Summary
We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .
Abstract
Regeneratie van fotoreceptorcellen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen is een veelbelovende therapie voor de behandeling van zowel erfelijke als verouderende netvliesaandoeningen in een vergevorderd stadium. We hebben aangetoond dat de menselijke recombinante retina-specifieke laminine-isovormmatrix in staat is om de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) naar fotoreceptorvoorlopercellen te ondersteunen. Bovendien heeft subretinale injectie van deze cellen ook gedeeltelijk herstel aangetoond in de rd10-modellen voor knaagdieren en konijnen. Het is bekend dat subretinale injectie een gevestigde methode is die is gebruikt om farmaceutische verbindingen af te leveren aan de fotoreceptorcellen en de retinale gepigmenteerde epitheliale (RPE) laag van het oog vanwege de nabijheid van de doelruimte. Het is ook gebruikt om adeno-geassocieerde virale vectoren in de subretinale ruimte af te leveren om netvliesaandoeningen te behandelen. De subretinale afgifte van farmaceutische verbindingen en cellen in het muizenmodel is een uitdaging vanwege de beperking in de grootte van de muizenoogbol. Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor de voorbereiding van hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen voor injectie en de subretinale toedieningstechniek van deze cellen in genetische retinitis pigmentosa-mutant, rd10-muizen . Deze aanpak maakt celtherapie mogelijk op het doelgebied, met name de buitenste nucleaire laag van het netvlies, waar ziekten optreden die leiden tot degeneratie van fotoreceptoren.
Introduction
Erfelijke netvliesaandoeningen en leeftijdsgebonden maculadegeneratie leiden tot verlies van fotoreceptorcellen en uiteindelijk blindheid. De retinale fotoreceptor is de buitenste segmentlaag van het netvlies die bestaat uit gespecialiseerde cellen die verantwoordelijk zijn voor fototransductie (d.w.z. omzetting van licht in neuronale signalen). De staaf- en kegelvormige fotoreceptorcellen grenzen aan de retinale gepigmenteerde laag (RPE)1. Fotoreceptorcelvervangingstherapie om het celverlies te compenseren is een opkomende en zich ontwikkelende therapeutische benadering. Embryonale stamcellen (ESC's)2,3,4, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)-afgeleide RPE-cellen en retinale voorlopercellen (RPC's)4,5,6,7,8 werden gebruikt om de beschadigde fotoreceptorcellen te herstellen. Subretinale ruimte, een besloten ruimte tussen het netvlies en de RPE, is een aantrekkelijke locatie om deze cellen af te zetten ter vervanging van beschadigde fotoreceptorcellen, RPE en Mueller-cellen vanwege de nabijheid 9,10,11.
Gen- en celtherapieën hebben de subretinale ruimte gebruikt voor regeneratieve geneeskunde voor verschillende netvliesaandoeningen in preklinische studies. Dit omvat de levering van functionele kopieën van het gen of genbewerkingstools in de vorm van anti-sense oligonucleotidetherapie12,13 of CRISPR/Cas9 of basenbewerking via adeno-geassocieerd virus (AAV) gebaseerde strategie 14,15,16, implantatie van materialen (bijv. RPE-blad, retinale protheses 17,18,19) en gedifferentieerde stamcel-afgeleide retinale organoïden 20,21,22 voor de behandeling van netvlies- en RPE-gerelateerde ziekten. Klinische onderzoeken met hESC-RPE31 in de subretinale ruimte voor de behandeling van RPE65-geassocieerde Leber congenitale amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-gekoppelde achromatopsie25, MERTK-geassocieerde retinitis pigmentosa26, choroïderemie 27,28,29,30 zijn een effectieve aanpak gebleken. Directe injectie van cellen in de buurt van het beschadigde gebied verbetert de kans op celvestiging in het juiste gebied, synaptische integratie en uiteindelijke visuele verbetering aanzienlijk.
Hoewel subretinale injectie in menselijke modellen en modellen met grote ogen (d.w.z. varken 32,33,34,35, konijn 36,37,38,39,40 en niet-menselijke primaat 41,42,43) is vastgesteld, is een dergelijke injectie in het muizenmodel nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van de oogbolgrootte en de enorme lens die het oog van de muis bezet 44,45,46. Genetisch gemodificeerde modellen zijn echter alleen direct beschikbaar bij kleine dieren en niet bij grote dieren (d.w.z. konijnen en niet-menselijke primaten), daarom vestigt subretinale injectie bij muizen de aandacht om nieuwe therapeutische benaderingen bij genetische aandoeningen van het netvlies te onderzoeken. Er worden drie belangrijke benaderingen gebruikt om cellen of AAV's in de subretinale ruimte af te leveren, namelijk de transcorneale route, de transsclerale route en de pars plana-route (zie figuur 2). Transcornea- en transsclerale routes worden in verband gebracht met cataractvorming, synechiae, choroïdale bloedingen en reflux van de injectieplaats 11,44,45,47,48,49. We hebben de pars plana-benadering toegepast als een directe visualisatie van het injectieproces en de injectieplaats kan in realtime onder de microscoop worden bereikt.
We hebben onlangs een methode beschreven die menselijke embryonale stamcellen (hESC's) kan differentiëren tot fotoreceptorvoorlopercellen onder xenovrije, chemisch gedefinieerde omstandigheden met behulp van recombinant humaan netvlies-specifieke laminine-isovorm LN523. Aangezien LN523 aanwezig bleek te zijn in het netvlies, veronderstelden we dat de extracellulaire matrixniche van het menselijk netvlies in vitro zou kunnen worden gerecapituleerd en daardoor fotoreceptordifferentiatie van de hESC's zou kunnen ondersteunen36. Single-cell transcriptomische analyse toonde aan dat fotoreceptor-voorlopercellen die co-expressie cone-rod homeobox en recoverine tot expressie brachten, na 32 dagen werden gegenereerd. Een retinale degeneratie 10 (rd10) mutant muismodel dat autosomaal humane retinitis pigmentosa nabootst, werd gebruikt om de werkzaamheid van de dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen in vivo te evalueren. De hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen werden geïnjecteerd in de subretinale ruimte van rd10-muizen op P20, waar fotoceptordisfunctie en degeneratie aan de gang zijn36. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van de post-cryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen en levering in de subretinale ruimte van rd10-muizen . Deze methode kan ook worden gebruikt om AAV's, celsuspensies, peptiden of chemicaliën toe te dienen in de subretinale ruimte bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in vivo experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en het protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van SingHealth (IACUC) en de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek. De pups werden immuunonderdrukt van P17 (pre-transplantatie) tot P30 (post-transplantatie) door ze drinkwater te geven dat ciclosporine bevatte (260 g/L).
1. Bereiding van dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen na cryopreservatie
- Voorwarm fotoreceptordifferentiatiemedium (PRDM) in een waterbad van 37 °C.
- Haal een cryovial met dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen uit vloeibare stikstof. Bewaren op droogijs.
- Ontdooi de cryovial bij 37 °C in een waterbad gedurende 3-5 min. Resuspendeer de dag 32 cellen in 1 ml PRDM en centrifugeer op 130 x g gedurende 4 min.
- Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in 1 ml PRDM.
- Verwijder 10 μL van het mengsel om de cellen te tellen. Meng cellen met 0,2% trypan blue volgens de instructies van de fabrikant. Pipetteer het celmengsel in het glaasje van de celtelkamer. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid door middel van een geautomatiseerde celteller.
- Ga verder met de volgende stap wanneer de levensvatbaarheid van de cel hoger is dan 70%. Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 130 x g gedurende 4 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in PRDM in een concentratie van 3 x 105 cellen/μl voor transplantatie.
- Let op zichtbare celklonten. Resuspendeer de celklonten herhaaldelijk met behulp van een pipetpunt van 10 μl in het microfugebuisje totdat er geen zichtbare celklonten meer worden waargenomen. Laad in de 33G-injectiespuit om te kijken of de celoplossing door de naald wordt geëxtrudeerd.
2. Subretinale afgifte van de hESC's bij rd10-muizen
- Voorbereiding van de dieren
- Verdoof de muis (P20, man/vrouw, 3-6 g) met een combinatie van ketamine (20 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (2 mg/kg lichaamsgewicht) in een tuberculinespuit van 1 ml die via intraperitoneale benadering aan een naald van 27 G is bevestigd. Dien een subcutane injectie van buprenorfine (0,05 mg/kg) toe aan de muis als preventieve pijnstiller.
- Na toediening van de anesthesie een druppel van 1% tropicamide en 2,5% fenylefrine voor pupilverwijding. Breng een oogheelkundige gel aan op het hoornvlies om uitdroging van het oog en anesthesiegerelateerde cataract te voorkomen.
- Plaats de muis in een lege kooi totdat hij volledig verdoofd is. Beoordeel het juiste verdovingsniveau door in de voetzool te knijpen en bevestig of het dier niet reageert op de harde kneep.
- Wanneer de muis volledig verdoofd is, legt u het dier op een warm kussen van 38 °C.
- Subretinale afgifte van de cellen
- Om een 1-poorts trans-vitreale pars plana-benadering te gebruiken, zoals hier gedaan, voert u subretinale injectie uit in een steriele omgeving. Gebruik een rechtopstaande operatiemicroscoop met een direct lichtpad om de injectie uit te voeren.
- Bereid de glazen spuit van 10 μl voor door de naaldnaaf te verwijderen. Monteer de 33G stompe naald op de glazen spuit. Pak het metalen naafdeksel en zet de naald voorzichtig vast op de spuit.
- Spoel met gedestilleerd water om te controleren op tekenen van lekkage en doorgankelijkheid van de naald. Leeg de spuit en leg deze voorzichtig aan de zijkant.
- Leg de verdoofde muis op een kussen, met het behandeloog recht omhoog naar het objectief van de microscoop. Breng de 0,5% proparacaïnehydrochloride aan en wacht 30 s. Breng 150 μL oogheelkundige gel aan op het oog en plaats er een rond afdekglaasje op.
- Voer een ruw onderzoek van het oog uit door het hoornvlies, de iris, de pupil, de lens en het bindvlies te observeren. Visualiseer via de pupil de fundus van het muizenoog door het brandpuntsvlak aan te passen. Pas het hoofd aan totdat het optische hoofd zich in het midden van de pupil bevindt en minimaliseer de beweging van het hoofd door het op de juiste manier op het kussen te plaatsen.
- Tik meerdere keren zachtjes met de hESC's op de basis van de buis om een uniforme celsuspensie te krijgen. Met behulp van de 10 μL glazen microliterspuit met een 33G stompe naald, zuigt u 2 μL cellen/media op. Trek de cellen vlak voor de injectie op om celzetting/klontering in de spuit te voorkomen.
- Maak met een wegwerpnaald van 30 G een sclerectomiewond 2 mm achter de limbus. Houd de hoek van de naald op ~45° om te voorkomen dat u de lens aanraakt. Zodra de punt van de naald in het oog is gevisualiseerd, trekt u de naald voorzichtig terug. Gooi de naald na gebruik weg in de scherpe bak om prikletsel door de naald te voorkomen.
- Neem de glazen spuit en steek de stompe naald in de sclerectomiewond. Zonder de lens aan te raken, beweegt u de stompe naald naar voren totdat deze het tegenoverliggende netvlies van de ingangswond bereikt. Zorg ervoor dat het injectiegebied vrij is van grote bloedvaten in het netvlies om bloedingen te voorkomen.
- Penetreer voorzichtig het netvlies totdat een druktak op de sclera wordt gezien. Houd het stompe uiteinde van de naald evenwijdig aan de sclera om lekken van de cellen in de glasachtige ruimte te voorkomen.
- Injecteer langzaam 2 μl celsuspensie of PRDM-media (controle) in de subretinale ruimte terwijl de injectiespuit zachtjes wordt aangedrukt. Bij een succesvolle injectie moet op de injectieplaats een zichtbare bleb (d.w.z. een verhoogd netvlies met de celsuspensie/media erin) worden gevormd.
OPMERKING: Tijdens de injectie mag slechts lichte druk worden uitgeoefend om scheuren in het netvlies en verstopping van de cellen aan de punt van de naald te voorkomen. - Wacht na het bevestigen van de bleb 10 seconden om de cellen tot rust te laten komen. Trek de naald voorzichtig terug uit het oog.
- Intraoperatieve optische coherentietomografie (OCT) scannen van de bleb (optioneel)
- Positioneer het muizenoog om de vlek onder de microscoop te visualiseren door het hoofd langzaam te bewegen. Zet de positie vast door het hoofd voorzichtig vast te houden. Er is geen extra pupilverwijding nodig. Verwijder het afdekglaasje en de gel niet op het oog. Het geeft een duidelijk optisch medium om de bleb te visualiseren.
- Voer de intra-operatieve OCT uit met behulp van de ingebouwde iOCT-functie van de operatiemicroscoop.
- Druk op de Kubus optie op het OCT-scherm en plaats het scangebied op de bleb door op de pijltoetsen te drukken. Pas de OCT aan door Centrering en Focus te verschuiven voor de beste OCT-kwaliteit. Druk op Capture/Scan om de OCT-scan van het bliepgebied te verkrijgen. Bekijk de afbeeldingen om de kwaliteit van de scans te controleren.
- Terugwinning
- Verwijder het afdekglaasje en reinig de gel van het oog met gaasje. Breng na de injectie één keer antibiotische zalf aan om infectie te voorkomen.
- Laat het dier herstellen van de anesthesie onder een warm licht totdat het weer voldoende bij bewustzijn is om de sternale lighouding te behouden en terug te keren naar de thuiskooi. Controleer het dier ten minste 3 dagen na de injectie op tekenen van ontsteking, infectie en angst.
NOTITIE: Het warme licht van 150 W moet ten minste 30 cm van de dierenkooi verwijderd zijn en voorzichtigheid is geboden om brandwonden te voorkomen. - Dien een subcutane injectie met buprenorfine (0,05 mg/kg) 8 uur toe gedurende 1 dag of volgens de aanbeveling van de dierenarts. Als een ontsteking of infectie van het oog wordt waargenomen, raadpleeg dan een dierenarts voor een passende behandeling.
- Reiniging en sterilisatie van de instrumenten
- Spoel de 10 μL glazen microliter spuit en de 33G stompe naald 10x door met 100% ethanol. Spoel de ethanol weg door de spuit met gedestilleerd water te laten knipperen.
- Demonteer de glazen spuit en de naald. Droog de spuit af om deze te bewaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De glazen spuit van 10 μl is geassembleerd volgens de instructies van de fabrikant (afbeelding 1) en de stompe naald die wordt gebruikt om de celsuspensie/media toe te dienen, is weergegeven in afbeelding 1B. Verschillende benaderingen voor subretinale injectie worden geïllustreerd in figuur 2. In dit protocol beschrijven we de pars plana-benadering (Figuur 2C). De stompe naald die op een glazen spuit was gemonteerd, werd door een sclerotomiewond ingebracht en kreeg toegang tot de subretinale ruimte over de hele wereld. Zoals te zien is in figuur 3A, werden de baan van de naald, de penetratie door het netvlies en de afgifte van de cellen direct onder de microscoop gevolgd tijdens het uitvoeren van de injectie. De succesvolle toediening van de cellen/media werd bevestigd door het waarnemen van een bleb op de injectieplaats (Figuur 3B). Een succesvolle bleb kan worden geïdentificeerd als een lichte, witachtige kleur die lijkt op een waterballon. Een mislukte bevalling wordt waargenomen door lekkage van de cellen/media in de glasachtige ruimte op de injectieplaats en het niet vormen van een bleb. De OCT-scan werd uitgevoerd op het geïnjecteerde gebied en de scan toonde zwevende geïndividualiseerde hESC's in het met cellen behandelde oog (Figuur 4A), terwijl het met media behandelde oog heldere vloeistof zonder cellen in de subretinale ruimte liet zien (Figuur 4B). De geïndividualiseerde hESC's worden geïdentificeerd als hyperreflecterende materialen die in de subretinale ruimte zijn verspreid (Figuur 4A). Het slagingspercentage van de injectie werd berekend door het aantal ogen met succesvolle vorming van de bleb te noteren. We hebben de toepassingen die deze aanpak hebben toegepast in ons laboratorium en het slagingspercentage van de injecties opgenomen (tabel 1).
Figuur 1: Instrumenten die tijdens de injectie worden gebruikt. (A) De glazen spuit van 10 μL wordt gemonteerd met een stompe naald van 33G. (B) Inzoomfoto van de 33G stompe naald. (C) Kussen voor de kop van het dier om op te rusten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verschillende routes van subretinale injectie. (A) Transcorneale route: De injectienaald gaat door het hoornvlies en de pupil om de subretinale ruimte binnen te gaan. (B) Transsclerale route: De subretinale ruimte is rechtstreeks toegankelijk via de sclera. (C) Pars plana-route: De injectienaald wordt via een incisie in de limbus in het glasvocht ingebracht. De naald bereikt de subretinale ruimte door het netvlies binnen te dringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fundusbeelden van het oog tijdens de subretinale injectie. (A) Voordat de subretinale injectie werd uitgevoerd, was de punt van de naald te zien in het glasvocht dat het netvlies raakte, waarbij de grote bloedvaten van het netvlies werden vermeden. (B) Na de subretinale injectie werd een zichtbare vlek gevormd op de injectieplaats (gele stippellijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Intraoperatieve OCT-scans van de geïnjecteerde ogen. De scans werden direct na de injectie gemaakt. (A) met hESC's behandelde oog: het bovenste paneel toonde de locatie van de OCT-scan (cyaan en roze dwarsdoorsnedelijnen) op het oog; hESC's werden waargenomen in het behandelde oog in de subretinale ruimte (gele stippellijn, midden- en onderpanelen). (B) Met media behandeld oog: het bovenste paneel toonde de locatie van de OCT-scan (cyaan en roze dwarsdoorsnedelijnen) op het oog; Heldere vloeistof zonder cellen werd waargenomen in de subretinale ruimte in het media-geïnjecteerde oog (gele stippellijn, midden- en onderpanelen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Toepassingen | Belasting van de ontvanger | Slagingspercentage |
| AAV | Rpe65td12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6 | 95% |
| hESC-afgeleide voorlopercellen | Rd10-/- | 95% |
Tabel 1: Het slagingspercentage van subretinale injectie in verschillende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De subretinale injectie is gebruikt voor celsuspensietransplantatie voor de behandeling van RPE en netvliesaandoeningen 23,25,26,27,28,31,40. Deze aanpak is zeer essentieel in knaagdierstudies, niet alleen voor celtransplantatie en gentherapiebenaderingen, maar ook om nieuwe therapeutische verbindingen voor netvliesaandoeningen te evalueren. Momenteel worden drie belangrijke routes gebruikt om cellen of AAV's in de subretinale ruimte af te leveren, namelijk transcorneale route, transsclerale en pars plana-routes.
Bij de transcorneale benadering gaat de injectienaald door het hoornvlies, de pupil en ten slotte het netvlies om de cellen in de subretinale ruimte af te leveren en een succesvolle bleb te vormen. Het voordeel van de transcorneale benadering is de mogelijkheid om een volledige netvliesloslating bij de ontvanger te creëren47. Het kan een groter aantal cellen leveren; Longitudinale observatie om structurele conformatie en celintegratie te bestuderen is echter een uitdaging in deze benadering. Bovendien zijn complicaties onder meer cataractvorming, synechiae en vertroebeling van het hoornvlies, waardoor de longitudinale waarnemingen 11,45,47,48 uitdagend zijn. Als alternatief wordt de trans-sclerale benadering ook gebruikt om AAV toe te dienen aan de subretinale ruimte44,49. Deze aanpak is nuttig voor neonatale muizen en wordt als veiliger beschouwd omdat de naald niet door de oculaire media hoeft te gaan. Choroïdale bloedingen, terugvloeiing van de oplossing van de injectieplaats, perforatie van het netvlies en lekkage in het glasvocht mogen echter niet worden genegeerd.
We hebben de pars plana-benadering toegepast om de hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen in de subretinale ruimte te introduceren met behulp van een 33G stompe naald. Bij deze benadering werd de injectienaald ingebracht via de incisie in het limbusgebied. De naald werd vervolgens door de glasvochtholte geleid en bereikte uiteindelijk de subretinale ruimte via het netvlies. Celklonten werden vaak waargenomen en kunnen de afgifte van cellen blokkeren bij gebruik van ongeschikte naalddiktes. Resuspensie van cellen in het microfugebuisje moet zorgvuldig worden uitgevoerd met behulp van een pipetpunt van 10 μl voordat deze in de injectiespuit wordt geplaatst. We probeerden in eerste instantie een 34G-naald te gebruiken, waarbij vaak de verstopping van de naald door de cellen werd waargenomen. Een geschikte grootte van de naald moet worden getest voor specifieke celtypen, vooral naalden met een smalle diameter hebben de neiging om minder levensvatbare cellen te geven wanneer ze50 worden geïnjecteerd. Een van de voordelen van deze aanpak is directe visualisatie tijdens de injectie, waardoor de chirurg de specifieke locatie voor celafgifte kan controleren en zorgvuldig kan selecteren. Het injectiegebied en de naald moeten tijdens de procedure duidelijk zichtbaar zijn. Door anesthesie geïnduceerde cataract en troebelheid van het hoornvlies kunnen de juiste afgifte van cellen op een specifieke locatie sterk beïnvloeden.
Tijdens het uitvoeren van de injectie moet de naald loodrecht in het netvlies dringen en moet het stompe uiteinde van de naald evenwijdig aan de sclera zijn om het lekken van de geïnjecteerde cellen in de glasvochtruimte te minimaliseren (Figuur 3). Er mag slechts lichte druk op de spuit worden uitgeoefend wanneer de injectie wordt uitgevoerd. Een sterke druk kan leiden tot netvliesscheuren, bloedingen, lekkage van de cellen in de choroïdale ruimte, het niet passeren van de naald door de naald en het doorboren van de oogbol. De optimale druk kan worden gegarandeerd wanneer de naaldpunt net door het netvlies is gegaan en er een kleine witte drukstip te zien is aan de naaldpunt. Na de injectie moet de naald langzaam en voorzichtig van de injectieplaats worden teruggetrokken om lekkage van geïnjecteerde cellen in de glasvochtruimte te voorkomen.
De beperking van deze aanpak is de uitdagende leercurve. Een studie toonde aan dat een getrainde oogarts 364 injecties bij muizen moest uitvoeren om een slagingspercentage van 95% te bereiken, terwijl van minder ervaren stagiairs met chirurgische ervaring werd verwacht dat ze een hoger aantal trainingen nodig hadden46. Complicaties van deze aanpak zijn onder meer naaldspoor in het netvlies, terugvloeiing van cellen in het glasvocht, bloeding uit het vaatvlies/netvlies en iatrogene cataract. Met voldoende training worden deze complicaties echter aanzienlijk minder waargenomen46.
Concluderend kan onze methode de hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen afleveren in de subretinale ruimte van rd10-muizen , zoals duidelijk blijkt uit de OCT-scans. Deze benadering kan worden toegepast om nieuwe therapeutische verbindingen, transplantatie van verschillende celtypen en gentherapie voor de behandeling van uiterlijke netvlies- en RPE-gerelateerde ziekten te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay is mede-oprichter van Alder Therapeutics AB. Andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We danken Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee en Yingying Chung voor het verlenen van technische assistentie voor de voorbereiding van de dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopers na cryopreservatie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) en National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) aan HGT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
