Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mikrovaskulær og makrovaskulær endotelcelleisolering og oprensning fra lungeafledte prøver

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64885
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 2,3, 1, 4, 4,5, 1,2, 2,3, 1, 6,7, 1, 1,2
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

Selvom det er udfordrende, er isolering af lungeendotelceller afgørende for undersøgelser af lungebetændelse. Denne protokol beskriver en procedure til højtydende isolering af makrovaskulære og mikrovaskulære endotelceller med høj renhed.

Abstract

Tilgængeligheden af celler isoleret fra sunde og syge væv og organer repræsenterer et centralt element for personaliserede medicinske tilgange. Selvom biobanker kan levere en bred samling af primære og udødeliggjorte celler til biomedicinsk forskning, dækker disse ikke alle eksperimentelle behov, især dem, der er relateret til specifikke sygdomme eller genotyper. Vaskulære endotelceller (EC'er) er nøglekomponenter i den immuninflammatoriske reaktion og spiller således en central rolle i patogenesen af en række lidelser. Især EC'er fra forskellige steder viser forskellige biokemiske og funktionelle egenskaber, hvilket gør tilgængeligheden af specifikke EC-typer (dvs. makrovaskulær, mikrovaskulær, arteriel og venøs) afgørende for at designe pålidelige eksperimenter. Her illustreres enkle procedurer til opnåelse af højtydende, næsten rene humane makrovaskulære og mikrovaskulære endotelceller fra lungearterien og lungeparenchymen detaljeret. Denne metode kan let reproduceres til relativt lave omkostninger af ethvert laboratorium for at opnå uafhængighed af kommercielle kilder og opnå EF-fænotyper/-genotyper, der endnu ikke er tilgængelige.

Introduction

Det vaskulære endotel linjer den indre overflade af blodkarrene. Det spiller nøgleroller i reguleringen af blodkoagulation, vaskulær tone og immuninflammatoriske reaktioner 1,2,3,4. Selvom kulturen af endotelceller (EC'er) isoleret fra humane prøver er afgørende for forskningsformål, skal det bemærkes, at EC'erne fra forskellige blodkar (arterier, vener, kapillærer) har specifikke funktioner. Disse kan ikke rekapituleres fuldt ud af humane navlestrengendototelceller (HUVEC), som er let tilgængelige og i vid udstrækning anvendes i undersøgelser af vaskulær endotelpatofysiologi 5,6. For eksempel spiller humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC'er) nøgleroller i lungebetændelse ved at kontrollere leukocytrekruttering og akkumulering 4,7. Således bør en eksperimentel indstilling, der sigter mod at reproducere lungebetændelse med høj troskab, omfatte HLMVEC'er. På den anden side kan EC-dysfunktion observeres i flere patologier; derfor er EC'er fra patienten grundlæggende for at opbygge en pålidelig in vitro-model af sygdommen. For eksempel har isoleringen af fragmenter af EC'er fra lungearterien (HPAEC'er), dissekeret fra de udplantede lunger hos mennesker, der er ramt af cystisk fibrose (CF), gjort det muligt for os at afdække mekanismer for endoteldysfunktion i denne sygdom 8,9.

Derfor er protokoller, der sigter mod at optimere isoleringen af EC'er fra forskellige kilder / organer også i sygdomstilstande, afgørende for at give efterforskere værdifulde forskningsværktøjer, især når disse værktøjer ikke er kommercielt tilgængelige. HLMVEC og HPAEC isolationsprotokoller er tidligere rapporteret 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. I alle tilfælde resulterede den enzymatiske fordøjelse af lungeprøverne i blandede cellepopulationer, som blev oprenset ved hjælp af ad hoc-selektive medier og magnetiske perler- eller cytometrisk baseret cellesortering. Yderligere optimeringer af disse protokoller skal løse to hovedproblemer i EF-isolation: (1) celle- og vævskontaminering, som bør løses så hurtigt som muligt kulturpassager for at minimere EF-replikativ ældning20; og (2) det lave udbytte af primære EF-isolater.

Denne undersøgelse beskriver en ny protokol for isolering med højt udbytte og høj renhed af HLMVEC'er og HPAEC'er. Denne procedure kan let anvendes og give næsten rene makrovaskulære og mikrovaskulære EC'er i nogle få trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt, og protokollen fulgte retningslinjerne fra den menneskelige forskningsetiske komité ved University of Chieti-Pescara (# 237_2018bis). Figur 1 illustrerer isoleringen af endotelceller fra segmenter (1-3 cm lange) af lungeparenkym eller lungearterie fra deidentificerede forsøgspersoner (med skriftligt samtykke), der gennemgår thoraxkirurgi af forskellige årsager, såsom pneumothorax eller lobektomi. I sidstnævnte tilfælde indsamlede kirurgerne også et lungearteriesegment. Især blev kirurgerne nøjagtigt instrueret til at indsamle kræftfrie prøver. Den præsenterede protokol blev optimeret for at opnå størst muligt udbytte og renhed.

1. Eksperimentel forberedelse

  1. Rekonstitution af kollagenase
    1. Kollagenasepulver opløses i fosfatbufret saltvand uden CaCl2 og MgCl2 (PBS-−−, se materialetabel) ved en koncentration på 2 mg/ml, og opløsningen filtreres ved hjælp af et porefilter på 0,22 μm.
    2. Forbered 5 ml alikvoter, og opbevar dem ved -20 °C. Optø og forvarm delprøverne til 37 °C før brug.
  2. Plade belægning
    1. Til pladebelægning pipetteres 1,5% gelatineopløsning eller 50 μg/ml fibronectin (se materialetabel) ind i kulturpladen (500 μL er nok til at dække overfladen af hvert hul i en 6-brønds plade) og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    2. Efter inkubation fjernes overskydende gelatine, og brøndene vaskes med PBS-. Opsug PBS−−, og lad pladen tørre i en steril hætte.
      BEMÆRK: Til gelatinerekonstitution opløses pulveret i vand for at lave en 1,5% opløsning, autoklave det derefter og opbevares ved 4 ° C. Gelatine ved 1,5% er ikke flydende ved 4 °C; Derfor skal det opvarmes inden pladebelægning. Alternativt kan enhver kommerciel gelatineopløsning, der er egnet til cellekulturer, anvendes til pladebelægningen.

2. Forberedelse af prøver

  1. Lunge parenchyma
    1. De indsamlede prøver vaskes ved at nedsænke dem i et 50 ml rør indeholdende PBS−−.
    2. Overfør prøverne til en steril petriskål, og hak prøven manuelt ved hjælp af kirurgisk saks (optimal størrelse: >2 cm) i små fragmenter på ca. 3-4 mm hver.
  2. Arteriesegment(er)
    1. De indsamlede prøver vaskes ved at nedsænke dem i et 50 ml rør indeholdende PBS−−.
    2. Overfør det til en steril petriskål uden at hakke, da fragmentering vil øge overfladearealet af tværsnittet af arteriesegmentet og dermed øge muligheden for at isolere ikke-EC'er.

3. Enzymatisk fordøjelse

  1. Vask lungeparenkymet i tern eller lungearteriesegmentet to gange med PBS-−−. Dette trin fjerner en stor del af det resterende blod.
  2. Prøverne anbringes i 15 ml reagensglas, og de inkuberes med 5 ml type 2 kollagenase (se materialetabellen) i 10 minutter ved 37 °C og 5 % CO2. Under denne inkubation frigiver nedbrydningen af den ekstracellulære matrix enkeltceller og celleaggregater.

4. Genopretning af de fordøjede celler

  1. Placer en steril stål/metalsi (dvs. en tesi med en ~1 mm maskestørrelse) på toppen af et 50 ml opsamlingsrør.
  2. Hæld hele indholdet fra 15 ml røret på sien, massér forsigtigt det fordøjede væv med en spatel, og skyl prøven med PBS-−−, indtil opsamlingsrøret er fyldt.
    BEMÆRK: Dette trin eliminerer store vævsfragmenter på millimeterskalaen, hvilket sikrer større effektivitet af de efterfølgende filtreringstrin.

5. Fjernelse uden for EF ved filtrering

  1. Filtrer udstrømningen opsamlet i trin 4.2 ved hjælp af en cellesi med en maskestørrelse på 70 μm, og opsaml udstrømningen i et frisk 50 ml rør.
  2. Brug derefter en cellesi med en maskestørrelse på 40 μm, og saml udstrømningen i et frisk 50 ml rør. Mærk dette rør som "rør 1".
    BEMÆRK: Disse filtreringer i trin 5.1 og trin 5.2 fjerner store celleaggregater, som ofte består af blandede cellepopulationer.

6. Sedimentering af celleklynger og cellesåning

  1. Centrifuger prøverne ved 30 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at sedimentere celleklyngerne.
  2. Supernatanten fjernes forsigtigt med en steril pipette (hæld ikke), og læg den i et friskt 50 ml glas ("tube 2").
  3. Ophæng pillen i "rør 1", og fyld røret op til 50 ml med PBS−−. Fyld "rør 2" op til 50 ml med PBS−−.
    BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter behandles begge rør på samme måde.
  4. Centrifuger prøverne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Pellets suspenderes med 2 ml vækstmedium (se materialetabellen), og suspensionen tilsættes i to separate huller i en forbelagt 6-brønds plade (trin 1.2).
    BEMÆRK: Fra dette trin fodres cellerne hver 2. dag med vækstmediet, indtil de når sammenløb (ca. 1 uge afhængigt af prøvestørrelsen) for at opnå et rimeligt antal celler til sortering.

7. Celleudvidelse

  1. Cellerne vaskes med 2 ml PBS med CaCl2 ogMgCl2 (PBS++, se materialetabel) for at fjerne de resterende blodlegemer (det er vigtigt at bruge PBS++ for at undgå celleløsning).
  2. Fjern PBS++, og tilsæt frisk dyrkningsmedium.
  3. Gentag trin 7.1 og trin 7.2, indtil cellerne når sammenløb (ca. 1 uge afhængigt af prøvestørrelsen).

8. Cellesortering

  1. Afmonter cellerne ved hjælp af 500 μL trypsin-EDTA (0,05%, se materialetabel), centrifuger og resuspender pelleten med 190 μL PBS-−−.
  2. Der tilsættes 10 μL fluorescerende konjugat mod humant CD31-FITC-antistof (1:20 fortynding, se materialetabellen), og cellesuspensionen inkuberes ved 4 °C i 30 minutter.
  3. Cellerne vaskes med 10 ml PBS−−, centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og pelletten resuspenderes i 300 μL PBS−−.
  4. Isoler og saml CD31-positive (CD31+) celler ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) ved hjælp af en 100 μm dyse, og saml dem i et rør.
    1. I henhold til gating-strategien skal du først definere cellemorfologien ved hjælp af sidespredningsområdeparametrene, SSC-A og FSC-A. Vælg derefter enkeltceller ved hjælp af et punktdiagram med FSC-område/FSC-højde eller SSC-område/SSC-højde, definer de positive celler i den markerede prøve i forhold til den ikke-farvede kontrolprøve, og ret de fluorescerende celler ind i opsamlingsrøret21.
  5. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og ophæng pelleten i 2 ml vækstmedium til såning i de præcoatede brønde på en 6-brønds plade.

9. Udvidelse efter sortering

  1. To dage efter cellesortering udskiftes det konditionerede medium med frisk vækstmedium.
  2. Gentag trin 7.1 og trin 7.2 hver 2. dag for celleudvidelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HLMEC isolation
Hovedproblemet under isoleringen af HLMVEC'er er tilstedeværelsen af forurenende celler, da de mikroskopiske kapillærer ikke let kan adskilles fra det stromale væv. Derfor er det afgørende at opnå den højest mulige renhed i de tidligste stadier af isolationsprocessen for at reducere kulturpassagerne og dermed cellens aldring. Ligeledes bør en optimal isolationsprotokol give det højest mulige udbytte af rene HLMVEC'er. For at nå disse mål blev der oprettet en ny procedure baseret på tidligere beskrevne protokoller 10,11,12,14,15.

Selvom lungeparenchymen er stærkt vaskulariseret og dermed repræsenterer en fremragende kilde til HLMVEC'er, er den stort set befolket af glatte muskelceller (SMC'er), kollagenfibre og fibroblaster. Disse celler, især SMC'er, kan tilpasse sig en række forskellige kulturmedier og i næsten alle tilfælde replikere in vitro meget hurtigere end andre cellepopulationer, hvilket betyder, at de overtager den blandede cellekultur. Derfor var vores første bekymring at kalibrere den enzymatiske fordøjelse af parenchymen for at reducere overførslen af uønskede celler. Da type 2-kollagenase hurtigt løsner grupper af endotelceller fra resten af kapillærrøret, ræsonnerede vi, at fordøjelsestiden for lungeprøven kunne være afgørende for at minimere cellekontaminering. Derfor blev eksponeringstiden for kollagenase af det udskårne lungefragment som et første trin reduceret til maksimalt 10 minutter i stedet for de foreslåede 20 min15 (figur 2A). Efter denne behandling blev det observeret, at en del af celleaggregaterne, herunder SMC'erne og fibroblasterne, stadig var bundet til lange fibre (figur 2B), mens SMC'er repræsenterede størstedelen af ikke-blodcellesingleter. Små, kompakte klynger af celler, med diametre generelt ikke over 10-20 μm, blev også observeret uden elementer, der kan tilskrives fragmenter af stromalt væv (dvs. store fibre) (figur 2B). Det blev antaget, at disse småcelleaggregater hovedsagelig kunne bestå af HLMVEC'er.

Efter denne hypotese blev serielle filtreringstrin udført for at maksimere HLMVEC-gendannelsen. Til den første filtrering blev der anvendt en metalsil, og prøven blev masseret med pincet for at lette udslippet af HLMVEC'er fra kapillærerne (figur 2C, højre). Formålet med dette trin var at fjerne de store klynger af glatte muskelceller og fibroblaster, der stadig var bundet til den ekstracellulære matrix. Udstrømningen blev derefter filtreret ved hjælp af en sekvens på 70 μm og 40 μm maskestørrelsessier for at fjerne de resterende store, men ikke øjensynlige, aggregater (figur 2C, midten, venstre). For at fjerne cellesinglerne blev prøverne centrifugeret ved 30 x g i 5 minutter, en hastighed, der sedimenterer celler og aggregater med en diameter >7-10 μm, hvilket efterlader de mindre celler i suspension. Disse centrifugeringsparametre blev valgt ud fra dem, der blev rapporteret af Miron et al. til pelletering af cirkulerende blodlegemer22. Især efter denne centrifugering var supernatanten rødfarvet (figur 2D), hvilket indikerer tilstedeværelsen af mange røde blodlegemer (~ 5 μm i diameter). På dette tidspunkt blev supernatanten forsigtigt fjernet og anbragt i et andet rør. Begge glas indeholdende supernatanten og pellet blev fyldt med PBS−− og centrifugeret ved 300 x g i 5 min. Efter centrifugering viste røret indeholdende supernatanten en rød pellet beriget med blodlegemer, hvilket tyder på, at den også indeholdt de fleste af de udplantede cellesingletter (figur 2E, højre).

De opnåede pellets blev suspenderet med endotelcellevækstmediet og separat podet i to brønde af en 6-brøndplade, som var forbelagt med 1,5% gelatine fra svinehud (figur 2E, midten). Efter 3 dage blev cellerne vasket med PBS ++, fodret med frisk medium og afbildet. Som vist til venstre i figur 2E var EF-øerne mere rigelige i brønden, der indeholdt cellerne fra "rør 1" (øverst), mens brønden indeholdende cellerne fra "rør 2" (nederst) for det meste var befolket af enkelte og ikke-endotellignende celler.

Den samme procedure blev anvendt på den mindre udfordrende HPAEC-isolationsprotokol, der blev rapporteret i vores tidligere arbejde, hvor HPAEC-adskillelsen involverede udnyttelse af deres kortere vedhæftningstid sammenlignet med kontaminantceller8. På grund af deres store størrelse kan arterier let rengøres fra resterende bindevæv og fedtvæv, hvilket eliminerer en stor del af ikke-EC'er. Imidlertid var en stor del af fibroblaster og ekstracellulære matrixfibre stadig til stede i prøverne på dette stadium ud over vaskulære SMC'er8. Den nye procedure øgede yderligere den oprindelige EF-renhed under HPAEC-eksplantaterne (resultater ikke vist).

Oprensning og fænotypisk og funktionel karakterisering af nyligt isolerede HLMVEC'er
Ved afslutningen af isolationsprotokollen blev renheden af HLMVEC'erne analyseret ved flowcytometrisk påvisning af cellemembran CD31. For korrekt at identificere CD31+ cellerummet blev der sat en port på et fremadrettet scatter (FSC) / side-scatter (SSC) punktplot, og en morfologisk homogen population af celler blev identificeret. En sådan population var repræsenteret på et FSC-område/FSC-højdepunktplot, og enkeltceller blev lukket og analyseret for overfladeekspression af CD31 (hierarkisk gatingstrategi, ikke vist). I bedste fald blev ~ 70% rene HLMVEC enkeltceller (figur 3A, B) opnået. Det skal bemærkes, at HLMVEC-udbyttet blev signifikant reduceret, når prøven ikke blev behandlet umiddelbart efter operationen, eller når donoren var ældre eller ryger.

For at opnå renere HLMVEC-præparater blev CD31+-cellerne sorteret og podet i 1,5% gelatinebelagte kulturplader. De sorterede celler antog den karakteristiske endotellignende form (figur 3C), og som rapporteret i figur 3D viste konfokalmikroskopi, at næsten 100% af de FACS-rensede celler farvede positivt for EC-antigener, nemlig CD31 og den mere specifikke von Willebrand-faktor (vWF)23. Desuden, når disse celler blev podet i Matrigel, genererede de rørformede strukturer såvel som HUVEC'er (figur 3E), hvilket bekræftede deres endotelfænotype.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af proceduren. Rutediagrammet viser proceduren for endotelcelleisolering og fjernelse af ikke-endotelceller. Hvert trin opsummerer de hændelser, der er beskrevet i trin 2-6 i forsøgsprotokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Illustration af den optimerede EF-isolationsprocedure. (A) Repræsentativt billede af en lungeparenkymprøve skåret i små fragmenter før kollagenasefordøjelse (venstre) og inkuberet i et 15 ml rør indeholdende 5 ml type 2-collagenase (højre). (B) Skematisk (venstre) og faktisk (højre; forstørrelse: 100x) repræsentation af cellepopulationerne opnået efter kollagenasefordøjelse. Disse populationer omfatter singlets af ikke-EC'er og EC'er, grupper af EC'er og grupper af ikke-EC'er bundet til fibre, som fjernes ved hjælp af sil. C) Serielle filtreringer med 70 μm og 40 μm maskefiltre af metal. D) Billede af 50 ml reagensglas efter centrifugering ved lav hastighed, og før supernatanterne adskilles fra pellets i "tube 1" og "tube 2". Celleklynger er indeholdt i pelleten, mens enkeltcellerne for det meste er indeholdt i supernatanten. (E) Billede, der viser pelletens og de isolerede cellers forskellige farver og sammensætninger fra "rør 1" (øverst) og "rør 2" (nederst); Forstørrelse: 100x. Forkortelse: EC = endotelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: HLMVEC fænotypisk og funktionel karakterisering . (A) En blandet cellepopulation opnået fra en lungeparenkymeksplantning. (B) CD31-detektion ved flowcytometri på overfladen af celler i slutningen af den første passage. Den procentvise renhed (70%) henviser til den anvendte hierarkiske gating-strategi. C) Rene HLMVEC'er efter livesortering for CD31-antigenet. (D) Repræsentative immunofluorescenskonfokale mikroskopiske billeder af CD31 (venstre) og vWF (højre) positiv farvning (skalabjælke: 50 μm). (E) Brightfield-billeder blev taget 6 timer efter såning af HUVEC'er eller HLMVEC'er på Matrigel.Forstørrelse (A, C, E): 100x. Forkortelser: HLMVECs = humane lungemikrovaskulære endotelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mange roller, som vaskulære endotelceller spiller i human patofysiologi, gør disse celler til et uundværligt redskab til in vitro patogenetiske og farmakologiske undersøgelser. Da EC'er fra forskellige vaskulære steder / organer viser særlige træk og funktioner, ville tilgængeligheden af sunde og syge EC'er fra organet af interesse være ideel til forskningsformål. For eksempel er HLMVEC'er afgørende for undersøgelser af lungebetændelse; Derfor vil en metode til isolering af disse celler med højt udbytte og høj renhed gavne forskellige forskningsområder.

Metoder til isolering af HLMVEC'er er blevet rapporteret af forskellige grupper 10,11,12,14,15,17,18,19. Hver metode har introduceret innovative tilgange, såsom cellesortering med magnetiske perler 11,12,15,17,18 eller mekanisk dissociation ved hjælp af en stump kanyle 17,18. Denne protokol blev designet til at indsamle de små øer af endotelceller opnået efter kollagenasefordøjelse og anvendte sedimenteringstidsbaserede serielle centrifugeringer for at øge renheden af EC'erne i den oprindelige blandede cellepopulation. Dette punkt er afgørende, da højere startcelleantal betyder, at der er behov for et lavere antal in vitro-udvidelser for at nå det antal celler, der kræves til forsøgene, hvilket igen betyder, at flere undersøgelser kan afsluttes, før EC'erne afsår. Dette aspekt er strengt relateret til renhedsgraden af HLMVEC-isolaterne, hvilket også er relevant for at opnå pålidelige resultater. Hvis lungeprøven desuden er meget lille i størrelse, og der ikke er mulighed for at udføre EF-sortering umiddelbart efter eksplantationen, hvilket efter vores erfaring var det hyppigste scenario, vil de forurenende SMC'er vokse hurtigere end EC'erne og dermed overtage kulturen og reducere udbyttet af EC'er efter cellesortering.

I denne undersøgelse forsøgte vi at adressere disse punkter. Til dette blev det, der skete med lungeprøverne efter kollagenasefordøjelsen, oprindeligt overvåget, og signifikant forurening blev identificeret ved forskellige celletyper, især SMC'er (figur 2), som vokser hurtigt og kan overhale HLMVEC'er i blandede kulturer. Derfor blev der lagt en strategi for at minimere denne forurening umiddelbart efter fordøjelsen (figur 1 og figur 2). Bemærkelsesværdigt blev HLMVEC'er med ~ 70% renhed (figur 3A, B) konsekvent opnået i den første isolationsfase. Dette fremragende resultat lettede det efterfølgende rensningstrin ved FACS, hvilket førte til det endelige resultat af opnåelse af næsten rene, funktionelle HLMVEC'er (figur 3C-E). Lignende resultater blev opnået, når lungearteriesegmenter blev anvendt som udgangsmateriale, og HPAEC'er var de isolerede celler, hvilket betyder, at denne metode repræsenterer en forbedring af den metode, der blev rapporteret tidligere8.

Selvom denne procedure er enkel og reproducerbar, har den nøglekrav. For eksempel lykkedes det os ved HLMVEC-isolering kun at behandle lungefragmenter opnået inden for 3-6 timer fra kirurgisk excision, mens længere intervaller var forbundet med dårlige resultater (data ikke vist). Nedbrydningstiden for kollagenaseen kan også medføre variation i EF-udbyttet på grund af variationerne fra parti til parti i enzymatisk aktivitet24. Et andet kritisk punkt vedrører prøvetilstanden. Lungeparenkym afledt af rygere eller ældre donorer gav lave HLMVEC-udbytter. Desuden kan supernatanten fra lavhastighedscentrifugering indeholde nogle aggregater, der overføres til "tube 2". Af denne grund anbefales det at holde indholdet af "rør 1" og "rør 2" i kultur, i det mindste i det tidlige stadium af celleisolering. Den direkte sortering af CD31+ celler, som tidligere beskrevet i EF-isolationsprotokollerne 11,12,15,17,18, kan også være en god løsning til at øge renheden fra starten. Vi anvendte ikke dette tidlige sorteringsstadium på grund af den lille størrelse af de analyserede prøver. Denne mulighed vil dog blive afprøvet i fremtiden i forbindelse med gennemførelsen af protokollen.

En enkel og pålidelig isolationsprotokol til isolering af HLMVEC'er og HPAEC'er vil tilskynde efterforskere til at udnytte denne rute til at få celler til deres undersøgelser, især når disse celler ikke er kommercielt tilgængelige. For eksempel vil isolering af HLMEC'er fra CF-lunger muliggøre konstruktion af en fuld CF-luftvej på en chip25. Desuden vil oprettelsen af deres egen EF-samling gøre det muligt for forskerne at planlægge og gennemføre flere eksperimenter til en lavere pris.

Det kan konkluderes, at denne metode, som løser nogle kritiske punkter, der kan opstå under EF-isolering fra kirurgiske prøver, forbedrer de eksisterende metoder og dermed letter forskningen i EF-patobiologi og inflammation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra det italienske ministerium for universitet og forskning (ex 60% 2021 og 2022) til R. P. og af tilskud fra den italienske cystisk fibrosestiftelse (FFC # 23/2014) og fra det italienske sundhedsministerium (L548/93) til M. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X GIBCO 25300-054 Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59 Dako M0823 Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody Thermo Fisher Scientific MA5-14029 Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors Any Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm Corning 431750 Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm Corning 431751 Using during the first filtration
Collagenase, Type 2 Worthington LS004177 Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody BD Biosciences 555445 Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8537 Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell C-22020 HLMVEC growth medium
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895 Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A Sigma-Aldrich G2500 Used for plate coating
Type A gelatin Sigma-Aldrich g-2500 Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
  3. Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
  4. Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
  5. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
  6. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
  7. Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
  8. Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
  9. Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
  10. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
  11. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
  12. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  13. Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
  14. Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
  15. Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
  16. Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
  17. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
  18. Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
  19. Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
  20. Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  22. Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
  23. Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
  24. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  25. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 192 Endotelceller explant endotel lunger celleisolering betændelse
Mikrovaskulær og makrovaskulær endotelcelleisolering og oprensning fra lungeafledte prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plebani, R., D'Alessandro, A.,… More

Plebani, R., D'Alessandro, A., Lanuti, P., Simeone, P., Cinalli, M., Righi, I., Palleschi, A., Mucci, M., Marchisio, M., Cappabianca, F., Camera, M., Mucilli, F., Romano, M. Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples. J. Vis. Exp. (192), e64885, doi:10.3791/64885 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter