Summary
Selv om det er utfordrende, er isolering av pulmonale endotelceller avgjørende for studier på lungebetennelse. Denne protokollen beskriver en prosedyre for høyavkastningsisolering av makrovaskulære og mikrovaskulære endotelceller med høy renhet.
Abstract
Tilgjengeligheten av celler isolert fra friske og syke vev og organer representerer et nøkkelelement for personlig medisin tilnærminger. Selv om biobanker kan gi en bred samling av primære og immortaliserte celler for biomedisinsk forskning, dekker disse ikke alle eksperimentelle behov, spesielt de som er relatert til spesifikke sykdommer eller genotyper. Vaskulære endotelceller (EC) er nøkkelkomponenter i den immuninflammatoriske reaksjonen og spiller dermed en sentral rolle i patogenesen av en rekke lidelser. Spesielt viser ECs fra forskjellige steder forskjellige biokjemiske og funksjonelle egenskaper, noe som gjør tilgjengeligheten av spesifikke EC-typer (dvs. makrovaskulær, mikrovaskulær, arteriell og venøs) avgjørende for å designe pålitelige eksperimenter. Her illustreres enkle prosedyrer for å oppnå høyutbytte, tilnærmet rene humane makrovaskulære og mikrovaskulære endotelceller fra lungearterien og lungeparenkymet i detalj. Denne metoden kan enkelt reproduseres til en relativt lav kostnad av ethvert laboratorium for å oppnå uavhengighet fra kommersielle kilder og oppnå EF-fenotyper / genotyper som ennå ikke er tilgjengelige.
Introduction
Det vaskulære endotelet strekker den indre overflaten av blodkarene. Det spiller nøkkelroller i regulering av blodkoagulasjon, vaskulær tone og immuninflammatoriske responser 1,2,3,4. Selv om kulturen av endotelceller (EC) isolert fra humane prøver er avgjørende for forskningsformål, må det bemerkes at EC fra forskjellige blodkar (arterier, vener, kapillærer) har spesifikke funksjoner. Disse kan ikke rekapituleres fullt ut av humane endotelceller i navlestrengen (HUVEC), som er lett tilgjengelige og mye brukt i studier på patofysiologi ved vaskulær endotel 5,6. For eksempel spiller humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) nøkkelroller i lungebetennelse ved å kontrollere leukocytrekruttering og akkumulering 4,7. Dermed bør en eksperimentell setting rettet mot å reprodusere lungebetennelse med høy troskap inkludere HLMVEC. På den annen side kan EC dysfunksjon observeres i flere patologier; Derfor er ECs fra pasienten grunnleggende for å bygge en pålitelig in vitro-modell av sykdommen. For eksempel har isoleringen av fragmenter av EC fra lungearterien (HPAEC), dissekert fra de eksplanterte lungene til mennesker som er rammet av cystisk fibrose (CF), gjort det mulig for oss å avdekke mekanismer for endoteldysfunksjon i denne sykdommen 8,9.
Derfor er protokoller som tar sikte på å optimalisere isoleringen av EC fra forskjellige kilder / organer også i sykdomstilstander, avgjørende for å gi etterforskere verdifulle forskningsverktøy, spesielt når disse verktøyene ikke er kommersielt tilgjengelige. HLMVEC og HPAEC isolasjonsprotokoller er tidligere rapportert 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. I alle tilfeller resulterte den enzymatiske fordøyelsen av lungeprøvene i blandede cellepopulasjoner, som ble renset ved hjelp av ad hoc selektive medier og magnetiske perler- eller cytometrisk-basert cellesortering. Ytterligere optimaliseringer av disse protokollene må ta opp to hovedproblemer i EF-isolasjon: (1) celle- og vevsforurensning, som bør løses så tidlig som mulig kulturpassasjer for å minimere EC-replikativ senescens20; og (2) det lave utbyttet av primære EC-isolater.
Denne studien beskriver en ny protokoll for isolering av høy avkastning og høy renhet av HLMVEC og HPAEC. Denne prosedyren kan lett anvendes og gi praktisk talt rene makrovaskulære og mikrovaskulære ECs i noen få trinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent, og protokollen fulgte retningslinjene til komiteen for human forskningsetikk ved Universitetet i Chieti-Pescara (#237_2018bis). Figur 1 illustrerer isolering av endotelceller fra segmenter (1-3 cm lange) av lungeparenkym eller lungearterie fra avidentifiserte forsøkspersoner (med skriftlig samtykke) som av ulike årsaker er thoraxkirurgiske, som pneumothorax eller lobektomi. I sistnevnte tilfelle samlet kirurgene også et lungearteriesegment. Spesielt ble kirurgene nøyaktig instruert til å samle kreftfrie prøver. Den presenterte protokollen ble optimalisert for å oppnå størst mulig utbytte og renhet.
1. Eksperimentell forberedelse
- Rekonstitusjon av kollagenase
- Løs opp kollagenasepulver i fosfatbufret saltvann uten CaCl 2 og MgCl 2 (PBS-−−, se materialfortegnelse) i en konsentrasjon på2 mg/ml, og filtrer oppløsningen med et 0,22 μm porefilter.
- Tilbered 5 ml alikoter og oppbevar dem ved -20 °C. Tin og forvarm alikotene til 37 °C før bruk.
- Plate belegg
- For platebelegg, pipette 1,5 % gelatinoppløsning eller 50 μg/ml fibronektin (se materialfortegnelse) inn i kulturplaten (500 μL er nok til å dekke overflaten av hver brønn på en 6-brønnsplate), og inkuber i 1 time ved 37 °C.
- Etter inkubering, fjern overflødig gelatin og vask brønnene med PBS--. Aspirer PBS-−−, og la platen tørke i en steril hette.
MERK: For rekonstituering av gelatin, løs opp pulveret i vann for å lage en 1,5 % oppløsning, autoklav det deretter og oppbevar det ved 4 °C. Gelatin ved 1,5 % er ikke flytende ved 4 °C; Derfor må den varmes opp før platebelegg. Alternativt kan enhver kommersiell gelatinløsning egnet for cellekulturer brukes til platebelegget.
2. Forberedelse av prøve
- Lunge parenchyma
- Vask de innsamlede prøvene ved å senke dem i et 50 ml rør som inneholder PBS--.
- Overfør prøvene til en steril petriskål, og hakk prøven manuelt med kirurgisk saks (optimal størrelse: >2 cm) i små fragmenter på ca. 3-4 mm hver.
- Arteriesegment(er)
- Vask de innsamlede prøvene ved å senke dem i et 50 ml rør som inneholder PBS--.
- Overfør den til en steril petriskål uten å hakke, da fragmentering vil øke overflaten av tverrsnittet av arteriesegmentet, og dermed øke muligheten for å isolere ikke-EC.
3. Enzymatisk fordøyelse
- Vask lungeparenkymet i terninger eller lungearteriesegmentet/s to ganger med PBS-−−. Dette trinnet vil fjerne en stor del av det gjenværende blodet.
- Plasser prøvene i 15 ml rør, og inkuber med 5 ml kollagenase type 2 (se materialfortegnelse) i 10 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Under denne inkubasjonen frigjør nedbrytningen av den ekstracellulære matrisen enkeltceller og celleaggregater.
4. Gjenoppretting av fordøyede celler
- Plasser en steril stål / metallsil (dvs. en tesil med ~ 1 mm maskestørrelse) på toppen av et 50 ml oppsamlingsrør.
- Hell hele innholdet fra 15 ml røret på silen, masser forsiktig det fordøyde vevet med en slikkepott og skyll prøven med PBS-−− til oppsamlingsrøret er fylt.
MERK: Dette trinnet vil eliminere store vevsfragmenter på millimeterskalaen, noe som sikrer større effektivitet i de påfølgende filtreringstrinnene.
5. Ikke-EC-fjerning ved filtrering
- Filtrer utstrømningen samlet i trinn 4.2 ved hjelp av en cellesil med 70 μm maskestørrelse, og samle utstrømningen i et nytt 50 ml rør.
- Bruk deretter en cellesil med en 40 μm maskestørrelse, og samle utstrømningen i et nytt 50 ml rør. Merk dette røret som "tube 1".
MERK: Disse filtreringene i trinn 5.1 og trinn 5.2 vil fjerne store celleaggregater, som ofte består av blandede cellepopulasjoner.
6. Sedimentering av celleklynger og cellesåing
- Sentrifuger prøvene ved 30 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å sedimentere celleklyngene.
- Fjern forsiktig supernatanten med en steril pipette (ikke hell), og legg den i en ny 50 ml slange ("tube 2").
- Heng pelleten i "tube 1", og fyll røret opp til 50 ml med PBS-−−. Fyll "rør 2" opp til 50 ml med PBS−−.
MERK: Fra dette trinnet og fremover behandles begge rørene på samme måte. - Sentrifuger prøvene ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Suspender pellets med 2 ml vekstmedium (se materialtabell), og frø suspensjonen i to separate brønner i en forhåndsbelagt 6-brønns plate (trinn 1.2).
MERK: Fra dette trinnet, mate cellene hver 2. dag med vekstmediet til de når sammenløp (ca. 1 uke, avhengig av prøvestørrelsen) for å oppnå et rimelig antall celler for sortering.
7. Cell utvidelse
- Vask cellene med 2 ml PBS med CaCl 2 og MgCl2 (PBS ++, se materialfortegnelse) for å fjerne de resterende blodcellene (bruk av PBS ++ er viktig for å unngå celleavløsning).
- Fjern PBS ++, og legg til nytt kulturmedium.
- Gjenta trinn 7.1 og trinn 7.2 til cellene når konfluens (ca. 1 uke, avhengig av prøvestørrelsen).
8. Cell sortering
- Løsne cellene ved hjelp av 500 μL trypsin-EDTA (0,05%, se materialtabell), sentrifuge, og resuspender pelleten med 190 μL PBS-−.
- Tilsett 10 μL fluorescerende konjugat anti-humant CD31-FITC-antistoff (1:20 fortynning, se materialfortegnelse), og inkuber cellesuspensjonen ved 4 °C i 30 minutter.
- Vask cellene med 10 ml PBS-−−, sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og resuspender pelleten i 300 μL PBS−−.
- Isoler og samle CD31-positive (CD31+) celler ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS), ved hjelp av en 100 μm dyse, og samle dem i et rør.
- I henhold til gating-strategien definerer du først cellemorfologien ved hjelp av sidespredningsområdeparametrene, SSC-A og FSC-A. Velg deretter enkeltceller ved hjelp av et FSC-område / FSC-høyde eller SSC-område / SSC-høydepunktplott, definer de positive cellene i den merkede prøven mot den ufargede kontrollprøven, og rett de fluorescerende cellene inn i oppsamlingsrøret21.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og suspender pelleten i 2 ml vekstmedium for såing i de forhåndsbelagte brønnene på en 6-brønnsplate.
9. Utvidelse etter sortering
- To dager etter cellesortering, erstatt det betingede mediet med friskt vekstmedium.
- Gjenta trinn 7.1 og trinn 7.2 hver 2. dag for celleutvidelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HLMEC-isolasjon
Hovedproblemet under isolering av HLMVEC er tilstedeværelsen av forurensende celler, siden de mikroskopiske kapillærene ikke lett kan skilles fra stromalvevet. Derfor er det avgjørende å oppnå høyest mulig renhet i de tidligste stadiene av isolasjonsprosessen for å redusere kulturpassasjene og dermed cellens aldring. På samme måte bør en optimal isolasjonsprotokoll gi høyest mulig utbytte av rene HLMVEC. For å oppnå disse målene ble det satt opp en ny prosedyre basert på tidligere beskrevne protokoller 10,11,12,14,15.
Selv om lungeparenkymet er sterkt vaskularisert, og dermed representerer en utmerket kilde til HLMVEC, er den i stor grad befolket av glatte muskelceller (SMC), kollagenfibre og fibroblaster. Disse cellene, spesielt SMC, kan tilpasse seg en rekke kulturmedier og, i nesten alle tilfeller, replikere in vitro mye raskere enn andre cellepopulasjoner, noe som betyr at de tar over den blandede cellekulturen. Derfor var vår første bekymring å kalibrere den enzymatiske fordøyelsen av parenkymet for å redusere overføringen av uønskede celler. Siden type 2 kollagenase raskt løsner grupper av endotelceller fra resten av kapillæren, resonnerte vi at fordøyelsestiden til lungeprøven kunne være avgjørende for å minimere celleforurensning. Som et første trinn ble derfor eksponeringstiden for kollagenase av det utskårne lungefragmentet redusert til maksimalt 10 minutter i stedet for de foreslåtte 20 min15 (figur 2A). Etter denne behandlingen ble det observert at en del av celleaggregatene, inkludert SMC og fibroblaster, fortsatt var bundet til lange fibre (figur 2B), mens SMC representerte flertallet av ikke-blodcellesingleter. Små, kompakte klynger av celler, med diametere generelt ikke over 10-20 μm, ble også observert uten elementer som kan tilskrives fragmenter av stromalvev (dvs. store fibre) (figur 2B). Det ble antatt at disse småcelleaggregatene kunne bestå hovedsakelig av HLMVEC.
Etter denne hypotesen ble det utført serielle filtreringstrinn for å maksimere HLMVEC-utvinningen. For den første filtreringen ble det brukt en metallsil, og prøven ble massert med pinsett for å lette rømningen av HLMVEC fra kapillærene (figur 2C, til høyre). Målet med dette trinnet var å fjerne de store klyngene av glatte muskelceller og fibroblaster som fortsatt er bundet til den ekstracellulære matrisen. Utstrømningen ble deretter filtrert ved hjelp av en sekvens på 70 μm og 40 μm maskestørrelsesiler for å fjerne de resterende store, men ikke øyesynlige, aggregatene (figur 2C, midten, venstre). For å fjerne cellesingletene ble prøvene sentrifugert ved 30 x g i 5 minutter, en hastighet som sedimenterer celler og aggregater med en diameter >7-10 μm, og dermed etterlater de mindre cellene i suspensjon. Disse sentrifugeringsparametrene ble valgt basert på de som ble rapportert av Miron et al. for pelletering av sirkulerende blodceller22. Spesielt etter denne sentrifugeringen var supernatanten rødfarget (figur 2D), noe som indikerer tilstedeværelsen av mange røde blodlegemer (~ 5 μm i diameter). På dette tidspunktet ble supernatanten forsiktig fjernet og plassert i et andre rør. Begge rørene med supernatanten og pelleten ble fylt med PBS-− og sentrifugert ved 300 x g i 5 minutter. Etter sentrifugering viste røret som inneholdt supernatanten en rød pellet anriket i blodceller, noe som tyder på at den også inneholdt de fleste av de eksplanterte cellesinglettene (figur 2E, til høyre).
De oppnådde pellets ble suspendert med endotelcellevekstmediet og separat sådd i to brønner med en 6-brønnsplate, som ble forhåndsbelagt med 1,5% gelatin fra svinehud (figur 2E, midten). Etter 3 dager ble cellene vasket med PBS ++, matet med friskt medium og avbildet. Som vist til venstre i figur 2E, var EC-øyene mer tallrike i brønnen som inneholdt cellene fra "rør 1" (øverst), mens brønnen som inneholdt cellene fra "rør 2" (nederst) for det meste var befolket av enkle og ikke-endotellignende celler.
Den samme prosedyren ble brukt på den mindre utfordrende HPAEC-isolasjonsprotokollen som ble rapportert i vårt tidligere arbeid, der HPAEC-separasjonen involverte å utnytte deres kortere adhesjonstid sammenlignet med forurensningsceller8. På grunn av deres store størrelse kan arteriene lett rengjøres fra gjenværende bindevev og fettvev, og eliminerer dermed en stor andel ikke-EC. Imidlertid var en stor andel fibroblaster og ekstracellulære matriksfibre fortsatt tilstede i prøvene på dette stadiet, i tillegg til vaskulære SMC8. Den nye prosedyren økte ytterligere den opprinnelige EC-renheten under HPAEC-eksplantene (resultater ikke vist).
Rensing og fenotypisk og funksjonell karakterisering av ferskt isolerte HLMVEC
På slutten av isolasjonsprotokollen ble renheten til HLMVECene analysert ved flowcytometrisk deteksjon av cellemembran CD31. For korrekt identifisering av CD31+-cellerommet ble det satt en port på et punktplott for foroverspredning (FSC)/sidespredning (SSC), og en morfologisk homogen populasjon av celler ble identifisert. En slik populasjon var representert på et FSC-område/FSC-høydepunktplott, og enkeltceller ble inngjerdet og analysert for overflateuttrykket til CD31 (hierarkisk gatingstrategi, ikke vist). I beste fall ble ~70% rene HLMVEC enkeltceller (figur 3A,B) oppnådd. Merk at HLMVEC-utbyttet ble signifikant redusert når prøven ikke ble behandlet umiddelbart etter operasjonen eller når donoren var eldre eller en røyker.
For å oppnå renere HLMVEC-preparater ble CD31+-cellene sortert og sådd i 1,5 % gelatinbelagte dyrkningsplater. De sorterte cellene antok den karakteristiske endotellignende formen (figur 3C), og som rapportert i figur 3D viste konfokalmikroskopi at nesten 100 % av de FACS-rensede cellene farget positivt for EC-antigener, nemlig CD31 og den mer spesifikke von Willebrand-faktoren (vWF)23. Videre, da disse cellene ble sådd i Matrigel, genererte de rørformede strukturer, så vel som HUVECs (figur 3E), og bekreftet dermed deres endotelfenotype.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av prosedyren. Flytskjemaet viser prosedyren for endotelcelleisolering og fjerning av ikke-endotelceller. Hvert trinn rekapitulerer hendelsene beskrevet i trinn 2-6 i den eksperimentelle protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Illustrasjon av den optimaliserte EC-isolasjonsprosedyren. (A) Representativt bilde av en lungeparenkymprøve teret i små fragmenter før kollagenasefordøyelse (venstre) og inkubert i et 15 ml rør inneholdende 5 ml kollagenase type 2 (høyre). (B) Skjematisk (venstre) og faktisk (høyre; forstørrelse: 100x) representasjon av cellepopulasjonene oppnådd etter kollagenasefordøyelse. Disse populasjonene inkluderer singleter av ikke-EC og EC, grupper av EC og grupper av ikke-ECer bundet til fibre, som fjernes ved hjelp av siler. (C) Serielle filtreringer ved bruk av metallsiler på 70 μm og 40 μm nett. (D) Bilde av 50 ml røret etter sentrifugering i lav hastighet og før separering av supernatantene fra pellets i "tube 1" og "tube 2". Celleklynger er inneholdt i pelleten, mens enkeltcellene for det meste er inneholdt i supernatanten. (E) Bilde som viser de forskjellige fargene og sammensetningene av pelleten og de isolerte cellene fra "rør 1" (øverst) og "rør 2" (nederst); Forstørrelse: 100x. Forkortelse: EC = endotelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: HLMVEC fenotypisk og funksjonell karakterisering. (A) En blandet cellepopulasjon oppnådd fra en lungeparenkymeksplant. (B) CD31-deteksjon ved flowcytometri på overflaten av celler ved slutten av første passasje. Den prosentvise renheten (70%) refererer til den brukte hierarkiske gating-strategien. (C) Rene HLMVEC etter å ha blitt levendesortert for CD31-antigenet. (D) Representative immunfluorescens konfokale mikroskopiske bilder av CD31 (venstre) og vWF (høyre) positiv farging (skala bar: 50 μm). (E) Brightfield-bilder ble tatt 6 timer etter seeding HUVECs eller HLMVECs på Matrigel.Magnification (A, C, E): 100x. Forkortelser: HLMVECs = humane lunge mikrovaskulære endotelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mange rollene som vaskulære endotelceller spiller i human patofysiologi, gjør disse cellene til et uunnværlig verktøy for in vitro patogenetiske og farmakologiske studier. Siden ECs fra forskjellige vaskulære steder / organer viser spesielle egenskaper og funksjoner, vil tilgjengeligheten av sunne og syke ECs fra organet av interesse være ideell for forskningsformål. For eksempel er HLMVEC avgjørende for studier på lungebetennelse; Derfor vil en metodikk for høy avkastning, høy renhet isolasjon av disse cellene nytte ulike forskningsfelt.
Metoder for å isolere HLMVEC er rapportert av ulike grupper 10,11,12,14,15,17,18,19. Hver metode har introdusert innovative tilnærminger, for eksempel cellesortering med magnetiske perler 11,12,15,17,18 eller mekanisk dissosiasjon ved hjelp av en stump kanyle17,18. Den nåværende protokollen ble utformet for å samle de små øyene av endotelceller oppnådd etter kollagenasefordøyelse og brukte sedimenteringstidsbaserte serielle sentrifugeringer for å øke renheten til ECene i den opprinnelige blandede cellepopulasjonen. Dette punktet er avgjørende siden høyere startcelletall betyr at lavere antall in vitro-utvidelser er nødvendig for å nå antall celler som kreves for forsøkene, noe som igjen betyr at flere undersøkelser kan fullføres før EFs senesce. Dette aspektet er strengt knyttet til renhetsgraden til HLMVEC-isolatene, som også er relevant for å oppnå pålitelige resultater. Dessuten, hvis lungeprøven er svært liten i størrelse og det ikke er mulighet for å utføre EC-sortering umiddelbart etter eksplantasjonen, som etter vår erfaring var det hyppigste scenariet, vil de forurensende SMC-ene vokse raskere enn EC-ene, og dermed overta kulturen og redusere utbyttet av EC etter cellesortering.
I denne studien forsøkte vi å adressere disse punktene. For dette ble det som skjedde med lungeprøvene etter kollagenasefordøyelsen først overvåket, og signifikant forurensning ble identifisert av varierende celletyper, spesielt SMC (figur 2), som vokser raskt og kan overta HLMVEC i blandingskulturer. Derfor ble det satt en strategi for å minimere denne forurensningen umiddelbart etter fordøyelsen (figur 1 og figur 2). Bemerkelsesverdig nok ble HLMVEC med ~ 70% renhet (figur 3A, B) konsekvent oppnådd i den første isolasjonsfasen. Dette utmerkede resultatet muliggjorde det påfølgende rensetrinnet ved FACS, noe som førte til det endelige resultatet av å oppnå praktisk talt rene, funksjonelle HLMVEC (figur 3C-E). Lignende resultater ble oppnådd når lungearteriesegmenter ble brukt som utgangsmateriale og HPAEC var de isolerte cellene, noe som betyr at denne metoden representerer en forbedring av metodikken rapportert tidligere8.
Selv om den er enkel og reproduserbar, har denne prosedyren nøkkelkrav. For eksempel lyktes vi med HLMVEC-isolering ved kun å behandle lungefragmenter oppnådd innen 3-6 timer fra kirurgisk eksisjon, mens lengre intervaller var assosiert med dårlige utfall (data ikke vist). Kollagenasefordøyelsestiden kan også introdusere variabilitet i EC-utbyttet på grunn av lot-to-lot-variasjonene i enzymatisk aktivitet24. Et annet kritisk punkt er knyttet til prøvebetingelsen. Lungeparenkym avledet fra røykere eller eldre donorer ga lave HLMVEC-utbytter. Videre kan supernatanten av lavhastighets sentrifugering inneholde noen aggregater som overføres til "rør 2". Av denne grunn anbefales det å holde innholdet i "rør 1" og "rør 2" i kultur, i hvert fall i tidlig stadium av celleisolasjon. Den direkte sorteringen av CD31+-celler, som tidligere beskrevet i ECs isolasjonsprotokoller 11,12,15,17,18, kan også representere en god løsning for å øke renheten fra starten. Vi brukte ikke dette tidlige sorteringsstadiet på grunn av den lille størrelsen på prøvene som ble analysert. Denne muligheten vil imidlertid bli testet i fremtiden i implementeringen av protokollen.
En enkel og pålitelig isolasjonsprotokoll for isolering av HLMVEC og HPAEC vil oppmuntre etterforskere til å bruke denne ruten for å skaffe celler til studiene, spesielt når disse cellene ikke er kommersielt tilgjengelige. For eksempel vil isolering av HLMEC fra CF-lunger tillate konstruksjon av en full CF-luftvei på en chip25. Videre vil det å lage sin egen EC-samling gjøre det mulig for forskere å planlegge og kjøre flere eksperimenter til en lavere kostnad.
Avslutningsvis forbedrer denne metoden, som løser noen kritiske punkter som kan oppstå under EC-isolering fra kirurgiske prøver, de eksisterende metodene, og letter dermed forskning på EC-patobiologi og betennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført uten kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra det italienske departementet for universitet og forskning (ex 60% 2021 og 2022) til RP og av tilskudd fra den italienske Cystic Fibrosis Foundation (FFC # 23/2014) og fra det italienske helsedepartementet (L548/93) til M. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A.
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G.
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D.
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
