Summary
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för framställning av post-kryokonserverade hESC-härledda fotoreceptorprogenitorceller och subretinal leverans av dessa celler i rd10-möss .
Abstract
Regenerering av fotoreceptorceller med hjälp av humana pluripotenta stamceller är en lovande terapi för behandling av både ärftliga och åldrande näthinnesjukdomar i avancerade stadier. Vi har visat att human rekombinant retina-specifik lamininisoformmatris kan stödja differentieringen av humana embryonala stamceller (hESC) till fotoreceptorprogenitorer. Dessutom har subretinal injektion av dessa celler också visat partiell återställning i rd10-gnagar - och kaninmodellerna. Subretinal injektion är känd för att vara en etablerad metod som har använts för att leverera farmaceutiska föreningar till fotoreceptorcellerna och retinal pigmenterad epitel (RPE) i ögat på grund av dess närhet till målutrymmet. Det har också använts för att leverera adeno-associerade virala vektorer till det subretinala utrymmet för att behandla näthinnesjukdomar. Den subretinala leveransen av farmaceutiska föreningar och celler i den murina modellen är utmanande på grund av begränsningen i storleken på den murina ögongloben. Detta protokoll beskriver den detaljerade proceduren för beredning av hESC-härledda fotoreceptorstamceller för injektion och subretinal leveransteknik för dessa celler i genetisk retinitis pigmentosa-mutant, rd10-möss . Detta tillvägagångssätt möjliggör cellterapi till målområdet, i synnerhet det yttre kärnskiktet i näthinnan, där sjukdomar som leder till fotoreceptordegeneration uppstår.
Introduction
Ärftliga näthinnesjukdomar och åldersrelaterad makuladegeneration leder till förlust av fotoreceptorceller och slutligen blindhet. Den retinala fotoreceptorn är det yttre segmentskiktet av näthinnan som består av specialiserade celler som ansvarar för fototransduktion (dvs. omvandling av ljus till neuronala signaler). Stav- och tappfotoreceptorcellerna ligger intill det retinala pigmenterade skiktet (RPE)1. Ersättningsterapi med fotoreceptorceller för att kompensera cellförlusten har varit ett framväxande och utvecklande terapeutiskt tillvägagångssätt. Embryonala stamceller (ESC)2,3,4, inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)-härledda RPE-celler och retinala stamceller (RPC)4,5,6,7,8 användes för att återställa de skadade fotoreceptorcellerna. Subretinalt utrymme, ett begränsat utrymme mellan näthinnan och RPE, är en attraktiv plats för att deponera dessa celler för att ersätta skadade fotoreceptorceller, RPE och Mueller-celler på grund av dess närhet 9,10,11.
Gen- och cellterapier har utnyttjat det subretinala utrymmet för regenerativ medicin för olika näthinnesjukdomar i prekliniska studier. Detta inkluderar leverans av funktionella kopior av gen- eller genredigeringsverktygen i form av antingen antisensoligonukleotidterapi12,13 eller CRISPR/Cas9 eller basredigering via adenoassocierat virus (AAV) baserad strategi 14,15,16, implantation av material (t.ex. RPE-ark, näthinneproteser 17,18,19) och differentierade stamcellsderiverade retinala organoider 20,21,22 för att behandla näthinne- och RPE-relaterade sjukdomar. Kliniska prövningar med hESC-RPE31 i subretinalt utrymme för att behandla RPE65-associerad Leber kongenital amauros (LCA)23,24, CNGA3-kopplad akromatopsi25, MERTK-associerad retinitis pigmentosa26, choroiderema 27,28,29,30 har visat sig vara ett effektivt tillvägagångssätt. Direkt injektion av celler i närheten av det skadade området förbättrar avsevärt chansen för cellsättning i lämplig region, synaptisk integration och eventuell visuell förbättring.
Även om subretinal injektion i mänskliga och storögda modeller (dvs. gris 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 och icke-mänsklig primat 41,42,43) har fastställts, är sådan injektion i den murina modellen fortfarande utmanande på grund av begränsningen av ögonglobens storlek och enorma lins som upptar musögat 44,45,46. Genetiskt modifierade modeller är dock endast lätt tillgängliga hos små djur och inte hos stora djur (dvs. kaniner och icke-mänskliga primater), därför uppmärksammar subretinal injektion i möss att undersöka nya terapeutiska metoder vid retinala genetiska sjukdomar. Tre huvudsakliga tillvägagångssätt används för att leverera celler eller AAV till det subretinala utrymmet, nämligen transhornhinnan, transskleral väg och pars plana-vägen (se figur 2). Hornhinne- och transsklerala vägar är förknippade med kataraktbildning, synechier, koroidal blödning och reflux från injektionsstället 11,44,45,47,48,49. Vi antog pars plana-metoden som en direkt visualisering av injektionsprocessen, och injektionsstället kan uppnås i realtid under mikroskopet.
Vi beskrev nyligen en metod som kan differentiera humana embryonala stamceller (hESC) till fotoreceptorprogenitorer under xenofria, kemiskt definierade förhållanden med hjälp av rekombinant human retina-specifik lamininisoform LN523. Eftersom LN523 visade sig finnas i näthinnan, antog vi att den extracellulära matrixnischen i den mänskliga näthinnan kunde rekapituleras in vitro och därmed stödja fotoreceptordifferentiering från hESCs36. Transkriptomisk analys av enskilda celler visade att fotoreceptorprogenitorer som samuttrycker kon-stav, homeobox och recoverin genererades efter 32 dagar. En retinal degeneration 10 (rd10) mutant musmodell som efterliknar autosomal human retinitis pigmentosa användes för att utvärdera effekten av dag 32 hESC-härledda fotoreceptorstamceller in vivo. De hESC-härledda fotoreceptorstamcellerna injicerades i det subretinala utrymmet hos rd10-möss vid P20, där fotoceptordysfunktion och degeneration pågår36. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av de post-kryokonserverade hESC-härledda fotoreceptorprogenitorerna och leverans till det subretinala utrymmet hos rd10-möss . Denna metod kan också användas för att administrera AAV, cellsuspensioner, peptider eller kemikalier i det subretinala utrymmet hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-experimenten utfördes i enlighet med de riktlinjer och protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) och Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the use of animals in Ophthalmic and Vision Research. Ungarna immunsupprimerades från P17 (före transplantation) till P30 (efter transplantation) genom att ge dem dricksvatten innehållande ciklosporin (260 g/l).
1. Beredning av dag 32 hESC-härledda fotoreceptorprogenitorer efter kryokonservering
- Förvärmt fotoreceptordifferentieringsmedium (PRDM) i ett 37 °C vattenbad.
- Hämta en kryovial innehållande dag 32 hESC-härledda fotoreceptorprogenitorceller från flytande kväve. Förvaras på torris.
- Tina kryovialen vid 37 °C i ett vattenbad i 3-5 min. Återsuspendera de 32 cellerna i 1 ml PRDM och centrifugera vid 130 x g i 4 minuter.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml PRDM.
- Avlägsna 10 μl av blandningen för cellräkning. Blanda cellerna med 0,2 % trypanblått enligt tillverkarens instruktioner. Pipettera cellblandningen i cellräkningskammarens objektglas. Bestäm cellantal och livskraft med automatiserad cellräknare.
- Gå vidare till nästa steg när cellens livskraft är över 70 %. Centrifugera den återstående cellsuspensionen vid 130 x g i 4 minuter. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i PRDM med en koncentration av 3 x 105 celler/μl för transplantation.
- Observera för synliga cellklumpar. Återsuspendera cellklumpar upprepade gånger med en 10 μL pipettspets i mikrofugeröret tills ingen synlig cellklump observeras. Ladda i 33G injektionssprutan för att observera extrudering av celllösning genom nålen.
2. Subretinal tillförsel av hESC hos rd10-möss
- Förberedelse av djuren
- Bedöva musen (P20, hane/hona, 3-6 g) med en kombination av ketamin (20 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (2 mg/kg kroppsvikt) i en 1 ml tuberkulinspruta fäst på en 27G nål intraperitonealt. Administrera en subkutan injektion av buprenorfin (0,05 mg/kg) till musen som ett förebyggande smärtstillande medel.
- Efter administrering av anestesin, ingjut en droppe vardera av 1 % tropicamid och 2,5 % fenylefrin för pupillutvidgning. Applicera en oftalmisk gel på hornhinnan för att förhindra att ögat blir torrt och narkosrelaterad grå starr.
- Placera musen i en tom bur tills den är helt bedövad. Bedöm rätt anestesinivå genom att nypa ihop trampdynan och bekräfta om djuret inte reagerar på den hårda nypan.
- När musen är helt sövd, placera djuret på en varm dyna inställd på 38 °C.
- Subretinal leverans av cellerna
- För att använda en 1-portars transvitreal pars plana-metod, som görs här, utför subretinal injektion i en steril miljö. Använd ett upprätt operationsmikroskop med en direkt ljusbana för att utföra injektionen.
- Förbered 10 μL glassprutan genom att ta bort nålnavet. Montera den trubbiga 33G-nålen på glassprutan. Ta navskyddet av metall och fäst försiktigt nålen på sprutan.
- Spola med destillerat vatten för att kontrollera om det finns tecken på läckage och nålens genomskinlighet. Töm sprutan och lägg den försiktigt vid sidan.
- Placera den sövda musen på en kudde, med behandlingsögat rakt upp mot mikroskopets objektiv. Applicera 0.5% proparakainhydroklorid och vänta i 30 s. Applicera 150 μL ögongel på ögat och placera ett runt täckglas på det.
- Utför en grov undersökning av ögat genom att observera hornhinnan, iris, pupill, lins och bindhinnan. Visualisera musögats fundus genom pupillen genom att justera fokalplanet. Justera huvudet tills det optiska huvudet är placerat i mitten av pupillen och minimera huvudets rörelse genom korrekt placering på kudden.
- Knacka försiktigt på rörets bas med hESC flera gånger för att få en enhetlig cellsuspension. Genom att använda en 10 μL mikrolitersspruta av glas med en 33 G trubbig nål drar du upp 2 μL celler/media. Dra ut cellerna precis före injektionen för att undvika att cellerna sätter sig/klumpar ihop sig i sprutan.
- Använd en 30G engångsnål och gör ett sklerektomisår 2 mm bakom limbus. Håll nålens vinkel på ~45° för att undvika att vidröra linsen. När nålspetsen har visualiserats i ögat, dra försiktigt ut nålen. Kasta nålen i den vassa behållaren efter användning för att undvika nålsticksskador.
- Ta glassprutan och stick in den trubbiga nålen i sklerektomisåret. Utan att vidröra linsen, för fram den trubbiga nålen tills den når den motsatta näthinnan på ingångssåret. Se till att injektionsområdet är fritt från större blodkärl i näthinnan för att undvika blödning.
- Penetrera försiktigt näthinnan tills en tryckgren på sklera syns. Håll den trubbiga änden av nålen parallell med sklera för att undvika att cellerna läcker in i glaskroppen.
- Injicera långsamt 2 μl cellsuspension eller PRDM-media (kontroll) i subretinalutrymmet medan ett lätt tryck bibehålls på sprutan. Vid en lyckad injektion ska en synlig bleb (d.v.s. en upphöjd näthinna med cellsuspensionen/mediet i) bildas vid injektionsstället.
OBS: Endast ett lätt tryck ska användas under injektionen för att undvika att näthinnan slits sönder och cellerna blockeras vid nålspetsen. - Efter att ha bekräftat bleb, vänta i 10 s för att låta cellerna lugna ner sig. Dra försiktigt ut nålen ur ögat.
- Intraoperativ optisk koherenstomografi (OCT) skanning av bleb (valfritt)
- Placera musögat för att visualisera blebben under mikroskopet genom att långsamt flytta huvudet. Säkra positionen genom att försiktigt hålla i huvudet. Ingen ytterligare pupillvidgning är nödvändig. Ta inte bort täckglaset och gelen på ögat. Det ger ett tydligt optiskt media för att visualisera bleb.
- Utför den intraoperativa OCT med hjälp av den inbyggda iOCT-funktionen i operationsmikroskopet.
- Tryck på alternativet Cube på OCT-skärmen och placera skanningsområdet på blebben genom att trycka på pilknapparna . Justera OCT genom att skjuta centrering och fokus för bästa OCT-kvalitet. Tryck på Capture/Scan för att få OCT-skanningen av bleb-området. Granska bilderna för att kontrollera kvaliteten på skanningarna.
- Återhämtning
- Ta bort täckglaset och rengör gelen från ögat med gasbinda. Applicera antibiotikasalva en gång efter injektionen för att förhindra infektion.
- Låt djuret återhämta sig från narkos under ett varmt ljus tills det återfår tillräckligt med medvetande för att behålla sternal liggande och återvända till hemburen. Övervaka djuret i minst 3 dagar efter injektionen för tecken på inflammation, infektion och ångest.
OBS: Det varma ljuset på 150 W bör vara minst 30 cm från djurburen, och försiktighet bör iakttas för att undvika brännskador. - Administrera en subkutan injektion av buprenorfin (0,05 mg/kg) 8 gånger i timmen i 1 dag eller enligt veterinärens rekommendation. Om inflammation eller infektion i ögat observeras, kontakta en veterinär för lämplig behandling.
- Rengöring och sterilisering av instrumenten
- Spola 10 μL mikroliterssprutan av glas och den trubbiga nålen 33G med 100 % etanol 10 gånger. Skölj bort etanolen genom att blinka sprutan med destillerat vatten.
- Ta isär glassprutan och nålen. Torka sprutan för förvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glassprutan på 10 μl monterades enligt tillverkarens anvisningar (figur 1) och den trubbiga nål som användes för att mata cellsuspensionen/mediet visas i figur 1B. Olika tillvägagångssätt för subretinal injektion illustreras i figur 2. Vi beskriver pars plana-metoden i detta protokoll (figur 2C). Den trubbiga nålen monterad på en glasspruta fördes in genom ett sklerotomisår och kom åt det subretinala utrymmet över hela världen. Som visas i figur 3A övervakades nålens bana, penetration genom näthinnan och cellernas leverans direkt under mikroskopet när injektionen utfördes. Lyckad leverans av celler/media bekräftades genom observation av en bleb vid injektionsstället (Figur 3B). En lyckad bleb kan identifieras som en ljus vitaktig färg som liknar en vattenballong. En misslyckad tillförsel observeras genom läckage av cellerna/mediet till glaskroppen vid injektionsstället och misslyckande med att bilda en bleb. OCT-skanningen utfördes på det injicerade området, och skanningen visade flytande individualiserade hESCs i det cellbehandlade ögat (Figur 4A), medan det mediebehandlade ögat visade klar vätska utan celler i det subretinala utrymmet (Figur 4B). De individualiserade hESC:erna identifieras som hyperreflekterande material fördelade i det subretinala utrymmet (Figur 4A). Framgångsfrekvensen för injektionen beräknades genom att notera antalet ögon med framgångsrik bildning av bleb. Vi inkluderade de applikationer som antog detta tillvägagångssätt i vårt laboratorium och framgångsfrekvensen för injektionerna (tabell 1).
Figur 1: Instrument som används under injektionen. (A) Glassprutan på 10 μL är monterad med en trubbig nål på 33 G. (B) Zoom-in-bild av den trubbiga 33G-nålen. (C) Kudde för djurets huvud att vila på. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Olika injektionsvägar under näthinnan. A) Tillförsel via hornhinnan: Injektionsnålen passerar genom hornhinnan och pupillen för att komma in i det subretinala utrymmet. B) Transskleral väg: Det subretinala utrymmet nås direkt genom skleran. C) Pars plana-väg: Injektionsnålen förs in i glaskroppen via ett snitt i limbus. Nålen når det subretinala utrymmet genom att tränga in i näthinnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ögonbottenbilder av ögat under den subretinala injektionen. (A) Innan den subretinala injektionen utfördes kunde nålspetsen ses i glaskroppen som vidrörde näthinnan, vilket undvek de större näthinneblodkärlen. (B) Efter subretinal injektion bildades en synlig bleb vid injektionsstället (gul streckad linje). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Intraoperativa OCT-undersökningar av de injicerade ögonen. Skanningarna gjordes omedelbart efter injektionen. A) hESC-behandlat öga: Den övre panelen visade OCT-skanningens läge (cyan och rosa tvärsnittslinjer) på ögat. hESC observerades i det behandlade ögat i det subretinala utrymmet (gul prickad linje, mitt- och bottenpaneler). B) Mediebehandlat öga: Den övre panelen visade OCT-skanningens läge (cyan och rosa tvärsnittslinjer) på ögat. Klar vätska utan celler observerades i det subretinala utrymmet i det mediainjicerade ögat (gul prickad linje, mitt- och bottenpaneler). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Program | Mottagarens stam | Framgång |
| AAV | Rpe65rd12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6 | 95% |
| hESC-härledda stamceller | Rd10-/- | 95% |
Tabell 1: Framgångsfrekvensen för subretinal injektion i olika applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den subretinala injektionen har använts för cellsuspensionstransplantation för att behandla RPE och näthinnesjukdomar 23,25,26,27,28,31,40. Detta tillvägagångssätt är mycket viktigt i gnagarstudier, inte bara för celltransplantation och genterapi, utan också för att utvärdera nya terapeutiska föreningar för näthinnesjukdomar. För närvarande används tre huvudvägar för att leverera celler eller AAV:er till det subretinala utrymmet, dvs transhornhinnevägen, transskleral och pars plana-rutter.
I den transhornhinnemetoden passerar injektionsnålen genom hornhinnan, pupillen och slutligen näthinnan för att leverera cellerna in i det subretinala utrymmet och bilda en framgångsrik bleb. Fördelen med den transhornhinnemetoden är förmågan att skapa en fullständig näthinneavlossning hos mottagaren47. Det kan leverera ett större antal celler; Longitudinell observation för att studera strukturell konformation och cellintegration är dock utmanande i detta tillvägagångssätt. Dessutom inkluderar komplikationer gråstarrbildning, synechier och hornhinnegrumling, vilket gör de longitudinella observationerna utmanande 11,45,47,48. Alternativt används den transsklerala metoden också för att leverera AAV till det subretinala utrymmet44,49. Detta tillvägagångssätt är användbart för neonatala möss och anses vara säkrare eftersom det inte är nödvändigt för nålen att gå genom det okulära mediet. Koroidal blödning, återflöde av lösningen från injektionsstället, perforering av näthinnan och läckage in i glaskroppen bör dock inte ignoreras.
Vi antog pars plana-metoden för att introducera de hESC-härledda fotoreceptorerna i det subretinala utrymmet med hjälp av en 33G trubbig nål. I detta tillvägagångssätt fördes injektionsnålen in via snittet i limbusområdet. Nålen fördes sedan genom glaskroppen och kom slutligen åt det subretinala utrymmet genom näthinnan. Cellklumpar observerades ofta och kan blockera cellernas leverans vid användning av olämpliga nålstorlekar. Omblandning av cellerna i mikrofugeröret bör utföras omsorgsfullt med en 10 μL pipettspets innan den laddas i injektionssprutan. Till en början försökte vi använda en 34G-nål, där cellernas blockering av nålen ofta observerades. En lämplig storlek på nålen bör testas för specifika celltyper, särskilt smalborrade nålar tenderar att ge mindre livskraftiga celler när de injiceras50. En av fördelarna med detta tillvägagångssätt är direkt visualisering under injektionen, vilket gör det möjligt för kirurgen att övervaka och noggrant välja den specifika platsen för cellleverans. Injektionsområdet och nålen ska vara väl synliga under ingreppet. Anestesiinducerad grå starr och hornhinnegrumling kan i hög grad påverka korrekt leverans av celler till en specifik plats.
När injektionen utförs ska nålen penetrera näthinnan vinkelrätt, och den trubbiga änden av nålen ska vara parallell med sklera för att minimera läckaget av de injicerade cellerna in i glaskroppen (figur 3). Endast ett lätt tryck ska appliceras på sprutan när injektionen utförs. Ett starkt tryck kan leda till näthinnetårar, blödningar, läckage av cellerna in i det koroidala utrymmet, att cellerna inte kan passera genom nålen och punktering av ögongloben. Det optimala trycket kan säkerställas när nålspetsen precis passerat genom näthinnan, och en liten vit tryckprick syns vid nålspetsen. Efter injektionen ska nålen dras tillbaka långsamt och försiktigt från injektionsstället för att förhindra läckage av injicerade celler in i glaskroppen.
Begränsningen med detta tillvägagångssätt är den utmanande inlärningskurvan. En studie visade att en utbildad ögonläkare behövde utföra 364 injektioner på möss för att uppnå 95 % framgång, medan mindre erfarna praktikanter med kirurgisk erfarenhet förväntades kräva ett högre antal utbildningar46. Komplikationer av detta tillvägagångssätt inkluderar nålspår i näthinnan, återflöde av celler i glaskroppen, blödning från åderhinnan/näthinnan och iatrogen grå starr. Men med en tillräcklig mängd träning observeras dessa komplikationer betydligt mindre46.
Sammanfattningsvis kan vår metod leverera de hESC-härledda fotoreceptorerna till det subretinala utrymmet hos rd10-möss , vilket tydligt visas av OCT-skanningarna. Detta tillvägagångssätt kan användas för att utforska nya terapeutiska föreningar, transplantation av olika celltyper och genterapi för behandling av yttre näthinnan och RPE-relaterade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay är en av grundarna av Alder Therapeutics AB. Övriga författare uppger att det inte finns några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee och Yingying Chung för att ha tillhandahållit tekniskt stöd för beredningen av dag 32 hESC-härledda fotoreceptorprogenitorer efter kryokonservering. Detta arbete stöddes delvis av anslag från National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) och National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) till H.G.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
