Summary
Vi beskriver en detaljert protokoll for fremstilling av postkryopreserverte hESC-avledede fotoreceptor-stamceller og subretinal levering av disse cellene i rd10-mus .
Abstract
Regenerering av fotoreceptorceller ved bruk av humane pluripotente stamceller er en lovende terapi for behandling av både arvelige og aldrende retinale sykdommer i avanserte stadier. Vi har vist at human rekombinant retina-spesifikk lamininisoformmatrise er i stand til å støtte differensiering av humane embryonale stamceller (hESCs) til fotoreceptorprogenitorer. I tillegg har subretinal injeksjon av disse cellene også vist delvis restaurering i rd10 gnager- og kaninmodellene. Sub-retinal injeksjon er kjent for å være en etablert metode som har blitt brukt til å levere farmasøytiske forbindelser til fotoreceptorcellene og retinalpigmentert epitel (RPE) lag av øyet på grunn av sin nærhet til målrommet. Det har også blitt brukt til å levere adeno-assosierte virale vektorer inn i sub-retinal plass for å behandle retinal sykdommer. Subretinal tilførsel av farmasøytiske forbindelser og celler i murine modellen er utfordrende på grunn av begrensningen i størrelsen på murine eyeball. Denne protokollen beskriver den detaljerte prosedyren for fremstilling av hESC-avledede fotoreceptorstamceller til injeksjon og subretinal leveringsteknikk for disse cellene i genetisk retinitis pigmentosa mutant, rd10 mus. Denne tilnærmingen tillater celleterapi til det målrettede området, spesielt det ytre nukleære laget av netthinnen, hvor sykdommer som fører til fotoreceptordegenerasjon forekommer.
Introduction
Arvelige retinale sykdommer og aldersrelatert makuladegenerasjon fører til fotoreceptorcelletap og eventuell blindhet. Retinal fotoreceptor er det ytre segmentlaget av netthinnen som består av spesialiserte celler som er ansvarlige for fototransduksjon (dvs. konvertering av lys til nevronsignaler). Stav- og kjeglefotoreseptorcellene ligger ved siden av retinalpigmentlaget (RPE)1. Fotoreceptorcelleutskiftningsterapi for å kompensere celletapet har vært en fremvoksende og utviklende terapeutisk tilnærming. Embryonale stamceller (ESC)2,3,4, induserte pluripotente stamceller (iPSCs)-avledede RPE-celler og retinale stamceller (RPCer)4,5,6,7,8 ble brukt til å gjenopprette de skadede fotoreseptorcellene. Sub-retinal plass, et begrenset rom mellom retina og RPE, er et attraktivt sted å deponere disse cellene for å erstatte skadede fotoreceptorceller, RPE og Mueller-celler på grunn av sin nærhet 9,10,11.
Gen- og celleterapier har utnyttet det sub-retinale rommet for regenerativ medisin for ulike retinale sykdommer i prekliniske studier. Dette inkluderer levering av funksjonelle kopier av genet eller genredigeringsverktøyene i form av enten anti-sense oligonukleotidterapi12,13 eller CRISPR/Cas9 eller baseredigering via adenoassosiert virus (AAV) basert strategi 14,15,16, implantasjon av materialer (f.eks. RPE-ark, retinalprotetikk 17,18,19) og differensierte stamcelleavledede retinale organoider 20,21,22 for å behandle retinale og RPE-relaterte sykdommer. Kliniske studier ved bruk av hESC-RPE31 i subretinalrommet for å behandle RPE65-assosiert Leber medfødt amaurose (LCA)23,24, CNGA3-bundet achromatopsia25, MERTK-assosiert retinitis pigmentosa26, koroideremi 27,28,29,30 har vist seg å være en effektiv tilnærming. Direkte injeksjon av celler i nærheten av det skadede området forbedrer sjansen for celleoppgjør i riktig region, synaptisk integrasjon og eventuell visuell forbedring.
Selv om sub-retinal injeksjon i humane og storøyde modeller (dvs. gris 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 og ikke-menneskelig primat 41,42,43) er etablert, er slik injeksjon i murinmodellen fortsatt utfordrende på grunn av begrensningen av øyebollstørrelsen og enorm linse som opptar museøyet 44,45,46. Imidlertid er genetisk modifiserte modeller bare lett tilgjengelige hos små dyr og ikke hos store dyr (dvs. kaniner og ikke-menneskelige primater), derfor trekker subretinal injeksjon hos mus oppmerksomhet for å undersøke nye terapeutiske tilnærminger i retinale genetiske lidelser. Tre hovedtilnærminger brukes til å levere celler eller AAVer inn i subretinalrommet, nemlig transhornhinnen, transskleral rute og pars plana-ruten (se figur 2). Trans-hornhinne og transsklerale ruter er assosiert med kataraktdannelse, synechiae, choroidal blødning og refluks fra injeksjonsstedet 11,44,45,47,48,49. Vi vedtok pars plana-tilnærmingen som en direkte visualisering av injeksjonsprosessen, og injeksjonsstedet kan oppnås i sanntid under mikroskopet.
Vi har nylig beskrevet en metode som kan skille humane embryonale stamceller (hESCs) til fotoreceptorprogenitorer under xenofrie, kjemisk definerte forhold ved bruk av rekombinant humant retina-spesifikt lamininisoform LN523. Siden LN523 ble funnet å være tilstede i netthinnen, antydet vi at den ekstracellulære matriksnisjen i den humane netthinnen kunne rekapituleres in vitro og dermed støtte fotoreseptordifferensiering fra hESCs36. Enkeltcelle transkriptomisk analyse viste at fotoreceptorprogenitorer som samtidig uttrykker kjeglestavhomøoboks og recoverin ble generert etter 32 dager. En retinal degenerasjon 10 (rd10) mutant musemodell som etterligner autosomal human retinitis pigmentosa ble brukt til å evaluere effekten av dagens 32 hESC-avledede fotoreceptorprogenitorer in vivo. De hESC-avledede fotoreceptorprogenitorcellene ble injisert i subretinalrommet til rd10-mus ved P20, hvor fotoceptordysfunksjon og degenerasjon pågår36. Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av postkryopreserverte hESC-avledede fotoreceptorprogenitorer og levering i sub-retinalrommet til rd10-mus . Denne metoden kan også brukes til å administrere AAV, cellesuspensjoner, peptider eller kjemikalier inn i subretinalrommet hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-eksperimentene ble gjort i samsvar med retningslinjene og protokollen godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) og Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. Valpene ble immunsupprimert fra P17 (pretransplantasjon) til P30 (etter transplantasjon) ved å gi dem drikkevann som inneholdt ciklosporin (260 g/L).
1. Tilberedning av dag 32 hESC-avledede fotoreseptorprogenitorer etter kryopreservering
- Forvarmende fotoreseptordifferensieringsmedium (PRDM) i et vannbad på 37 °C.
- Hent en kryovial som inneholder dag 32 hESC-avledede fotoreceptor stamceller fra flytende nitrogen. Hold på tørris.
- Tine kryovialet ved 37 °C i vannbad i 3-5 minutter. Resuspender dagen 32 celler i 1 ml PRDM og sentrifuge ved 130 x g i 4 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml PRDM.
- Fjern 10 μL av blandingen for celletelling. Bland celler med 0,2% trypan blå i henhold til produsentens instruksjoner. Pipettecelleblanding inn i celletellekammerets lysbilde. Bestem cellenummer og levedyktighet ved hjelp av automatisert celleteller.
- Fortsett til neste trinn når cellens levedyktighet er over 70%. Sentrifuger den gjenværende cellesuspensjonen ved 130 x g i 4 minutter. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i PRDM i konsentrasjonen 3 x 105 celler/μL for transplantasjon.
- Vær oppmerksom på synlige celleklumper. Resuspender celleklumper gjentatte ganger ved hjelp av en 10 μL pipettespiss i mikrofugerøret til ingen synlig celleklump observeres. Legg den i 33G injeksjonssprøyten for å observere om celleoppløsningen ekstruderes gjennom kanylen.
2. Sub-retinal levering av hESCs i rd10 mus
- Forberedelse av dyrene
- Bedøv musen (P20, hann/kvinne, 3-6 g) ved hjelp av en kombinasjon av ketamin (20 mg/kg kroppsvekt) og xylazin (2 mg/kg kroppsvekt) i en 1 ml tuberkulinsprøyte festet til en 27G nål ved intraperitoneal tilnærming. Administrer en subkutan injeksjon av buprenorfin (0,05 mg/kg) til mus som et forebyggende analgetikum.
- Etter administrering av anestesi, innpode en dråpe hver av 1% tropicamide og 2,5% fenylefrin for elev dilatasjon. Påfør en oftalmisk gel på hornhinnen for å forhindre at øyet tørker og anestesirelatert grå stær.
- Plasser musen i et tomt bur til den er fullstendig bedøvet. Vurder riktig bedøvelsesnivå ved å klemme poteputen og bekreft om dyret ikke reagerer på den harde klemmen.
- Når musen er fullstendig bedøvet, plasser dyret på en varm pute satt til 38 °C.
- Sub-retinal levering av cellene
- For å bruke en 1-port transvitreal pars plana-tilnærming, som gjort her, utfør sub-retinal injeksjon i et sterilt miljø. Bruk et oppreist operasjonsmikroskop med en direkte lysbane for å utføre injeksjonen.
- Klargjør 10 μL glasssprøyten ved å fjerne kanylenavet. Monter den butte kanylen på 33G på glasssprøyten. Ta metallnavdekselet og fest kanylen forsiktig på sprøyten.
- Skyll med destillert vann for å se etter tegn på lekkasje og patency av nålen. Tøm sprøyten og legg den forsiktig til siden.
- Plasser den bedøvede musen på en pute, med behandlingsøyet som ser rett opp til mikroskopets mål. Påfør 0,5% proparakainhydroklorid og vent i 30 s. Påfør 150 μL oftalmisk gel på øyet og legg et rundt deksel på den.
- Utfør en grov undersøkelse av øyet ved å observere hornhinnen, iris, elev, linse og bindehinne. Gjennom eleven, visualiser fundus av museøyet ved å justere fokalplanet. Juster hodet til det optiske hodet er plassert i midten av eleven og minimer bevegelsen av hodet ved riktig plassering på puten.
- Bank forsiktig på bunnen av røret med hESCs flere ganger for å få en jevn celleoppheng. Ved å bruke 10 μL mikrolitersprøyten med en 33G butt nål, trekk opp 2 μL celler/medier. Trekk ut cellene rett før injeksjonen for å unngå celleoppgjør/klumping i sprøyten.
- Bruk en 30G engangsnål, lage en sklerektomi sår 2 mm bak limbus. Hold nålens vinkel på ~ 45 ° for å unngå å berøre linsen. Når spissen av nålen er visualisert i øyet, trekk forsiktig ut nålen. Kast kanylen i den skarpe beholderen etter bruk for å unngå stikkskade.
- Ta glasssprøyten og stikk den stumpe nålen inn i sklerektomi såret. Uten å berøre linsen, før den butte nålen til den når motsatt netthinne i inngangssåret. Sørg for at injeksjonsområdet er fritt for store retinale blodkar for å unngå blødning.
- Penetrer forsiktig netthinnen til en trykkgren på sclera er sett. Hold den stumpe enden av nålen parallell med scleraen for å unngå lekkasje av cellene inn i glasslegemet.
- Injiser langsomt 2 mikrol cellesuspensjon eller PRDM-medier (kontroll) inn i subretinalrommet mens det opprettholdes forsiktig trykk på sprøyten. Ved en vellykket injeksjon skal det dannes en synlig bleb (dvs. hevet netthinne med cellesuspensjonen/mediet i) på injeksjonsstedet.
MERK: Kun lett trykk skal brukes under injeksjonen for å unngå at netthinnen revner og blokkerer cellene på nålespissen. - Etter å ha bekreftet bleb, vent i 10 s for å la cellene slå seg ned. Trekk kanylen forsiktig ut av øyet.
- Intraoperativ optisk koherenstomografi (OCT) skanning av bleb (valgfritt)
- Plasser museøyet for å visualisere bleb under mikroskopet ved å bevege hodet sakte. Sikre posisjonen ved å holde hodet forsiktig. Ingen ekstra elevutvidelse er nødvendig. Ikke fjern dekselet og gelen på øyet. Det gir et klart optisk medium for å visualisere bleb.
- Utfør intraoperativ OCT ved hjelp av den innebygde iOCT-funksjonen i operasjonsmikroskopet.
- Trykk på Kube-alternativet på OCT-skjermen og plasser skanneområdet på bleben ved å trykke på pilknappene . Juster OCT ved å skyve Sentrering og Fokus for best mulig OCT-kvalitet. Trykk på Capture / Scan for å skaffe OCT-skanningen av bleb-området. Se gjennom bildene for å sjekke kvaliteten på skanningene.
- Bedring
- Fjern dekselet og rengjør gelen fra øyet med gasbind. Påfør antibiotisk salve en gang etter injeksjonen for å forhindre infeksjon.
- La dyret komme seg fra anestesi under et varmt lys til de gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency og gå tilbake til hjemmeburet. Overvåk dyret i minst 3 dager etter injeksjon for tegn på betennelse, infeksjon og nød.
MERK: Det 150 W varme lyset skal være minst 30 cm fra dyreburet, og forsiktighet bør utvises for å unngå brannskader. - Administrer en subkutan injeksjon av buprenorfin (0,05 mg/kg) 8 timer i 1 dag eller etter veterinærens anbefaling. Hvis betennelse eller infeksjon i øyet observeres, kontakt en veterinær for passende behandling.
- Rengjøring og sterilisering av instrumentene
- Skyll 10 μL mikrolitersprøyten med glass og den butte nålen på 33 G med 100 % etanol 10x. Vask bort etanolen ved å blinke sprøyten med destillert vann.
- Demonter glasssprøyten og kanylen. Tørk sprøyten for oppbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 μL glasssprøyten ble montert i henhold til produsentens instruksjoner (figur 1), og den butte nålen som ble brukt til å tilføre cellesuspensjonen/mediet er vist i figur 1B. Ulike tilnærminger til subretinal injeksjon er illustrert i figur 2. Vi beskriver pars plana-tilnærmingen i denne protokollen (figur 2C). Den stumpe nålen montert på en glasssprøyte ble satt inn gjennom et sklerotomi sår og fikk tilgang til sub-retinal plass over hele kloden. Som vist i figur 3A ble nålens bane, penetrasjon gjennom netthinnen og levering av cellene overvåket direkte under mikroskopet ved injeksjon. Vellykket tilførsel av cellene/mediet ble bekreftet ved å observere en bleb på injeksjonsstedet (figur 3B). En vellykket bleb kan identifiseres som en lys hvitaktig farge som ligner en vannballong. En mislykket tilførsel observeres ved lekkasje av cellene/mediet inn i glasslegemet på injeksjonsstedet og manglende dannelse av bleb. OCT-undersøkelsen ble utført på det injiserte området, og skanningen viste flytende individualiserte hESC i det cellebehandlede øyet (figur 4A), mens det mediebehandlede øyet viste klar væske uten celler i subretinalrommet (figur 4B). De individualiserte hESCene er identifisert som hyperrefleksmaterialer fordelt i subretinalrommet (figur 4A). Suksessraten for injeksjonen ble beregnet ved å merke antall øyne med vellykket dannelse av bleben. Vi inkluderte applikasjonene som tok i bruk denne tilnærmingen i laboratoriet vårt og suksessraten for injeksjonene (tabell 1).
Figur 1: Instrumenter brukt under injeksjonen. (A) 10 μL glasssprøyten er montert med en 33G butt nål. (B) Zoom inn bilde av 33G butt nål. (C) Pute for dyrets hode å hvile på. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ulike injeksjonsveier under netthinne. (A) Transkorneal rute: Injeksjonsnålen passerer gjennom hornhinnen og eleven for å komme inn i sub-retinalrommet. (B) Transskleral rute: Sub-retinalrommet er direkte tilgjengelig gjennom sclera. (C) Pars plana rute: Injeksjonsnålen føres inn i glasslegemet via et snitt ved limbus. Nålen når sub-retinalrommet ved å trenge inn i netthinnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Fundusbilder av øyet under subretinal injeksjon. (A) Før subretinal injeksjon ble utført, kunne spissen av nålen sees i glasslegemet som berører netthinnen, og unngår de store retinale blodkarene. (B) Etter subretinal injeksjon ble det dannet en synlig bleb på injeksjonsstedet (gul stiplet linje). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Intraoperativ OCT-skanning av de injiserte øynene. Skanningene ble gjort umiddelbart etter injeksjonen. (A) hESCs behandlede øye: topppanelet viste plasseringen av OCT-skanningen (cyan og rosa tverrsnittslinjer) på øyet; hESC ble observert i det behandlede øyet i subretinalrommet (gul stiplet linje, midtre og nedre paneler). (B) Mediebehandlet øye: topppanelet viste plasseringen av OCT-skanningen (cyan og rosa tverrsnittslinjer) på øyet; Klar væske uten celler ble observert i subretinalrommet i det medieinjiserte øyet (gul stiplet linje, midtre og nedre paneler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Programmer | Mottaker belastning | Suksess rate |
| AAV | Rpe65rd12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6 | 95% |
| hESC-avledede stamceller | Rd10-/- | 95% |
Tabell 1: Suksessraten for subretinal injeksjon i forskjellige applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den sub-retinale injeksjonen har blitt brukt til cellesuspensjonstransplantasjon for å behandle RPE og retinale sykdommer 23,25,26,27,28,31,40. Denne tilnærmingen er svært viktig i gnagerstudier, ikke bare for celletransplantasjon og genterapitilnærminger, men også for å evaluere nye terapeutiske forbindelser for retinale sykdommer. For tiden brukes tre hovedruter til å levere celler eller AAV-er inn i sub-retinalrommet, dvs. trans-hornhinnevei, transsklerale og pars plana-ruter.
I trans-hornhinnen tilnærming passerer injeksjonsnålen gjennom hornhinnen, eleven og til slutt netthinnen for å levere cellene inn i sub-retinalrommet og danne en vellykket bleb. Fordelen med trans-hornhinnen tilnærming er evnen til å skape en komplett retinal detachment i mottakeren47. Det kan levere et større antall celler; Imidlertid er longitudinell observasjon for å studere strukturell konformasjon og celleintegrasjon utfordrende i denne tilnærmingen. I tillegg inkluderer komplikasjoner kataraktdannelse, synechiae og hornhinneopasitet, noe som gjør de langsgående observasjonene utfordrende 11,45,47,48. Alternativt brukes den transsklerale tilnærmingen også til å levere AAV til sub-retinalrommet44,49. Denne tilnærmingen er nyttig for nyfødte mus og anses som tryggere, da det ikke er nødvendig for nålen å gå gjennom okulære medier. Choroidal blødning, refluks av oppløsningen fra injeksjonsstedet, perforering av netthinnen og lekkasje til glasslegemet bør imidlertid ikke ignoreres.
Vi adopterte pars plana-tilnærmingen for å introdusere de hESC-avledede fotoreceptorprogenitorene i sub-retinalrommet ved hjelp av en 33G stump nål. I denne tilnærmingen ble injeksjonsnålen ført inn via snittet i limbusområdet. Nålen ble deretter ført gjennom glasslegemet og til slutt fikk tilgang til sub-retinalrommet gjennom netthinnen. Celleklumper ble ofte observert og kan blokkere levering av celler ved bruk av uegnede nålestørrelser. Resuspensjon av celler i mikrofugerøret bør utføres flittig ved hjelp av en 10 mikrol pipettespiss før den legges i injeksjonssprøyten. Vi forsøkte først å bruke en 34G nål, hvor blokkering av nålen av cellene ofte ble observert. En passende størrelse på nålen bør testes for spesifikke celletyper, spesielt smalbore nåler har en tendens til å gi mindre levedyktige celler når de injiseres50. En av fordelene med denne tilnærmingen er direkte visualisering under injeksjon, slik at kirurgen kan overvåke og nøye velge det spesifikke stedet for cellelevering. Injeksjonsområdet og kanylen skal være godt synlig under prosedyren. Anestesi-indusert katarakt og hornhinneopasitet kan i stor grad påvirke riktig levering av celler til et bestemt sted.
Under injeksjonen skal nålen trenge vinkelrett inn i netthinnen, og den butte enden av nålen skal være parallell med sklera for å minimere lekkasje av de injiserte cellene inn i glasslegemet (figur 3). Sprøyten skal kun trykkes forsiktig på når injeksjonen utføres. Et sterkt trykk kan føre til retina tårer, blødning, lekkasje av cellene inn i choroidalrommet, svikt i cellene til å passere gjennom nålen og punktering av øyebollet. Det optimale trykket kan sikres når nålespissen nettopp har passert gjennom netthinnen, og en liten hvit trykkprikk ses på nålespissen. Etter injeksjonen skal nålen trekkes sakte og forsiktig tilbake fra injeksjonsstedet for å forhindre lekkasje av injiserte celler inn i glasslegemet.
Begrensningen i denne tilnærmingen er den utfordrende læringskurven. En studie viste at en utdannet øyelege trengte å utføre 364 injeksjoner hos mus for å oppnå en suksessrate på 95%, mens mindre erfarne praktikanter med kirurgisk erfaring ble forventet å kreve et høyere antall treninger46. Komplikasjoner av denne tilnærmingen inkluderer nålspor i netthinnen, tilbakestrømning av celler inn i glasslegemet, blødning fra choroid / retina og iatrogen katarakt. Imidlertid, med tilstrekkelig trening, er disse komplikasjonene betydelig mindre observert46.
Avslutningsvis kan vår metode levere de hESC-avledede fotoreceptorprogenitorene inn i sub-retinalrommet til rd10-mus , som tydeligvis vist ved OCT-skanningene. Denne tilnærmingen kan vedtas for å utforske nye terapeutiske forbindelser, forskjellig celletypetransplantasjon og genterapi for behandling av ytre retina og RPE-relaterte sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay er en av grunnleggerne av Alder Therapeutics AB. Andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee og Yingying Chung for å gi teknisk assistanse til forberedelsen av dagen 32 hESC-avledede fotoreceptorprogenitorer etter kryopreservering. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC / OFYIRG / 0042/2017) og National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) til HGT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
