस पाउडर को सीसीएल 2 और एमजीसीएल2 (पीबीएस-−, सामग्री की तालिका देखें) के बिना घोलेंजनेज पाउडर को घोलें, और 0.22 μm पोर फिल्टर का उपयोग करके घोल को फ़िल्टर करें।
    2. 5 एमएल एलिकोट तैयार करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने से पहले एलिकोट को 37 डिग्री सेल्सियस तक पिघलाएं और पहले से गर्म करें।
  2. प्लेट कोटिंग
    1. प्लेट कोटिंग के लिए, पिपेट 1.5% जिलेटिन समाधान या 50 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन (सामग्री की तालिका देखें) को कल्चर प्लेट में डालें (500 μL 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त है), और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. इनक्यूबेशन के बाद, अतिरिक्त जिलेटिन को हटा दें, और पीबीएस-−के साथ कुओं को धो लें। पीबीएस −−को एस्पिरेट करें, और प्लेट को बाँझ हुड में सूखने दें।
      नोट: जिलेटिन पुनर्गठन के लिए, पाउडर को 1.5% समाधान बनाने के लिए पानी में घोलें, फिर इसे आटोक्लेव करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1.5% पर जिलेटिन 4 डिग्री सेल्सियस पर तरल नहीं है; इसलिए, इसे प्लेट कोटिंग से पहले गर्म किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सेल संस्कृतियों के लिए उपयुक्त किसी भी वाणिज्यिक जिलेटिन समाधान का उपयोग प्लेट कोटिंग के लिए किया जा सकता है।

2. नमूना तैयार करना

  1. फेफड़े का पैरेन्काइमा
    1. एकत्र किए गए नमूनों को पीबीएस-−युक्त 50 एमएल ट्यूब में डुबोकर धोएं।
    2. नमूनों को एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और सर्जिकल कैंची (इष्टतम आकार: >2 सेमी) का उपयोग करके नमूने को लगभग 3-4 मिमी के छोटे टुकड़ों में मैन्युअल रूप से काट लें।
  2. धमनी खंड (ओं)
    1. एकत्र किए गए नमूनों को पीबीएस-−युक्त 50 एमएल ट्यूब में डुबोकर धोएं।
    2. इसे काटने के बिना एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, क्योंकि विखंडन धमनी खंड के क्रॉस-सेक्शन के सतह क्षेत्र को बढ़ाएगा, इस प्रकार गैर-ईसी को अलग करने की संभावना बढ़ जाएगी।

3. एंजाइमेटिक पाचन

  1. पीबीएस-−के साथ दो बार कटे हुए फेफड़े के पैरेन्काइमा या फुफ्फुसीय धमनी खंड / एस को धोएं। यह कदम अवशिष्ट रक्त के एक बड़े हिस्से को हटा देगा।
  2. नमूने को 15 एमएल ट्यूबों में रखें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए टाइप2 कोलेजनेस (सामग्री की तालिका देखें) के 5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन के दौरान, बाह्य मैट्रिक्स का क्षरण एकल कोशिकाओं और कोशिका समुच्चय को जारी करता है।

4. पचने वाली कोशिकाओं की वसूली

  1. 50 एमएल संग्रह ट्यूब के शीर्ष पर एक बाँझ स्टील / धातु छन्नी (यानी, ~ 1 मिमी जाल आकार के साथ एक चाय छनी) रखें।
  2. 15 एमएल ट्यूब से पूरी सामग्री को छन्नी पर डालें, धीरे से पचे हुए ऊतक को स्पैटुला के साथ मालिश करें, और संग्रह ट्यूब भरने तक पीबीएस −− के साथ नमूने को कुल्ला करें।
    नोट: यह कदम मिलीमीटर पैमाने पर बड़े ऊतक के टुकड़ों को खत्म कर देगा, जिससे बाद के निस्पंदन चरणों की अधिक दक्षता सुनिश्चित होगी।

5. निस्पंदन द्वारा गैर-ईसी हटाने

  1. 70 μm जाल आकार के साथ सेल छन्नी का उपयोग करके चरण 4.2 में एकत्र किए गए बहिर्वाह को फ़िल्टर करें, और बहिर्वाह को एक ताजा 50 mL ट्यूब में एकत्र करें।
  2. फिर, 40 μm जाल आकार के साथ एक सेल छन्नी का उपयोग करें, और एक ताजा 50 mL ट्यूब में बहिर्वाह एकत्र करें। इस ट्यूब को "ट्यूब 1" के रूप में लेबल करें।
    नोट: चरण 5.1 और चरण 5.2 में ये निस्पंदन बड़े सेल समुच्चय को हटा देंगे, जो अक्सर मिश्रित सेल आबादी से बने होते हैं।

6. सेल क्लस्टर और सेल सीडिंग का अवसादन।

  1. सेल समूहों को तलछट करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 30 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक निकालें (न डालें), और इसे एक ताजा 50 एमएल ट्यूब ("ट्यूब 2") में रखें।
  3. "ट्यूब 1" में गोली को निलंबित करें, और पीबीएस-−के साथ 50 एमएल तक ट्यूब भरें। पीबीएस-−के साथ 50 एमएल तक "ट्यूब 2" भरें।
    नोट: इस कदम से आगे, दोनों ट्यूबों को एक ही तरह से इलाज किया जाता है।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. छर्रों को 2 मिलीलीटर वृद्धि माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ निलंबित करें, और निलंबन को पूर्व-लेपित 6-वेल प्लेट (चरण 1.2) के दो अलग-अलग कुओं में बीज दें।
    नोट: इस चरण से, कोशिकाओं को विकास माध्यम के साथ हर 2 दिनों में खिलाएं जब तक कि वे सॉर्टिंग के लिए उचित संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कंफ्लुएंसी (लगभग 1 सप्ताह, नमूना आकार के आधार पर) तक न पहुंच जाएं।

7. सेल विस्तार

  1. अवशिष्ट रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए CaCl 2 और MgCl 2 (PBS ++, सामग्री की तालिका देखें) के साथ2 mL PBS के साथ कोशिकाओं को धोएं (सेल डिटेचमेंट से बचने के लिए PBS ++ का उपयोग करना महत्वपूर्ण है)।
  2. पीबीएस ++ को निकालें, और ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें।
  3. चरण 7.1 और चरण 7.2 को तब तक दोहराएं जब तक कि कोशिकाएं कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं (लगभग 1 सप्ताह, नमूना आकार के आधार पर)।

8. सेल सॉर्टिंग

  1. ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 500 μL (0.05%, सामग्री की तालिका देखें), सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें, और पीबीएस-−के 190 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. फ्लोरोसेंट संयुग्म एंटी-ह्यूमन सीडी 31-एफआईटीसी एंटीबॉडी के 10 μL जोड़ें (1: 20 कमजोर पड़ना, सामग्री की तालिका देखें), और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  3. पीबीएस-−के 10 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को धोएं, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और पीबीएस-−के 300 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. 100 μm नोजल का उपयोग करके, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) द्वारा CD31 पॉजिटिव (CD31+) कोशिकाओं को अलग और एकत्र करें, और उन्हें एक ट्यूब में इकट्ठा करें।
    1. गेटिंग रणनीति के अनुसार, पहले साइड स्कैटर एरिया पैरामीटर, एसएससी-ए और एफएससी-ए का उपयोग करके सेल आकृति विज्ञान को परिभाषित करें। फिर, एफएससी-एरिया /एफएससी-ऊंचाई या एसएससी-एरिया / एसएससी-हाइट डॉट प्लॉट का उपयोग करके एकल कोशिकाओं का चयन करें, चिह्नित नमूने में सकारात्मक कोशिकाओं को परिभाषित करें बनाम बिना दाग वाले नियंत्रण नमूने, और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को संग्रह ट्यूब21 में निर्देशित करें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और 6-वेल प्लेट के पूर्व-लेपित कुओं में बोने के लिए 2 मिलीलीटर विकास माध्यम में गोली को निलंबित करें।

9. पोस्ट-सॉर्टिंग विस्तार

  1. सेल सॉर्टिंग के दो दिन बाद, वातानुकूलित माध्यम को ताजा विकास माध्यम से बदलें।
  2. सेल विस्तार के लिए हर 2 दिनों में चरण 7.1 और चरण 7.2 दोहराएं।

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Representative Results

एचएलएमईसी अलगाव
एचएलएमवीईसी के अलगाव के दौरान मुख्य समस्या दूषित कोशिकाओं की उपस्थिति है क्योंकि सूक्ष्म केशिकाओं को स्ट्रोमल ऊतक से आसानी से अलग नहीं किया जा सकता है। इसलिए, अलगाव प्रक्रिया के शुरुआती चरणों में उच्चतम संभव शुद्धता प्राप्त करना संस्कृति मार्ग और इस प्रकार, सेल उम्र बढ़ने को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, एक इष्टतम अलगाव प्रोटोकॉल को शुद्ध एचएलएमवीईसी की उच्चतम संभव उपज देनी चाहिए। इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए, पहले वर्णित प्रोटोकॉल10,11,12,14,15 के आधार पर एक नई प्रक्रिया स्थापित की गई थी।

यद्यपि फेफड़े का पैरेन्काइमा अत्यधिक संवहनी है, इस प्रकार एचएलएमवीईसी के एक उत्कृष्ट स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, यह बड़े पैमाने पर चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी), कोलेजन फाइबर और फाइब्रोब्लास्ट द्वारा आबाद है। ये कोशिकाएं, विशेष रूप से एसएमसी, विभिन्न प्रकार के संस्कृति मीडिया के अनुकूल हो सकती हैं और, लगभग सभी मामलों में, अन्य सेल आबादी की तुलना में बहुत तेजी से विट्रो में प्रतिकृति करती हैं, इस प्रकार इसका अर्थ है कि वे मिश्रित सेल संस्कृति पर कब्जा कर लेते हैं। इसलिए, हमारी पहली चिंता अवांछित कोशिकाओं के कैरीओवर को कम करने के लिए पैरेन्काइमा के एंजाइमेटिक पाचन को कैलिब्रेट करना था। चूंकि टाइप 2 कोलेजनेस तेजी से एंडोथेलियल कोशिकाओं के समूहों को केशिका के बाकी हिस्सों से अलग करता है, इसलिए हमने तर्क दिया कि सेल संदूषण को कम करने के लिए फेफड़ों के नमूने का पाचन समय महत्वपूर्ण हो सकता है। इसलिए, पहले चरण के रूप में, उत्पादित फेफड़े के टुकड़े के कोलेजनेस के संपर्क में आने का समय सुझाए गए 20 मिनट 15 (चित्रा 2 ए) के बजाय अधिकतम10 मिनट तक कम हो गया था। इस उपचार के बाद, यह देखा गया कि एसएमसी और फाइब्रोब्लास्ट सहित सेल समुच्चय का हिस्सा अभी भी लंबे फाइबर (चित्रा 2 बी) से बंधा हुआ था, जबकि एसएमसी गैर-रक्त कोशिका एकल के बहुमत का प्रतिनिधित्व करते थे। कोशिकाओं के छोटे, कॉम्पैक्ट समूह, जिनका व्यास आम तौर पर 10-20 μm से अधिक नहीं होता है, स्ट्रोमल ऊतक (यानी, बड़े फाइबर) के टुकड़ों के कारण तत्वों के बिना भी देखे गए थे (चित्रा 2 बी)। यह अनुमान लगाया गया था कि ये छोटे सेल समुच्चय मुख्य रूप से एचएलएमवीईसी से बने हो सकते हैं।

इस परिकल्पना के बाद, एचएलएमवीईसी वसूली को अधिकतम करने के लिए सीरियल निस्पंदन कदम उठाए गए थे। पहले निस्पंदन के लिए, एक धातु छन्नी का उपयोग किया गया था, और केशिकाओं से एचएलएमवीईसी के भागने की सुविधा के लिए नमूने को चिमटी के साथ मालिश की गई थी (चित्रा 2 सी, दाएं)। इस कदम का उद्देश्य चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के बड़े समूहों को हटाना था जो अभी भी बाह्य मैट्रिक्स से बंधे हैं। बहिर्वाह को अवशिष्ट बड़े, हालांकि आंख-दृश्यमान नहीं, समुच्चय (चित्रा 2 सी, मध्य, बाएं) को हटाने के लिए 70 μm और 40 μm जाल आकार के छन्नी के अनुक्रम का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था। सेल सिंगलेट्स को हटाने के लिए, नमूनों को 5 मिनट के लिए 30 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, एक गति जो कोशिकाओं और समुच्चय को >7-10 μm व्यास के साथ तलछट करती है, इस प्रकार छोटी कोशिकाओं को निलंबन में छोड़ दिया जाता है। इन सेंट्रीफ्यूजेशन मापदंडों को मिरोन एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों के आधार पर चुना गया था। विशेष रूप से, इस सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला लाल रंग का था (चित्रा 2 डी), जो कई लाल रक्त कोशिकाओं (~ 5 μm व्यास) की उपस्थिति का संकेत देता है। इस बिंदु पर, सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दिया गया और एक दूसरी ट्यूब में रखा गया। सतह पर तैरनेवाला और गोली युक्त दोनों ट्यूबों को पीबीएस −− से भरा गया था और 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला युक्त ट्यूब ने रक्त कोशिकाओं में समृद्ध एक लाल गोली दिखाई, जिससे पता चलता है कि इसमें अधिकांश खोजी गई कोशिका एकल (चित्रा 2 ई, दाएं) भी शामिल हैं।

प्राप्त छर्रों को एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के साथ निलंबित कर दिया गया था और 6-वेल प्लेट के दो कुओं में अलग से बीज दिया गया था, जिन्हें पोर्सिन त्वचा से 1.5% जिलेटिन के साथ पूर्व-लेपित किया गया था (चित्रा 2 ई, मध्य)। 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस ++ के साथ धोया गया, ताजा माध्यम से खिलाया गया, और छवि बनाई गई। जैसा कि चित्र 2 ई के बाईं ओर दिखाया गया है, ईसी द्वीप "ट्यूब 1" (शीर्ष) से कोशिकाओं वाले कुएं में अधिक प्रचुर मात्रा में थे, जबकि "ट्यूब 2" (नीचे) से कोशिकाओं वाले कुएं ज्यादातर एकल और गैर-एंडोथेलियल जैसी कोशिकाओं द्वारा आबाद थे।

हमारे पिछले काम में रिपोर्ट किए गए कम चुनौतीपूर्ण एचपीएईसी अलगाव प्रोटोकॉल पर एक ही प्रक्रिया लागू की गई थी, जिसमें एचपीएईसी पृथक्करण में दूषित कोशिकाओंकी तुलना में उनके कम आसंजन समय का फायदा उठाना शामिल था। उनके बड़े आकार के कारण, धमनियों को अवशिष्ट संयोजी और वसा ऊतकों से आसानी से साफ किया जा सकता है, इस प्रकार गैर-ईसी के एक बड़े अनुपात को समाप्त किया जा सकता है। हालांकि, संवहनी एसएमसी8 के अलावा, इस स्तर पर नमूनों में फाइब्रोब्लास्ट और बाह्य मैट्रिक्स फाइबर का एक बड़ा अनुपात अभी भी मौजूद था। नई प्रक्रिया ने एचपीएईसी खोजों के दौरान प्रारंभिक ईसी शुद्धता को और बढ़ा दिया (परिणाम नहीं दिखाए गए)।

ताजा पृथक एचएलएमवीईसी के शुद्धिकरण और फेनोटाइपिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन
अलगाव प्रोटोकॉल के अंत में, एचएलएमवीईसी की शुद्धता का विश्लेषण कोशिका झिल्ली सीडी 31 के प्रवाह साइटोमेट्रिक डिटेक्शन द्वारा किया गया था। सीडी 31+ सेल कम्पार्टमेंट की सही पहचान करने के लिए, फॉरवर्ड-स्कैटर (एफएससी)/साइड-स्कैटर (एसएससी) डॉट प्लॉट पर एक गेट सेट किया गया था, और कोशिकाओं की एक रूपात्मक रूप से सजातीय आबादी की पहचान की गई थी। इस तरह की आबादी को एफएससी-एरिया / एफएससी-हाइट डॉट प्लॉट पर दर्शाया गया था, और सीडी 31 की सतह अभिव्यक्ति के लिए एकल कोशिकाओं को गेट और विश्लेषण किया गया था (पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति, नहीं दिखाया गया है)। सबसे अच्छी स्थिति में, ~ 70% शुद्ध एचएलएमवीईसी एकल कोशिकाएं (चित्रा 3 ए, बी) प्राप्त की गईं। ध्यान दें, एचएलएमवीईसी उपज काफी कम हो गई थी जब नमूना सर्जरी के तुरंत बाद संसाधित नहीं किया गया था या जब दाता बुजुर्ग या धूम्रपान करने वाला था।

शुद्ध एचएलएमवीईसी तैयारी प्राप्त करने के लिए, सीडी 31+ कोशिकाओं को 1.5% जिलेटिन-लेपित संस्कृति प्लेटों में क्रमबद्ध और बीज दिया गया था। क्रमबद्ध कोशिकाओं ने विशिष्ट एंडोथेलियल जैसी आकृति (चित्रा 3 सी) ग्रहण की, और जैसा कि चित्रा 3 डी में बताया गया है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि लगभग 100% एफएसीएस-शुद्ध कोशिकाएं ईसी एंटीजन, अर्थात् सीडी 31 और अधिक विशिष्ट वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) 23 के लिए सकारात्मक हैं। इसके अलावा, जब इन कोशिकाओं को मैट्रिगेल में बीज दिया गया था, तो उन्होंने ट्यूबलर संरचनाओं के साथ-साथ एचयूवीईसी (चित्रा 3 ई) उत्पन्न किया, इस प्रकार उनके एंडोथेलियल फेनोटाइप की पुष्टि की।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। फ्लोचार्ट एंडोथेलियल सेल अलगाव और गैर-एंडोथेलियल सेल हटाने की प्रक्रिया को दर्शाता है। प्रत्येक चरण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के चरण 2-6 में वर्णित घटनाओं को दोहराता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अनुकूलित ईसी अलगाव प्रक्रिया का चित्रण। (ए) फेफड़ों के पैरेन्काइमा नमूने की प्रतिनिधि छवि कोलेजनेज पाचन (बाएं) से पहले छोटे टुकड़ों में डाली जाती है और टाइप 2 कोलेजनेस (दाएं) के 5 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूब में इनक्यूबेट की जाती है। (बी) कोलेजनेज पाचन के बाद प्राप्त कोशिका आबादी का योजनाबद्ध (बाएं) और वास्तविक (दाएं; आवर्धन: 100x) प्रतिनिधित्व। इन आबादी में गैर-ईसी और ईसी के एकल, ईसी के समूह और फाइबर से बंधे गैर-ईसी के समूह शामिल हैं, जिन्हें छन्नी का उपयोग करके हटा दिया जाता है। (सी) धातु 70 μm और 40 μm जाल छन्नी का उपयोग करके सीरियल निस्पंदन। (डी) कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद और "ट्यूब 1" और "ट्यूब 2" में छर्रों से सुपरनैटेंट को अलग करने से पहले 50 एमएल ट्यूब की छवि। सेल क्लस्टर गोली में निहित होते हैं, जबकि एकल कोशिकाएं ज्यादातर सतह पर तैरने वाले में निहित होती हैं। (ई) "ट्यूब 1" (ऊपर) और "ट्यूब 2" (नीचे) से गोली और पृथक कोशिकाओं के विभिन्न रंगों और रचनाओं को दिखाने वाली छवि; आवर्धन: 100x. संक्षिप्त नाम: ईसी = एंडोथेलियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एचएलएमवीईसी फेनोटाइपिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन। (ए) फेफड़ों के पैरेन्काइमा खोज से प्राप्त एक मिश्रित कोशिका आबादी। (बी) पहले मार्ग के अंत में कोशिकाओं की सतह पर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 31 का पता लगाना। प्रतिशत शुद्धता (70%) उपयोग की जाने वाली पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति को संदर्भित करती है। (सी) सीडी 31 एंटीजन के लिए लाइव-सॉर्ट किए जाने के बाद शुद्ध एचएलएमवीईसी। (डी) सीडी 31 (बाएं) और वीडब्ल्यूएफ (दाएं) सकारात्मक धुंधलापन (स्केल बार: 50 μm) की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवियां। (E) ब्राइटफील्ड छवियों को मैट्रिगेल पर HUVECs या HLMVECs को सीडिंग करने के 6 घंटे बाद कैप्चर किया गया था। संक्षेप: एचएलएमवीईसी = मानव फेफड़े माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मानव पैथोफिज़ियोलॉजी में संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा निभाई गई कई भूमिकाएं इन कोशिकाओं को इन विट्रो पैथोजेनेटिक और फार्माकोलॉजिकल अध्ययनों के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनाती हैं। चूंकि विभिन्न संवहनी स्थलों / अंगों से ईसी विशिष्ट विशेषताओं और कार्यों को प्रदर्शित करते हैं, इसलिए रुचि के अंग से स्वस्थ और रोगग्रस्त ईसी की उपलब्धता अनुसंधान उद्देश्यों के लिए आदर्श होगी। उदाहरण के लिए, फेफड़ों की सूजन पर अध्ययन के लिए एचएलएमवीईसी आवश्यक हैं; इसलिए, इन कोशिकाओं के उच्च-उपज, उच्च शुद्धता अलगाव के लिए एक पद्धति अलग-अलग शोध क्षेत्रों को लाभान्वित करेगी।

एचएलएमवीईसी को अलग करने के तरीकों को विभिन्न समूहों द्वारा 10,11,12,14,15,17,18,19 द्वारा सूचित किया गया है। प्रत्येक विधि ने अभिनव दृष्टिकोण पेश किए हैं, जैसे चुंबकीय मोती 11,12,15,17,18 के साथ सेल सॉर्टिंग या एक कुंद प्रवेशनी 17,18 का उपयोग करके यांत्रिक पृथक्करण। वर्तमान प्रोटोकॉल को कोलेजनेस पाचन के बाद प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं के छोटे आइलेट्स को इकट्ठा करने के लिए डिज़ाइन किया गया था और प्रारंभिक मिश्रित सेल आबादी में ईसी की शुद्धता बढ़ाने के लिए अवसादन समय-आधारित सीरियल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया गया था। यह बिंदु महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च प्रारंभिक सेल संख्या का मतलब है कि प्रयोगों के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या तक पहुंचने के लिए इन विट्रो विस्तार की कम संख्या की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि ईसीएस सेनेसिस से पहले अधिक जांच पूरी की जा सकती है। यह पहलू एचएलएमवीईसी आइसोलेट्स की शुद्धता की डिग्री से सख्ती से संबंधित है, जो विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए भी प्रासंगिक है। इसके अलावा, यदि फेफड़ों का नमूना आकार में बहुत छोटा है और खोज के तुरंत बाद ईसी छंटाई करने की कोई संभावना नहीं है, जो कि हमारे अनुभव में, सबसे आम परिदृश्य था, तो दूषित एसएमसी ईसी की तुलना में तेजी से बढ़ेगा, इस प्रकार संस्कृति पर कब्जा कर लेगा और सेल सॉर्टिंग के बाद ईसी की उपज को कम कर देगा।

इस अध्ययन में, हमने इन बिंदुओं को संबोधित करने की कोशिश की। इसके लिए, कोलेजनेस पाचन के बाद फेफड़ों के नमूनों का क्या हुआ, शुरू में इसकी निगरानी की गई थी, और महत्वपूर्ण संदूषण की पहचान अलग-अलग सेल प्रकारों, विशेष रूप से एसएमसी (चित्रा 2) द्वारा की गई थी, जो तेजी से बढ़ते हैं और मिश्रित संस्कृतियों में एचएलएमवीईसी से आगे निकल सकते हैं। इसलिए, पाचन के बाद इस संदूषण को कम करने के लिए एक रणनीति निर्धारित की गई थी (चित्रा 1 और चित्रा 2)। उल्लेखनीय रूप से, ~ 70% शुद्धता (चित्रा 3 ए, बी) के साथ एचएलएमवीईसी लगातार पहले अलगाव चरण में प्राप्त किए गए थे। इस उत्कृष्ट परिणाम ने एफएसीएस द्वारा बाद के शुद्धिकरण चरण को सुविधाजनक बनाया, जिससे लगभग शुद्ध, कार्यात्मक एचएलएमवीईसी (चित्रा 3 सी-ई) प्राप्त करने का अंतिम परिणाम मिला। इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए थे जब फुफ्फुसीय धमनी खंडों को शुरुआती सामग्री के रूप में उपयोग किया गया था और एचपीएईसी पृथक कोशिकाएं थीं, इस प्रकार इसका अर्थ है कि यहपद्धति पहले रिपोर्ट की गई पद्धति में सुधार का प्रतिनिधित्व करती है।

यद्यपि सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, इस प्रक्रिया में प्रमुख आवश्यकताएं हैं। उदाहरण के लिए, हम केवल शल्य चिकित्सा से 3-6 घंटे के भीतर प्राप्त फेफड़ों के टुकड़ों को संसाधित करके एचएलएमवीईसी अलगाव में सफल रहे, जबकि लंबे अंतराल खराब परिणामों से जुड़े थे (डेटा नहीं दिखाया गया)। कोलेजनेस पाचन समय भी एंजाइमेटिक गतिविधि24 में बहुत अधिक भिन्नताओं के कारण ईसी उपज में परिवर्तनशीलता का परिचय दे सकता है। एक और महत्वपूर्ण बिंदु नमूना स्थिति से संबंधित है। धूम्रपान करने वालों या बुजुर्ग दाताओं से प्राप्त फेफड़ों के पैरेन्काइमा ने कम एचएलएमवीईसी पैदावार दी। इसके अलावा, कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन के सुपरनैटेंट में कुछ समुच्चय हो सकते हैं जिन्हें "ट्यूब 2" में स्थानांतरित किया जाता है। इस कारण से, "ट्यूब 1" और "ट्यूब 2" की सामग्री को संस्कृति में रखने की सिफारिश की जाती है, कम से कम सेल अलगाव के शुरुआती चरण के दौरान। सीडी 31 + कोशिकाओं की सीधी छंटाई, जैसा कि पहले ईसी अलगाव प्रोटोकॉल 11,12,15,17,18 में वर्णित है, शुरुआत से शुद्धता बढ़ाने के लिए एक अच्छा समाधान भी प्रस्तुत कर सकता है। हमने विश्लेषण किए गए नमूनों के छोटे आकार के कारण इस प्रारंभिक छंटाई चरण को लागू नहीं किया। हालांकि, प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन में भविष्य में इस संभावना का परीक्षण किया जाएगा।

एचएलएमवीईसी और एचपीएईसी को अलग करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय अलगाव प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को अपने अध्ययन के लिए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस मार्ग का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करेगा, खासकर जब ये कोशिकाएं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। उदाहरण के लिए, सीएफ फेफड़ों से एचएलएमईसी को अलग करने से चिप25 पर एक पूर्ण सीएफ वायुमार्ग का निर्माण होगा। इसके अलावा, अपना खुद का ईसी संग्रह बनाने से शोधकर्ताओं को कम लागत पर अधिक प्रयोगों की योजना बनाने और चलाने में मदद मिलेगी।

अंत में, यह विधि, जो सर्जिकल नमूनों से ईसी अलगाव के दौरान होने वाले कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को हल करती है, मौजूदा तरीकों में सुधार करती है, इस प्रकार ईसी पैथोबायोलॉजी और सूजन पर शोध की सुविधा प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि शोध किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों के बिना आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम को विश्वविद्यालय और अनुसंधान के इतालवी मंत्रालय (पूर्व 60% 2021 और 2022) से आरपी और इतालवी सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (एफएफसी # 23/2014) और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (एल 548/93) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X GIBCO 25300-054 Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59 Dako M0823 Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody Thermo Fisher Scientific MA5-14029 Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors Any Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm Corning 431750 Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm Corning 431751 Using during the first filtration
Collagenase, Type 2 Worthington LS004177 Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody BD Biosciences 555445 Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8537 Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell C-22020 HLMVEC growth medium
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895 Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A Sigma-Aldrich G2500 Used for plate coating
Type A gelatin Sigma-Aldrich g-2500 Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%

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References

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Plebani, R., D'Alessandro, A., Lanuti, P., Simeone, P., Cinalli, M., Righi, I., Palleschi, A., Mucci, M., Marchisio, M., Cappabianca, F., Camera, M., Mucilli, F., Romano, M. Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples. J. Vis. Exp. (192), e64885, doi:10.3791/64885 (2023).

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